馬秋月，李倩中，李淑順，朱 璐，顏坤元，李淑嫻，張 斌，聞 婧*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院休閑農(nóng)業(yè)研究所，江蘇 南京 210014；2.南京林業(yè)大學(xué)，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

元寶楓(AcertruncatumBunge)為槭屬(Acer)落葉小喬木，樹(shù)高8～13 m，主要分布于我國(guó)的黃河流域，以及東北、內(nèi)蒙古、江蘇、安徽等地區(qū)[1]，為我國(guó)園林綠化的主要樹(shù)種之一。元寶楓還是一種多用途的木本油料樹(shù)種，種仁中含油脂約48%、蛋白質(zhì)25%～27%，種皮含單寧可達(dá)60%，葉中還含有黃酮、綠原酸、強(qiáng)心苷等多種活性物質(zhì)[2-3]；其油脂的脂肪酸組成中含有5%～6%的神經(jīng)酸，神經(jīng)酸是世界公認(rèn)的能修復(fù)、疏通受損大腦神經(jīng)纖維并促使神經(jīng)細(xì)胞再生的有效物質(zhì)，幫助治療腦中風(fēng)后遺癥、腦萎縮、老年癡呆癥等世界性疾病的潛力巨大[4-7]。元寶楓油于2011年被中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源食品，2017年被國(guó)家林業(yè)和草原局確定為珍貴木本油料樹(shù)種，江蘇省將其列入珍貴彩色樹(shù)種名錄。因此，開(kāi)展集觀賞及藥食同源于一體的元寶楓優(yōu)良種質(zhì)的規(guī)?；缂夹g(shù)研究意義重大。目前，元寶楓常規(guī)生產(chǎn)主要以播種或嫁接方式繁殖為主，關(guān)于元寶楓繁育技術(shù)的研究相對(duì)較少。于震宇[8]曾進(jìn)行了元寶楓的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)；李艷菊等[9]于2005年在元寶楓的組培快繁方面取得了一定進(jìn)展，但有關(guān)組培成苗的報(bào)道鮮見(jiàn)。以往常規(guī)的播種或嫁接繁殖過(guò)程發(fā)現(xiàn)，種苗質(zhì)量受繁殖材料的影響會(huì)出現(xiàn)品質(zhì)退化或病蟲(chóng)害積累等問(wèn)題，種苗繁殖受季節(jié)影響很大，優(yōu)良遺傳性狀難以保持穩(wěn)定，導(dǎo)致良種推廣種植受到極大限制。實(shí)踐表明，對(duì)于重要樹(shù)種，利用組培快繁技術(shù)能在短期內(nèi)快速成苗[10]。為此，以元寶楓1年生莖段為試驗(yàn)材料，通過(guò)對(duì)外植體采集時(shí)間、外植體的消毒時(shí)間、腋芽誘導(dǎo)和生根培養(yǎng)基的配方篩選及優(yōu)化，建立元寶楓離體培養(yǎng)成苗快速繁殖體系，以期為元寶楓優(yōu)良種質(zhì)的栽培規(guī)模化及產(chǎn)業(yè)化提供科學(xué)依據(jù)及技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源及外植體處理

選擇不同時(shí)期(5、7和9月)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的元寶楓優(yōu)良植株(大田和溫室盆栽)，以當(dāng)年生枝條為供試材料，植株來(lái)自南京市溧水區(qū)江蘇省槭樹(shù)良種基地和江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院溫室盆栽，外植體為帶芽莖段。

處理方法：將外植體切割成2～3 cm的帶芽莖段，用0.05%的洗衣粉溶液清洗表面2 min，再用無(wú)菌水清洗至洗衣粉溶液洗脫干凈。在超凈工作臺(tái)上，按照體積分?jǐn)?shù)75%乙醇(處理時(shí)間10、20、30 s)和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的HgCl2(處理時(shí)間120、180、240 s)不同組合的混合處理進(jìn)行充分振蕩滅菌，每個(gè)組合經(jīng)處理后均用無(wú)菌水清洗5次，并置于無(wú)菌紙上，吸干表面水分，將完成滅菌的外植體接種于腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。所有的培養(yǎng)基pH均為5.8，培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃，光照度為2 000 lx，每天光照12 h。

1.2 元寶楓莖段腋芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)

選取經(jīng)過(guò)滅菌處理后長(zhǎng)勢(shì)一致的莖段接種到腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以1/2 MS、MS、1/2 NN69、NN69(購(gòu)自北京酷來(lái)搏科技有限公司)為基本培養(yǎng)基，分別添加不同質(zhì)量濃度的IBA(0、0.2和0.4 mg/L)和30 g/L蔗糖的固體培養(yǎng)基中，共12個(gè)處理組合，每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，重復(fù)3次，10 d后觀察并統(tǒng)計(jì)外植體的出芽率和污染率。其中：污染率=(污染的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%，死亡率=(死亡的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%，成活率=(移栽成活的株數(shù)/移栽的總株數(shù))×100%，出芽率=(出芽的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%。

1.3 有效苗培育和生根培養(yǎng)

當(dāng)腋芽誘導(dǎo)后獲得的無(wú)菌芽苗約0.5 cm時(shí)，將其切下轉(zhuǎn)入生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以1/2 MS、MS、1/2 NN69、NN69為基本培養(yǎng)基，在每種基本培養(yǎng)基中分別添加不同質(zhì)量濃度的IBA(0.2、0.4和0.6 mg/L)和15 g/L的蔗糖，每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，重復(fù)3次，共12個(gè)處理組合。于25 d后觀察記錄結(jié)果，并統(tǒng)計(jì)生根率、根數(shù)及根系生長(zhǎng)狀況(分為長(zhǎng)勢(shì)最好、長(zhǎng)勢(shì)一般、長(zhǎng)勢(shì)稍差)。

1.4 煉苗及移栽

打開(kāi)已生根且生長(zhǎng)健壯的元寶楓苗組培瓶封口膜，在培養(yǎng)室中進(jìn)行環(huán)境適應(yīng)性鍛煉7 d后，將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，用清水將培養(yǎng)基沖洗干凈，移栽至苗缽中，其中基質(zhì)泥炭土、珍珠巖、蛭石體積比為7∶2∶1，且基質(zhì)在移栽1周前用20%的多菌靈溶液消毒，移栽后進(jìn)行常規(guī)管理。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)在Excel 2020中整理，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行One-way ANOVA分析，利用LSD進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理方法對(duì)外植體滅菌效果的影響

不同處理和不同消毒時(shí)間對(duì)元寶楓外植體的污染和死亡造成了明顯的影響(表1)。其中處理1的污染率顯著高于其他處理(P<0.01)，成活率只有4.1%；隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率逐漸降低，成活率有所提高。從污染率來(lái)看，本研究中經(jīng)過(guò)75%乙醇滅菌30 s+0.1%HgCl2滅菌240 s(處理9)的效果最佳，成活率為61.9%。同時(shí)可以看出，隨著HgCl2滅菌時(shí)間的增加，元寶楓外植體的成活率反而降低，說(shuō)明過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的HgCl2處理會(huì)對(duì)植物組織產(chǎn)生一定的毒害作用，從而影響其正常生長(zhǎng)，甚至?xí)?dǎo)致死亡。因此綜合考慮外植體的污染率和成活率，外植體的最適消毒時(shí)間為：75%乙醇滅菌30 s+0.1%HgCl2滅菌180 s。

表1 不同處理對(duì)外植體滅菌效果的影響Table 1 Effects of different disinfection methods on explants

為進(jìn)一步研究不同時(shí)期及不同立地環(huán)境采集外植體對(duì)滅菌效果的影響，在不同季節(jié)(5、7和9月)以及不同立地環(huán)境(大田植株和溫室盆栽苗)采集外植體，經(jīng)過(guò)75%乙醇滅菌30 s及0.1%HgCl2滅菌180 s后比較不同處理間的污染率情況，結(jié)果(表2)顯示：5月采集的外植體污染率最低，且大田植株和溫室盆栽苗外植體污染率差異不大；7月的大田污染率要略高于溫室盆栽外植體；9月大田植株的外植體與室內(nèi)盆栽污染率差異極其顯著，室外大田污染率高達(dá)94.4%，而室內(nèi)盆栽為31.1%，說(shuō)明7月份以后更適合在室內(nèi)采集元寶楓外植體。

表2 不同時(shí)期采集外植體對(duì)污染率的影響Table 2 Effects of pollution rate of explants collected in different periods

2.2 基本培養(yǎng)基和外源激素對(duì)腋芽誘導(dǎo)的影響

以1/2 MS、MS、1/2 NN69、NN69為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的IBA對(duì)元寶楓腋芽或頂芽的誘導(dǎo)有顯著影響(表3、圖1)。

表3 不同培養(yǎng)基和外源激素對(duì)腋芽誘導(dǎo)的影響Table 3 Effects of different culture mediums and exogenous hormones on cluster bud

A.元寶楓莖段stem segment of A.truncatum；B.腋芽的誘導(dǎo)induce axillary buds；C1-C2.生根的組培苗rooting of tissue culture seedling；D.移栽成活的組培苗tissue culture seedlings were transplanted。圖1 元寶楓腋芽的誘導(dǎo)與生根Fig.1 Axillary buds and root induction of Acer truncatum

由表3可見(jiàn)，添加0.2 mg/L IBA和0.4 mg/L IBA處理的芽誘導(dǎo)率較高，均在85%以上，且不定芽生長(zhǎng)良好，15 d后就可看到翠綠葉片(圖1B)，但是不同的基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)腋芽出芽及展葉時(shí)間差別較大，其中處理8培養(yǎng)基的效果最佳。大部分處理組合培養(yǎng)結(jié)果顯示，當(dāng)IBA質(zhì)量濃度為0.2 mg/L時(shí)，其誘導(dǎo)率高于未添加激素和0.4 mg/L的處理；誘導(dǎo)率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，說(shuō)明添加過(guò)高濃度的IBA對(duì)元寶楓誘導(dǎo)芽起到抑制作用。比較12個(gè)處理可知，誘導(dǎo)元寶楓外植體產(chǎn)生腋芽的最佳培養(yǎng)基為：NN69+IBA(0.2 mg/L)。

2.3 不同基本培養(yǎng)基和外源激素IBA對(duì)元寶楓誘導(dǎo)生根的影響

將1～2 cm生長(zhǎng)健壯的腋芽轉(zhuǎn)入生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d左右，在莖段基部接觸培養(yǎng)基處有根基凸起，形成根原基；15 d左右出現(xiàn)不定根，培養(yǎng)30 d后形成完整根系(圖1C1、1C2)。盡管每種處理的培養(yǎng)基均能不同程度地誘導(dǎo)元寶楓生根(表4)，但是當(dāng)IBA的質(zhì)量濃度為0.2～0.4 mg/L時(shí)，生根率隨著濃度的增加而增加，而質(zhì)量濃度在0.4～0.6 mg/L時(shí)，生根率反而下降。通過(guò)不同基本培養(yǎng)基和不同濃度激素處理下對(duì)元寶楓組培苗生根效果進(jìn)行顯著性分析表明：以1/2 NN69為基本培養(yǎng)基、IBA質(zhì)量濃度為0.4 mg/L時(shí)生根率最高，可達(dá)87.8%，且根系生長(zhǎng)發(fā)達(dá)，平均根數(shù)也最多。因此基于生根率、生根數(shù)以及根系生長(zhǎng)狀況綜合分析認(rèn)為，1/2 NN69+ IBA(0.4 mg/L)是誘導(dǎo)元寶楓生根的最適宜配方組合。

表4 不同培養(yǎng)基和外源激素對(duì)生根的影響Table 4 The effects of different culture mediums and hormones on rooting

2.4 元寶楓組培苗的煉苗與移栽

將經(jīng)過(guò)7 d煉苗后生長(zhǎng)健壯的組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，用無(wú)菌水清洗根部培養(yǎng)基后移入泥炭、珍珠巖、蛭石體積比為7∶2∶1的基質(zhì)(經(jīng)過(guò)20%的多菌靈溶液消毒)中進(jìn)行移栽，保持中等濕度，苗長(zhǎng)成活率達(dá)95.0%以上。

3 討 論

3.1 元寶楓外植體取材時(shí)間及方式

外植體的表面滅菌是組織培養(yǎng)中至關(guān)重要的一步[11]，且不同植物不同部位的外植體對(duì)消毒劑的敏感程度也不同。關(guān)于元寶楓的組織培養(yǎng)技術(shù)，李艷菊等[9]以不同樹(shù)齡和不同季節(jié)的元寶楓大田苗外植體為材料進(jìn)行組培，發(fā)現(xiàn)外植體對(duì)組培苗的污染率和存活率會(huì)產(chǎn)生很大影響。本研究除采集室外大田材料，同時(shí)以溫室盆栽材料為對(duì)照，比較不同的外植體滅菌處理方式對(duì)不同時(shí)期、不同采集地點(diǎn)元寶楓組織培養(yǎng)過(guò)程污染率及成活率的影響，研究發(fā)現(xiàn)HgCl2滅菌的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都會(huì)影響元寶楓的成活率，這與高盆櫻桃(Cerasuscerasoides)[12]、牛樟(Cinnamomumkanehirae)[13]、狹葉黃芩(Scutellariaregeliana)[14]等材料組培效果相近。但本研究中發(fā)現(xiàn)9月左右在室外大田采集外植體，元寶楓組培污染率極高，這可能與室外高溫潮濕、雜菌和灰塵較多，容易通過(guò)皮孔或傷口進(jìn)入植物體內(nèi)部，造成內(nèi)生菌寄生有關(guān)[13,15-16]，但該時(shí)期室內(nèi)采集的效果較好，污染率較低。

3.2 基本培養(yǎng)基及外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑IBA對(duì)元寶楓組織培養(yǎng)的影響

不同植物由于遺傳背景及生物學(xué)特性有一定的差異，因此對(duì)基本培養(yǎng)基各類營(yíng)養(yǎng)成分的需求也有很大差別，同時(shí)外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的合理配比對(duì)不定芽的誘導(dǎo)以及增殖、生根等尤為重要[17]。已有研究發(fā)現(xiàn)槭樹(shù)科內(nèi)不同的種之間差異較大，如：李艷敏等[18]發(fā)現(xiàn)WPM基本培養(yǎng)基與IBA組合，更適宜金葉復(fù)葉槭(Acernegundo‘Aurea’)的增殖與生根生長(zhǎng)；李巖巖[19]發(fā)現(xiàn)在1/2 MS基本培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L的IBA對(duì)茶條槭(Acerginnalum)的生根有很好的效果；顧地周等[20]在MS培養(yǎng)基中添加KT和IBA外源激素對(duì)誘導(dǎo)生根效果明顯；而李艷菊等[9]的研究結(jié)果顯示，在MS培養(yǎng)基中添加適宜濃度的TDZ和IBA可有效促進(jìn)元寶楓外植體的增殖和生長(zhǎng)。

IBA是組培苗不定芽和根的誘導(dǎo)中常用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[21-22]，本研究以1/2 MS、1/2 NN69、MS和NN69為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的IBA對(duì)元寶楓進(jìn)行腋芽和生根誘導(dǎo)培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種培養(yǎng)基配合不同濃度IBA均可誘導(dǎo)腋芽生長(zhǎng)，但誘導(dǎo)時(shí)間差異較大，其中以NN69中添加0.2 mg/L IBA誘導(dǎo)率最高，時(shí)間最短。同樣，組培苗的生根能力強(qiáng)弱及根系的生長(zhǎng)狀況也直接影響植株的移栽成活率[14]。本研究表明，在1/2 NN69的基本培養(yǎng)基中添加0.4 mg/L的IBA時(shí)外植體生根效果最好，生根率可達(dá)87.8%，且根系健壯，移栽成活率可達(dá)95.0%；但I(xiàn)BA濃度過(guò)高或過(guò)低均未較好地促進(jìn)根的誘導(dǎo)，類似現(xiàn)象在其他植物組織培養(yǎng)中也常見(jiàn)[12-14,23-24]。

目前，元寶楓的種苗繁育主要以播種、扦插或嫁接技術(shù)繁殖為主，但存在受季節(jié)影響或優(yōu)良特性難以穩(wěn)定保存的問(wèn)題。本研究以元寶楓莖段為外植體，篩選適宜元寶楓不定芽及生根的最優(yōu)培養(yǎng)基，建立了一套從元寶楓無(wú)菌外植體、腋芽誘導(dǎo)和生根誘導(dǎo)及煉苗移栽的元寶楓組培快繁體系，為短時(shí)間內(nèi)繁育大量元寶楓優(yōu)良株系以及推廣應(yīng)用提供了重要技術(shù)支撐和理論保障，也可為后期元寶楓再生遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立提供技術(shù)參考。