姜睿姣，蔣子睿，王 印 ，姚學萍，楊澤曉，羅 燕

(1.四川農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，四川 成都 611130；2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種具有高度傳播性的消化系統(tǒng)疾病，臨床上主要表現(xiàn)有急性腸炎、嘔吐和水樣腹瀉等癥狀[1]。該病可感染各年齡的豬，秋冬季節(jié)為疾病的高發(fā)期[2-3]，常引起仔豬高病死率[4]。臨床上，PEDV 可與豬輪狀病毒(Porcine rotavirus，PRV)、豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)等其他病毒混合感染[5]，流行范圍極廣。豬在潛伏期與發(fā)病期排泄的糞便、乳汁中都攜帶大量病毒，對周圍環(huán)境造成嚴重污染，給各國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[6-8]。

S基因是PEDV 主要的抗原決定基因，由4 152 nt 構成。編碼形成的S 蛋白屬于Ⅰ型糖蛋白，由1 383 個氨基酸組成[9][S1 區(qū)(1～789 aa)和S2 區(qū)(790～1 383 aa)]，是PEDV 主要致病蛋白。具有促進病毒膜融合、與細胞受體互作、信號傳導、固定支撐、誘導自然宿主產(chǎn)生中和抗體等作用[10-11]。S1 區(qū)含多個抗原表位和受體結合域，是S 蛋白主要的功能區(qū)；S2 區(qū)為跨膜區(qū)域，該區(qū)域促進病毒與宿主細胞膜融合且相對較保守，影響了病毒的侵染能力[12]。本研究前期已對PEDV 分離株做了全基因組測序(GenBank 登錄號：MK 702008)，發(fā)現(xiàn)S1 區(qū)堿基發(fā)生了多次插入與缺失，這可能會大大影響與受體結合的效率。通過對S 蛋白進行分析，截取S 蛋白抗原決定簇和免疫優(yōu)勢區(qū)2 個抗原性較高的片段進行蛋白表達，并以之為包被抗原，建立特異性強、重復性高、結果準確的間接ELISA 抗體檢測方法，成功解決了抗原制備的問題同時豐富了PEDV 診斷方法。

1 材料與方法

1.1 毒株、質粒及血清

PEDV 毒株、克隆載體pMD-19T (simple)、表達載體pET-32a (+)、大腸桿菌DH5α 和BL21(DE3)均由四川農業(yè)大學動檢實驗室保存；豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬細小病毒(PPV)、豬圓環(huán)病毒(PCV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病毒(PRV)和PEDV 陽性血清均由四川農業(yè)大學動檢實驗室保存。

1.2 主要試劑

質粒提取試劑盒Plasmid Mini Kit 購自Omega公司；DNA Marker、反轉錄試劑盒、蛋白質Marker(20～120 ku)、T4 DNA 連接酶和IPTG 均購自大連寶生物工程有限公司；ECL 發(fā)光試劑盒購自美國Thermo 公司；Ni-Agarose His 標簽蛋白純化試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；BCA 蛋白定量檢測試劑盒均購自上海生工生物工程有限公司；HRP (辣根過氧化物酶)標記的羊抗豬IgG 和小牛血清購自上海生工生物工程有限公司；豬流行性腹瀉快速檢測試劑盒購自深圳市綠詩源生物技術有限公司。

1.3 引物設計及合成

截取 S1 與S2 區(qū)之間抗原決定簇區(qū)域進行載體構建。設計1 對分別插入限制性內切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位點的引物并引入保護堿基，送至上海生工生物工程有限公司合成，引物信息見表1。

1.4 目的基因SJ 的擴增鑒定及重組質粒pET-32a (+)-SJ 的構建

提取分離株SNJ-P 的RNA，轉錄為cDNA，以cDNA 為模板使用引物(SNJ-F 和SNJ-R)進行PCR 擴增，獲得SJ基因。反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，34 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物回收純化后與pMD-19T(simple)載體16 ℃連接過夜，轉化到大腸桿菌DH5α 中。提取質粒經(jīng)BamH I 和Hind Ⅲ酶切鑒定后，取50 μL 酶切產(chǎn)物添加至0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳分離，純化得到SJ目的基因片段，克隆至表達載體pET-32a (+)，構建重組質粒pET-32a (+)-SJ。

表1 引物序列Tab.1 The primer sequences

1.5 重組蛋白的表達、純化及鑒定

將鑒定正確的重組表達質粒pET-32a (+)-SJ與pET-32a (+)空載分別轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中，培養(yǎng)至菌液OD600nm值在0.6～0.8 左右時，添加終濃度為0.4～1.2 mmol/L 的IPTG，繼續(xù)誘導表達2～7 h (所有變量按棋盤法進行優(yōu)化)。目的蛋白SJ 用Ni-Agarose-Resin 層析柱純化，經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，轉印至NC 膜，以豬PEDV 陽性血清為一抗，辣根過氧化酶(HRP)標記的羊抗豬抗體為二抗，進行Western-blot 分析鑒定。使用BCA 蛋白定量檢測試劑盒測定純化的重組蛋白質量濃度。

1.6 間接ELISA 抗體檢測方法的建立及反應條件的優(yōu)化

采用棋盤法進行測定。將純化的PEDV SJ 蛋白、陰陽性血清按梯度倍比稀釋，確定最佳抗原包被質量濃度、最佳血清稀釋度和最佳酶標抗體稀釋度。純化的PEDV SJ 蛋白分別作1∶1 000、1∶500、1∶250、1∶125 和1∶62.5 稀釋；PEDV陽性血清和陰性血清分別作 1∶100、1∶80、1∶40、1∶20 和1∶10 稀釋，酶標抗體按1∶4 000、1∶3 000、1∶2000 和1∶1 000 稀釋。按常規(guī)ELISA 方法操作，測定記錄OD450nm值，計算P/N值，選定最佳稀釋度，并且對包被條件、封閉液及時間、顯色時間進行逐一優(yōu)化，確定最優(yōu)反應條件。

1.7 標準臨界值的確定

按已建立的ELISA 方法檢測20 份PEDV 陰性血清，計算出平均值與標準方差(SD)。根據(jù)統(tǒng)計學原理分析，OD450nm值≥+3SD 時，在99.9%的統(tǒng)計學水平上即可判定為陽性；反之，當OD450nm值＜+3SD 時，可判定為陰性。

1.8 特異性試驗、重復性試驗和符合率試驗

用已建立的間接ELISA 抗體檢測方法，檢測實驗室保存的PPV、PRV、TGEV、PRRSV、PCV 和CSFV 陽性血清。每份血清做3 個重復，并設立PEDV 陰性血清和陽性血清作為對照。測定OD450nm值，計算平均值，判定血清陰陽性用以確定方法的特異性。

批內重復：選取3 份PEDV 不同抗體水平的豬血清，在同一時間進行間接ELISA 抗體檢測試驗，每份血清重復3 次，測定OD450nm值，分別計算3 份血清OD450nm值的平均值、標準方差及變異系數(shù)；批間重復：選取3 個不同時間包被的酶標板，3 份PEDV 不同抗體水平的豬血清，在不同時間測定OD450nm值，分別計算3 份血清平均值、標準方差及變異系數(shù)。

隨機選取30 份血清，分別用建立的ELISA方法與綠詩源豬流行性腹瀉快速檢測試劑盒同時進行檢測，比較兩者符合率。

1.9 臨床應用

為評價該方法在臨床上的應用價值，采集四川6 個豬場120 份血清進行檢測，測定OD450nm值，統(tǒng)計陽性檢出率。

大多數(shù)微生物的含氮量比例較一致，根據(jù)含氮量再乘以一定的數(shù)值即可測得其粗蛋白的含量，從而大致可以得到活菌的生長情況，傳統(tǒng)方法常用凱氏定氮法進行測定，該方法具有廣泛的適應性、操作簡單易行、試劑消耗少等優(yōu)點，但是其只能測得有機氮的含量，所以其測定結果不太準確。

2 結果與分析

2.1 SJ 基因的擴增及重組表達質粒的鑒定

以分離株SNJ-P 的cDNA 作為模板擴增獲得目的基因SJ，片段大小為315 bp (圖1a)。回收目的條帶，構建重組質粒pMD-19T-SJ，使用快切酶BamH I 和Hind Ⅲ進行酶切鑒定(圖1b)得到2 692 與315 bp 2 條片段，與預期相符。將酶切產(chǎn)物克隆至表達載體構建重組質粒pET-32a(+)-SJ，用相同2 種快切酶鑒定得到6 196 和315 bp 2 條條帶與預期結果相符。重組質粒送上海生工生物工程股份有限公司測序，測序結果分析表明重組質粒成功構建。

2.2 重組蛋白的鑒定及表達純化

pMD-19T-SJ和空載菌經(jīng)IPTG 誘導表達后，用SDS-PAGE 進行鑒定，結果顯示：重組菌和空載菌分別在35 和24.8 ku 出現(xiàn)了特異性蛋白條帶(圖2a)，與預期相符，表明成功表達SJ基因。采用Ni-Agarose-Resin 層析柱純化蛋白，Westernblot 結果顯示：誘導表達的重組蛋白可以與PEDV陽性血清發(fā)生特異性反應，表明重組蛋白具有良好的反應原性(圖2b)，并測得重組蛋白質量濃度為1.145 mg/mL。

圖1 SJ 基因片段擴增及pMD-19T-SJ 雙酶切鑒定電泳圖Fig.1 Amplification of SJ gene fragment and pMD-19T-SJ double enzyme digestion identification

圖2 重組SJ 蛋白SDS-PAGE 檢測及Western-blot 分析Fig.2 Expression of the target protein and Western-blot

2.3 PEDV S 蛋白間接ELISA 抗體檢測方法的建立

2.3.1 最佳反應條件確定

采用棋盤法優(yōu)化各參數(shù)后，確定了最佳反應條件：抗原稀釋倍數(shù)為1∶125 (9.16 μg/mL)，每孔100 μL 4 ℃過夜37 ℃孵育1 h 進行包被，用5% BSA 加0.1%的吐溫-20 37 ℃封閉75 min，最佳血清稀釋倍數(shù)為1∶40，1∶1 000 酶標抗體孵育45 min，底物顯色時間為10 min，能有最優(yōu)反應結果。

2.3.2 間接ELISA 抗體檢測方法臨界值的確定

按已建立的間接ELISA 抗體檢測方法檢測20份陰性血清，計算其OD450nm平均值為0.201 1，標準方差(SD)為0.041。根據(jù)+3SD 計算出臨界值為0.324 1，記為0.324。當樣本OD450nm≥0.324時判定為陽性，否則判為陰性。

2.3.3 特異性試驗

用建立的間接ELISA 抗體檢測方法，檢測試驗室保存的PPV、PRV、TGEV、PRRSV、PCV和CSFV 陽性血清，并設立PEDV 陰性血清和陽性血清作為對照。試驗結果如表2 所示：除PEDV陽性血清外，OD450nm值均小于0.324，判定為陰性。試驗證明建立的間接ELISA 抗體檢測方法特異性良好。

2.3.4 重復性試驗

選取3 份PEDV 不同抗體水平的豬血清，進行重復試驗，批內與批間重復試驗變異系數(shù)在1.23%～5.84%之間(表3)。試驗證明建立的間接ELISA 抗體檢測方法重復性良好。

表2 特異性試驗結果Tab.2 Specificity of indirect ELISA

表3 批內重復性試驗結果Tab.3 The results of intra-assay repeat tests

2.3.5 符合性試驗

隨機選取30 份血清，分別用建立的ELISA方法與市售PEDV 抗體檢測試劑盒同時進行檢測，計算符合率為96.67%，試驗證明建立的間接ELISA 抗體檢測方法結果可靠。

2.3.6 臨床血清檢測結果

采集四川6 個豬場120 份血清進行檢測，測定OD450nm值，結果顯示哺乳仔豬血清陽性率為72% (36/50)，妊娠母豬血清陽性率為87.14% (61/70)，試驗證明有較好的利用范圍和檢測效率。

3 討論

PED 主要在歐洲和亞洲大規(guī)模暴發(fā)[13-15]，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。國內外研發(fā)了許多預防該病的疫苗，大多以滅活苗與活疫苗為主[16]，如馬思奇等[17-18]首先報道了氫氧化鋁組織滅活苗，使用后免疫效果達85%以上；中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所研發(fā)的“豬傳染性胃腸炎—豬流行性腹瀉—豬輪狀病毒”三聯(lián)活疫苗[19]，雖然使用后能在一定時間內降低豬群PED 的感染率，但預防效果都在疫苗接種一段時間后降低，這可能是由PEDV 變異導致疫苗無法起到很好的保護作用，使得疫情難以控制[20]。對免疫豬群抗體水平的檢測是PED 有效防控的關鍵，建立一種快捷、方便和準確的PEDV 檢測方法十分迫切?，F(xiàn)已有很多關于PEDV 的ELISA檢測方法，但大多以雙抗夾心ELISA 為主[21-23]，單克隆抗體制備花費時間長、效率低且對技術要求高，不是特別適用于規(guī)?；a(chǎn)及檢測。目前市場上只有少量PEDV 抗體檢測試劑盒售賣，抗原大都包被的是全病毒[24-26]，易出現(xiàn)假陽性，間接ELISA 抗體檢測方法相比較而言，操作更簡便、成本更低、特異性更強以及具有更高的利用價值。此外還有許多檢測手段，RT-qPCR[27]雖然特異性好、靈敏性高，但依賴于儀器設備；膠體金[28]雖然成本低、檢測快速，但只能對病毒定性不能定量；PEDV 相比于其他冠狀病毒分離培養(yǎng)的難度大很多，且存在病毒傳代的過程中丟失毒株的風險，導致很難大量制備抗原。以具有抗原性的重組蛋白作為ELISA 包被抗原，可以很好地解決這一難題。

早期，大多是以疫苗株CV777 序列為基礎建立的PEDV 抗體檢測方法[29-30]。但是由于PEDV不斷變異，檢測結果易受到影響。本研究通過分析分離得到的強毒株SNJ-P 的S基因，截取抗原性高的序列，成功構建重組質粒，表達純化獲得的SJ 蛋白。以該蛋白作為包被抗原，通過棋盤滴定法，優(yōu)化各反應條件，建立PEDV S 蛋白的間接ELISA 抗體檢測方法。通過對20 份陰性血清OD450nm值的測定，計算出陰陽性臨界值+SD=0.324 1。該方法檢測PPV、PRV、TGEV、PRRSV、PCV 和CSFV 陽性血清均為陰性，證明建立的間接ELISA 抗體檢測方法具有良好的特異性。3 份抗體水平不同的血清進行批內與批間重復試驗，計算變異系數(shù)在1.23%～5.84%之間，證明建立的間接ELISA 抗體檢測方法具有良好的重復性。分別使用建立的間接ELISA 方法與市售PEDV 抗體檢測試劑盒對30 份血清進行檢測，計算符合率為96.67%，證明該方法結果可靠。再使用該方法對采自6 個豬場不同種類豬的120 份血清進行PED 抗體檢測，最終的抗體陽性率為80.83%；其中，妊娠母豬血清陽性率為87.14%，哺乳仔豬的血清陽性率為72%。母豬在免疫之后機體能否產(chǎn)生抗體直接關系到哺乳仔豬能否通過乳汁獲得抗體。該試驗結果證明：哺乳仔豬可以通過乳汁獲得一定的免疫保護。獲得的免疫保護力大小可能與乳汁中抗體水平的高低有關系[31]。

4 結論

近年來，流行毒株的不斷變異導致現(xiàn)有疫苗不能提供足夠保護，加之更多的豬源性傳染病可以與該病混合感染導致PED 疫情更加復雜，難以防控治療。因此高效精確地診斷PEDV 對有效實施疾病的控制措施至關重要，這些措施有助于降低病毒進一步傳播的風險[32]，也為后續(xù)治療爭取寶貴的時間。本研究對PEDV 強度株SNJ-P 的部分S基因進行原核表達，初步建立了PEDV 抗體間接ELISA 抗體檢測方法。該診斷方法具有快捷、方便、準確等優(yōu)點，可以成為臨床上對PEDV抗體水平的監(jiān)控方法，為以后診斷試劑盒的研制提供理論指導。