王 雷,彭賽君,董志軍

1 中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所牟平海岸帶環(huán)境綜合試驗(yàn)站, 煙臺(tái) 264003 2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049 3 中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)中心,青島 266071

海洋酸化是繼“溫室效應(yīng)”之后又一因CO2過(guò)量排放而引起的全球性環(huán)境問(wèn)題[1]。工業(yè)革命以來(lái),海洋吸收了大約1/3的人類(lèi)排放CO2量,已造成海水pH下降0.1[2]。國(guó)外研究者預(yù)計(jì)2100年表層海水pH將下降0.3—0.4個(gè)單位[3],至2300年可能下降0.77[4]。近年來(lái)我國(guó)近岸海域季節(jié)性海水酸化問(wèn)題嚴(yán)重,2011年秋季黃海海域底層pH降至7.79—7.90,渤海海域則僅為7.64—7.68[5]。海洋酸化導(dǎo)致海水化學(xué)環(huán)境改變,會(huì)影響海洋生物的基因表達(dá)、能量代謝和細(xì)胞應(yīng)激等生理活動(dòng),進(jìn)而影響海洋生物發(fā)育、繁殖、生物鈣化等生命過(guò)程[6- 13]。同時(shí),工業(yè)廢水、城市污水及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用的含Cu2+肥料和殺蟲(chóng)劑等通江河徑流匯入近海,導(dǎo)致一些沿海地區(qū)海水銅含量超標(biāo)[14- 16]。銅作為分布最廣泛的環(huán)境污染物,近岸海域Cu2+濃度受陸源輸入和人為污染源影響而變化非常大,在我國(guó)遼東灣北部海域Cu2+最高濃度可達(dá)25.55 μg/L[17],錦州灣海域海水Cu2+含量為0.73—13.2 μg/L[18],而渤海灣海域則在0.38—2755 μg/L之間[19]。銅也是生命體一種必需微量元素,與生物體內(nèi)30多種酶氧化還原催化酶和分子氧載體功能的有關(guān)[20]。但高濃度Cu2+可造成水生動(dòng)物抗氧化系統(tǒng)損傷、組織結(jié)構(gòu)發(fā)生病理變化和遺傳毒性作用,引起海洋生物嚴(yán)重的組織損傷甚至死亡[21- 23]。

海洋酸化可能改變重金屬在水環(huán)境的形態(tài),促進(jìn)Cu2+等金屬離子從沉積物或巖石中遷移至海水中,從而提高Cu2+在海水環(huán)境的濃度水平和水生生物體的生物利用率[24- 25]。Richards等[26]通過(guò)模型預(yù)測(cè)2100年海洋pH值(7.845)條件下,平均Cu2+濃度將增加115%。海洋酸化還會(huì)通過(guò)改變pH敏感金屬的生物效應(yīng)和潛在毒性間接影響海洋生物種群,有研究發(fā)現(xiàn),銅污染結(jié)合海洋酸化、低氧和升溫等應(yīng)激源將導(dǎo)致海葵和珊瑚等海洋生物更嚴(yán)重的氧化應(yīng)激效應(yīng),抑制生物體金屬離子酶活性,降低海洋生物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性[27-28]。Marques等[29]研究發(fā)現(xiàn),Cu2+和海水酸化造成有孔蟲(chóng)Amphisteginagibbosa的Ca2+-ATP酶活性受到嚴(yán)重抑制,生長(zhǎng)速率顯著降低,白化率更高。

水母作為海洋中一類(lèi)重要的膠質(zhì)性浮游動(dòng)物,在碳、氮、磷等元素的生物地球化學(xué)循環(huán)中扮演重要角色,并在維持海洋生態(tài)系統(tǒng)能量流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán)過(guò)程中起到重要作用[30]。海月水母(Aureliacoeruleavon Lendenfeld,1884)是我國(guó)近海常見(jiàn)大型水母之一,其暴發(fā)給人類(lèi)社會(huì)活動(dòng)和海洋生態(tài)系統(tǒng)帶來(lái)許多負(fù)面影響[31- 33]。海月水母具有典型的世代交替現(xiàn)象[34],包括無(wú)性繁殖的營(yíng)底棲生活的螅狀幼體階段和有性繁殖的營(yíng)浮游生活的水母體階段。國(guó)內(nèi)外研究者進(jìn)行了大量研究探索溫度、鹽度、pH、重金屬等環(huán)境因素對(duì)海月水母生活史早期階段的影響,以預(yù)測(cè)未來(lái)海洋環(huán)境變化下海月水母種群變動(dòng)趨勢(shì)[35- 43]。

海月水母碟狀幼體為浮游階段水母體的幼體形態(tài),每只螅狀幼體在橫裂期間可產(chǎn)生多達(dá)20—30個(gè)碟狀幼體[44]。缽水母是海洋毒理學(xué)研究最多的刺胞動(dòng)物之一,常用指標(biāo)例如出芽繁殖、橫裂繁殖、碟狀幼體形態(tài)和收縮頻率等[45]。海月水母具有多種無(wú)性繁殖方式,繁殖速度較快,可以通過(guò)橫裂繁殖獲得體型和發(fā)育階段一致的碟狀幼體；碟狀幼體的生長(zhǎng)速度較快,生長(zhǎng)率、收縮頻率等易受到環(huán)境因素的影響。因此,海月水母也被認(rèn)為是環(huán)境毒理學(xué)研究的潛在模式生物和海洋環(huán)境污染監(jiān)測(cè)的重要指示物種[45- 47]。

過(guò)去10年間,研究者開(kāi)展了海洋酸化對(duì)不同水母的影響研究,如：Kikkawa等[48]發(fā)現(xiàn),海月水母Aureliasp.碟狀幼體在pH 6.896海水中暴露96 h后發(fā)育畸形,pH 6.366時(shí)停止發(fā)育。Winans等[47]研究則表明,海洋酸化條件(pH 7.5和7.3)對(duì)海月水母(Aurelialabiata)螅狀幼體和碟狀幼體的生存或無(wú)性繁殖沒(méi)有顯著影響,但酸化海水會(huì)抑制碟狀幼體平衡石發(fā)育。與其他刺胞動(dòng)物相比,代謝率較高的立方水母更容易受到海洋酸化影響[49]。Boco等[50]發(fā)現(xiàn)2300pCO2(即pH 7.5)海洋酸化條件對(duì)立方水母目Carybdeaxaymacana水母階段具有嚴(yán)重毒性影響,暴露于酸化海水12 h后C.xaymacana死亡率顯著增加。但海洋酸化與重金屬兩種環(huán)境壓力對(duì)水母脅迫效應(yīng)的研究仍處于空白。碟狀幼體作為海月水母生長(zhǎng)階段初期,主要棲息于近岸河口區(qū)域,其生長(zhǎng)發(fā)育易受到環(huán)境脅迫影響,了解海月水母碟狀幼體在海洋酸化和Cu2+脅迫下的生理變化,可以更有效預(yù)測(cè)未來(lái)海月水母種群變動(dòng)。本研究設(shè)置兩個(gè)pH水平(pH 8.1和pH 7.6)和3個(gè)Cu2+濃度水平(0、10 μg/L和25 μg/L),通過(guò)測(cè)定抗氧化酶過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)及離子轉(zhuǎn)運(yùn)酶Ca2+-ATP酶活性、呼吸率、收縮頻率和傘部直徑等生理指標(biāo),分析海月水母碟狀幼體在海洋酸化和Cu2+脅迫下的生理響應(yīng)。這些結(jié)果旨在了解海洋酸化和Cu2+對(duì)海月水母碟狀幼體生理代謝和生長(zhǎng)發(fā)育等過(guò)程的差異影響,有助于預(yù)測(cè)未來(lái)環(huán)境條件下生物多樣性和其他生態(tài)進(jìn)程的變化趨勢(shì)。本研究結(jié)果將為評(píng)估全球和區(qū)域海洋環(huán)境問(wèn)題對(duì)海洋生物的影響以及海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 海月水母碟狀幼體收集

海月水母成體2019年9月采集于煙臺(tái)市養(yǎng)馬島附近海域(37°26′43″N, 121°34′25″E),運(yùn)回牟平海岸帶環(huán)境綜合試驗(yàn)站的水母養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室收集海月水母浮浪幼蟲(chóng)。浮浪幼蟲(chóng)發(fā)育為螅狀幼體后,喂食孵化鹵蟲(chóng)(Artemiafranciscana)1日齡幼蟲(chóng)。螅狀幼體生長(zhǎng)至16觸手后,將培養(yǎng)溫度從15℃降至10℃刺激螅狀幼體橫裂[51]。螅狀幼體在10℃下4—5周后停止喂食,開(kāi)始進(jìn)行橫裂。為獲得大致相同發(fā)育階段的碟狀幼體,前12 d釋放的碟狀幼體不用于實(shí)驗(yàn),僅選擇個(gè)體健康、形狀良好、大小一致的1日齡碟狀幼體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

海水酸化水平參照政府間氣候變化專(zhuān)門(mén)委員會(huì)(IPCC)模型預(yù)測(cè)RCP 8.5情景下2100年海水pH值(7.6),通過(guò)氣體流量控制系統(tǒng)調(diào)節(jié)空氣-CO2混合氣體的比例和進(jìn)氣量,實(shí)現(xiàn)海水酸化條件[52]。Cu2+濃度參照中華人民共和國(guó)海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(二類(lèi)海水Cu2+≤ 10 μg/L)以及渤海近岸海域環(huán)境相關(guān)濃度(遼東灣北部海水Cu2+最高值25.5 μg/L)設(shè)定,通過(guò)添加CuCl2溶液實(shí)現(xiàn)海水的Cu2+暴露濃度。

暴露實(shí)驗(yàn)包括兩個(gè)pH水平(pH 8.1和pH 7.6)和3個(gè)銅暴露濃度(0、10 μg/L和25 μg/L)共6個(gè)處理組,每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)300 L水族箱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)海水預(yù)處理。每個(gè)水族箱通過(guò)水泵連接10 L的U型水母缸,實(shí)驗(yàn)海水以40 mL/min流速通過(guò)水母缸,保證水母缸25 min左右更新一次海水。每個(gè)水母缸碟狀幼體實(shí)驗(yàn)數(shù)目為100只。實(shí)驗(yàn)海水經(jīng)過(guò)沙缸過(guò)濾和紫外線(xiàn)殺菌處理,溫度控制在22℃。暴露實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行16 d,期間每天向水母缸中定時(shí)投餌鹵蟲(chóng)1日齡無(wú)節(jié)幼體10 mL(50只/mL)。

每天使用NBS標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)的pH電極監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)水體pH,使用YSI儀測(cè)定溫度、鹽度和溶解氧(DO)。每周從水族箱中收集水樣,使用自動(dòng)電位滴定儀測(cè)定水體總堿度(TA)。根據(jù)TA值和測(cè)量參數(shù)(溫度、鹽度和pH值),利用CO2SYS軟件計(jì)算海水碳酸鹽化學(xué)的其他相關(guān)參數(shù)[53]。每周更換一次海水,更換海水后將pH和Cu2+濃度調(diào)節(jié)為設(shè)置條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)測(cè)定海月水母的呼吸率、收縮頻率和傘徑,液氮保存組織樣本進(jìn)行酶活測(cè)定。

1.3 抗氧化酶和離子轉(zhuǎn)運(yùn)酶活性

采用南京建成生物工程研究所試劑盒,分別對(duì)保存樣品的過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和Ca2+-ATP酶的活力水平進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定勻漿液的蛋白質(zhì)濃度。

稱(chēng)量0.2 g左右的海月水母組織(n=6),按照勻漿稀釋5倍的比例加入一定量的勻漿介質(zhì)(0.9%生理鹽水),低溫勻漿后離心10 min(2500 rpm,4℃),收集上清液分裝待測(cè)。CAT、SOD和Ca2+-ATP酶活力的測(cè)定參照相關(guān)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,組織總蛋白濃度的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。酶活性測(cè)定單位為U/mg蛋白,其中1 U代表單位質(zhì)量蛋白在單位時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；蛋白濃度的測(cè)定單位為mg/mL組織勻漿。

1.4 呼吸率

根據(jù)Pettersen等(2017)的方法[54],在暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采用SensorDish Reader PreSens連接24通道微孔板測(cè)定海月水母碟狀幼體的呼吸率,測(cè)定前使用空氣飽和水和2%亞硫酸鈉緩沖液校準(zhǔn)傳感器。測(cè)定時(shí)每個(gè)水母缸隨機(jī)選擇10只海月水母,每只單獨(dú)放入含0.2 μm膜過(guò)濾海水的12孔板中,記錄2 h的氧含量變化值。為消除生物環(huán)境應(yīng)激效應(yīng)等影響,測(cè)定期前1小時(shí)數(shù)據(jù)舍棄。呼吸率的測(cè)定在恒溫培養(yǎng)箱22℃黑暗中進(jìn)行,測(cè)定結(jié)果為微孔板中氧含量變化值MO。利用如下公式計(jì)算呼吸率(Respiration rates)：

Respiration rates=(MjO-McO)/WW

式中,MjO為水母測(cè)定孔氧含量變化值,McO為背景空白孔氧含量變化值,WW為測(cè)定水母濕重。

1.5 收縮頻率

根據(jù)Alguero-Muniz等(2016)的方法[43],在暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)每個(gè)處理組的海月水母收縮頻率進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)水母缸隨機(jī)選擇10只海月水母碟狀幼體放置在12孔板中,使用體視顯微鏡連接電腦軟件OPT Pro攝像3 min,記錄每只海月水母的收縮次數(shù)(p)。利用如下公式計(jì)算收縮率(Pulsation rates)：

Pulsation rates=p/(t1-t0)

式中,p為t0至t1時(shí)間內(nèi)的收縮次數(shù)。

1.6 傘部直徑

根據(jù)Heins等(2018)的方法[55],在暴露實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前和結(jié)束時(shí)使用體視顯微鏡連接電腦拍攝軟件OPT Pro,拍照測(cè)量碟狀幼體的傘部直徑。每個(gè)水母缸隨機(jī)取10只實(shí)驗(yàn)個(gè)體,放置在含2 mm高度海水的培養(yǎng)皿中進(jìn)行拍照測(cè)量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行雙因素方差分析(ANOVA),檢驗(yàn)不同處理間均值的顯著性,顯著性水平定義為P<0.05；使用單因素方差分析分別對(duì)正常pH水平和酸化pH水平下不同濃度Cu2+處理組數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析；使用Tukey(方差齊性)檢驗(yàn),比較相同Cu2+濃度處理下,正常pH海水組和酸化海水組的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ± SD)表示。

2 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)充入CO2氣體模擬海洋酸化環(huán)境,通過(guò)添加CuCl2溶液模擬近海銅污染環(huán)境。表1總結(jié)了海月水母暴露實(shí)驗(yàn)海水溫度、鹽度、pH以及其他碳酸鹽化學(xué)參數(shù)。酸化海水處理的pH條件控制在預(yù)期海水酸化水平附近(±0.02)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,海水溫度均保持在22℃左右,鹽度在31左右。

表1 海月水母暴露期間相關(guān)海水化學(xué)參數(shù)

2.1 抗氧化酶和離子轉(zhuǎn)運(yùn)酶酶活性

在海水酸化和Cu2+暴露16 d后,海月水母碟狀幼體的CAT活性隨著海水pH降低和Cu2+濃度增加呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。在0 μg/L Cu2+條件下,酸化海水組和正常海水組CAT活性差異極顯著,但加入Cu2+后酸化對(duì)CAT活性影響不顯著。在兩個(gè)pH水平下,10 μg/L和25 μg/L Cu2+處理組的CAT活性顯著低于0 μg/L Cu2+處理組。根據(jù)表2,海水酸化和Cu2+暴露對(duì)CAT活性具有極顯著交互作用(P<0.01)(圖1)。

暴露16 d后,海月水母碟狀幼體的SOD活性隨Cu2+濃度升高呈現(xiàn)顯著增加趨勢(shì)(P<0.01),酸化對(duì)SOD活性影響不顯著。在兩個(gè)pH水平下,25 μg/L Cu2+處理組的SOD活性顯著高于0 μg/L和10 μg/L Cu2+處理組,但0 和10 μg/L 兩個(gè)Cu2+處理組之間的差異性不顯著(圖2)。

圖1 海水酸化和Cu2+暴露下海月水母的CAT活性 Fig.1 CAT activities of A. coerulea ephyrae after elevated pCO2 and/or Cu2+ exposureCAT：過(guò)氧化氫酶Catalase; 不同字母表示相同的pH處理下,不同濃度的Cu2+處理之間存在顯著性(P<0.05)；星號(hào)(*)表示相同濃度的Cu2+處理下,正常pH與酸化pH之間存在差異(**P<0.01)

圖2 海水酸化和Cu2+暴露下海月水母的SOD活性 Fig.2 SOD activities of A. coerulea ephyrae after elevated pCO2 and/or Cu2+ exposureSOD：超氧化物歧化酶Superoxide dismutase; 不同字母表示相同的pH處理下,不同濃度的Cu2+處理之間存在顯著性(P<0.05)

隨著pH降低和Cu2+濃度增加,海月水母Ca2+-ATP酶活性呈現(xiàn)顯著降低的趨勢(shì)。0和10 μg/L Cu2+條件下,酸化對(duì)Ca2+-ATP酶活性具有顯著抑制作用。在兩個(gè)pH水平下,10 μg/L和25 μg/L Cu2+處理組的Ca2+-ATP酶活性較0 μg/L Cu2+處理組顯著降低。根據(jù)表2,海洋酸化和Cu2+暴露對(duì)Ca2+-ATP酶具有顯著的交互作用(P<0.05)(圖3)。

表2 雙因素方差分析：海水酸化和Cu2+脅迫對(duì)海月水母碟狀幼體的影響

2.2 呼吸率

海水酸化和Cu2+暴露對(duì)海月水母碟狀幼體呼吸率具有顯著影響(P<0.01)。當(dāng)Cu2+濃度為0 μg/L時(shí),酸化海水組呼吸率較正常pH海水組顯著升高,但在10 μg/L和25 μg/L Cu2+時(shí),正常pH海水組呼吸率明顯高于酸化海水組。在正常pH海水中,海月水母的呼吸率隨Cu2+濃度增加呈現(xiàn)顯著增加趨勢(shì),但酸化海水組的呼吸率隨Cu2+濃度增加先升高后降低。根據(jù)雙因素方差分析,海水酸化和Cu2+對(duì)海月水母的呼吸率均具有顯著的促進(jìn)作用,兩者存在顯著的交互作用(P<0.01)(圖4)。

圖3 海水酸化和Cu2+暴露下海月水母的Ca2+-ATP酶活性 Fig.3 Ca2+-ATPase activities of A. coerulea ephyrae after elevated pCO2 and/or Cu2+ exposure不同字母表示相同的pH處理下,不同濃度的Cu2+處理之間存在顯著性(P<0.05)；星號(hào)(*)表示相同濃度的Cu2+處理下,正常pH與酸化pH之間存在差異(**P<0.01)

圖4 海水酸化和Cu2+暴露下海月水母的呼吸率 Fig.4 Respiration rates of A. coerulea ephyrae after elevated pCO2 and/or Cu2+ exposure不同字母表示相同的pH處理下,不同濃度的Cu2+處理之間存在顯著性(P<0.05)；星號(hào)(*)表示相同濃度的Cu2+處理下,正常pH與酸化pH之間存在差異(*P<0.05,**P<0.01)

2.3 收縮頻率

海水酸化和Cu2+暴露對(duì)海月水母碟狀幼體收縮頻率的影響如圖5所示。暴露16 d后,在相同的Cu2+濃度處理下,酸化對(duì)海月水母收縮頻率沒(méi)有顯著性影響。隨著Cu2+暴露濃度的增加,海月水母收縮頻率均呈現(xiàn)顯著降低的趨勢(shì),25 μg/L Cu2+處理組的收縮率顯著低于0 和10 μg/L Cu2+處理組。Two-way ANOVA 分析表明,海水酸化和Cu2+對(duì)收縮頻率影響的交互作用不顯著(P>0.05)。

2.4 傘部直徑

圖6為不同海水pH和Cu2+濃度下的海月水母碟狀幼體傘部直徑。碟狀體初始傘徑為(3.51±0.2)mm,各處理組之間碟狀體初始傘徑不存在顯著性差異(P>0.05)。暴露16 d后,海月水母?jìng)悴恐睆诫SCu2+濃度增加呈現(xiàn)顯著降低趨勢(shì),25 μg/L Cu2+處理組的水母?jìng)悴恐睆斤@著小于0 μg/L Cu2+處理組。根據(jù)體視顯微鏡拍攝的暴露16 d后碟狀幼體圖像顯示(圖7),Cu2+嚴(yán)重影響碟狀幼體的生長(zhǎng),并導(dǎo)致發(fā)育畸形。不同Cu2+濃度下,酸化對(duì)海月水母生長(zhǎng)的影響不一致,0 μg/L Cu2+濃度時(shí),正常pH海水組的水母?jìng)銖斤@著大于酸化海水組；但加入 Cu2+后,正常pH海水組的水母?jìng)銖矫黠@小于酸化海水組。海水酸化和銅暴露對(duì)海月水母碟狀幼體的生長(zhǎng)均具有顯著影響(P<0.01),兩者存在顯著拮抗作用(P<0.01)。

3 討論

本研究首次探究了海月水母碟狀幼體對(duì)海洋酸化和Cu2+兩種環(huán)境脅迫因子的生理響應(yīng),從抗氧化酶和離子轉(zhuǎn)運(yùn)酶活性、呼吸、運(yùn)動(dòng)以及生長(zhǎng)等方面探究?jī)煞N脅迫因子在不同濃度下對(duì)海月水母的綜合影響。研究結(jié)果表明,海月水母對(duì)兩種環(huán)境脅迫因子敏感性不同,單獨(dú)Cu2+暴露比單獨(dú)酸化暴露的脅迫效應(yīng)更嚴(yán)重,這與Siddiqui等[28]在海洋酸化和Cu2+對(duì)珊瑚生理影響的研究一致。本研究發(fā)現(xiàn)海水酸化與Cu2+對(duì)海月水母呼吸率和生長(zhǎng)具有拮抗作用,海水酸化可緩解Cu2+對(duì)海月水母碟狀幼體的毒性影響。Lewis等[56]也報(bào)道了類(lèi)似現(xiàn)象,海膽Paracentrotuslividus體內(nèi)的酸堿調(diào)節(jié)機(jī)制可在酸化條件下(pH 7.7)增加細(xì)胞外碳酸氫鹽水平,保護(hù)性地對(duì)抗Cu2+毒性,減輕Cu2+暴露引起的DNA損傷。Larsen等[57]在對(duì)大西洋鱈魚(yú)(Gadusmorhua)研究中也提出酸化對(duì)Cu2+毒性的保護(hù)作用,游離Cu2+將與HCO32-形成一系列絡(luò)合物,升高的碳酸氫鹽水平可以降低海水游離Cu2+的比例,從而減少銅毒性對(duì)生物造成的損害。

圖5 海水酸化和Cu2+暴露下海月水母的收縮頻率 Fig.5 Pulsation rates of A. coerulea ephyrae after elevated pCO2 and/or Cu2+ exposure不同字母表示相同的pH處理下,不同濃度的Cu2+處理之間存在顯著性(P<0.05)

圖6 海水酸化和Cu2+暴露下海月水母的傘部直徑 Fig.6 Bell diameter of A. coerulea ephyrae after elevated pCO2 and/or Cu2+ exposure不同字母表示相同的pH處理下,不同濃度的Cu2+處理之間存在顯著性(P<0.05)；星號(hào)(*)表示相同濃度的Cu2+處理下,正常pH與酸化pH之間存在差異(**P<0.01)

圖7 海水酸化和Cu2+暴露下的海月水母碟狀幼體Fig.7 A. coerulea ephyrae after elevated pCO2 and/or Cu2+ exposure在0 μg/L(a)、10 μg/L(b)和25 μg/L(c)Cu2+濃度下,正常pH海水組的碟狀幼體；0 μg/L(d)、10 μg/L(e)和25 μg/L(f)Cu2+濃度下,酸化pH海水組的碟狀幼體。比例尺：2 mm

3.1 海洋酸化和Cu2+對(duì)海月水母抗氧化酶和離子轉(zhuǎn)運(yùn)酶的影響

本研究表明,海洋酸化和Cu2+脅迫對(duì)海月水母抗氧化酶CAT和SOD以及離子轉(zhuǎn)運(yùn)酶Ca2+-ATP酶活性具有顯著影響。CAT活性隨著Cu2+濃度的增加而降低,SOD活性隨著Cu2+濃度增加而增加,表明Cu2+可能引起海月水母較強(qiáng)的氧化應(yīng)激效應(yīng),但會(huì)抑制CAT的活性。海水酸化對(duì)CAT活性也具有顯著抑制作用。任虹等[58]研究重金屬污染物對(duì)文蛤(Meretrixmeretrix)金屬酶類(lèi)發(fā)現(xiàn),當(dāng)Cu2+濃度高于5 μmol/L時(shí)對(duì)CAT的抑制效果顯著。其他研究也發(fā)現(xiàn),櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)內(nèi)臟團(tuán)組織的CAT活性隨著Cu2+濃度增加,表現(xiàn)出“抑制-誘導(dǎo)-抑制”的規(guī)律,但整體表現(xiàn)為降低趨勢(shì),重金屬對(duì)CAT的抑制作用可能由于Cu2+干擾酶分子鐵卟啉環(huán)中Fe2+的結(jié)合而抑制其活性[59]。Siddiqui等[28]研究表明,隨著pCO2增加,?？鸈xaiptasiapallida的CAT、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)和谷胱甘肽還原酶(GR)活性顯著降低。

Ca2+-ATP酶是Ca2+激活的Mg2+依賴(lài)性ATP酶,負(fù)責(zé)生物體鈣的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)和維持細(xì)胞pH穩(wěn)定[60]。Ca2+-ATP酶作為一種離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,也被認(rèn)為是易受到環(huán)境干擾的敏感生物標(biāo)志物[29]。許多重金屬對(duì)珊瑚、貽貝和海膽等鈣化生物的ATP酶活性具有抑制作用,通過(guò)氧化應(yīng)激條件誘導(dǎo)膜損傷,重金屬離子可以導(dǎo)致膜結(jié)合的ATP酶活性受損[61-62]。有研究表明,暴露于含Cu2+海水的珊瑚以及在高Cu2+濃度海域采集的有孔蟲(chóng)的Ca2+-ATP酶活性較低[23]。本研究結(jié)果也顯示,海洋酸化和Cu2+均對(duì)Ca2+-ATP酶活性具有較強(qiáng)的抑制效應(yīng)。以往研究發(fā)現(xiàn),低pH條件下水螅幼體橫裂釋放出的碟狀幼體平衡石明顯較小[47]。海水酸化或重金屬條件下,海月水母的Ca2+-ATP酶活性降低,可能影響水母體內(nèi)鈣的吸收和平衡石等鈣質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成。作為水母感受器官感覺(jué)棍的重要組成部分,平衡石的損傷或缺失將導(dǎo)致水母生長(zhǎng)畸形和游泳行為不規(guī)律[47]。

3.2 海洋酸化和Cu2+對(duì)海月水母呼吸率的影響

呼吸率是海洋生物代謝活動(dòng)的直接指標(biāo),浮游動(dòng)物的呼吸率主要受環(huán)境溫度和生物體重影響,還受生物的活力水平、環(huán)境深度和O2分壓及物種特異性行為的影響[54,63-65]。本研究表明,正常pH海水條件下,海月水母呼吸率隨Cu2+濃度的升高呈現(xiàn)顯著升高趨勢(shì)；而在酸化海水中,呼吸率隨Cu2+濃度先升高后降低。結(jié)果表明銅暴露造成海月水母機(jī)體代謝水平升高,但酸化可能減緩Cu2+對(duì)水母體的毒性應(yīng)激效應(yīng)。Catarino等[65]研究表明,低溫及低pH(7.7和7.4)暴露導(dǎo)致海膽Paracentrotuslividus呼吸率顯著升高。也有研究發(fā)現(xiàn),在Cu2+暴露環(huán)境中,草魚(yú)(Ctenopharyngodonidella)幼魚(yú)有氧代謝增加37.48%,同時(shí)草魚(yú)幼魚(yú)的游泳能力也受到影響,游泳效率降低[66]。當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生變化時(shí),生物體可能需要通過(guò)離子調(diào)節(jié)等生理過(guò)程以適應(yīng)環(huán)境變化,而生物消耗體內(nèi)儲(chǔ)存能量應(yīng)對(duì)環(huán)境變化的生存策略,可能是導(dǎo)致機(jī)體代謝率升高的原因之一。

3.3 海洋酸化和Cu2+對(duì)海月水母收縮頻率的影響

收縮行為是海月水母碟狀幼體的主要運(yùn)動(dòng)方式,碟狀幼體通過(guò)收縮緣葉進(jìn)行游動(dòng),捕獲獵物和躲避天敵等[48]。本研究表明,海月水母的收縮頻率隨著銅暴露濃度的增加逐漸降低,正常pH海水、25 μg/L Cu2+暴露處理海月水母的收縮頻率最低。Tills等[46]研究發(fā)現(xiàn),在pH 7.6酸化條件下暴露7天后,海月水母(A.aurita)碟狀幼體收縮率顯著降低,收縮周期更長(zhǎng)。但本研究中,在0 μg/L Cu2+條件下,正常pH海水組海月水母收縮頻率顯著小于酸化海水處理組?？赡茉蚴撬甘艿胶Ｋ枇﹄S著傘部直徑增加而增大,導(dǎo)致水母收縮頻率降低。海月水母碟狀幼體不同生長(zhǎng)階段收縮頻率的變化,需要進(jìn)一步研究。在10 μg/L和20 μg/L Cu2+濃度下,酸化海水組碟狀幼體的收縮頻率高于正常pH海水組,這可能表明海水酸化可以緩解Cu2+對(duì)海月水母碟狀幼體收縮率的影響。之前的研究表明,水母對(duì)海洋酸化具有較高的耐受性,長(zhǎng)期海洋酸化模擬實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)pH值對(duì)海月水母無(wú)致命毒性影響[67]。Kikkawa等[48]研究發(fā)現(xiàn),海月水母(Aurelia. sp)碟狀幼體在暴露于5,000 matmpCO2酸化條件時(shí)收縮頻率才出現(xiàn)降低趨勢(shì)。

3.4 海洋酸化和Cu2+對(duì)海月水母生長(zhǎng)的影響

本研究表明,海水酸化和Cu2+暴露對(duì)碟狀幼體的生長(zhǎng)具有顯著抑制作用。暴露16 d后,正常pH海水和0 μg/L Cu2+的海月水母生長(zhǎng)狀況最好,該處理組中海月水母的平均傘徑最大。當(dāng)pH降低或加入Cu2+后,所有處理的海月水母生長(zhǎng)發(fā)育均顯示出負(fù)面影響,高濃度的Cu2+還會(huì)導(dǎo)致海月水母嚴(yán)重畸形。有研究表明,水體中過(guò)量的Cu2+會(huì)對(duì)魚(yú)類(lèi)的鰓片造成損傷,引起鰓片上皮細(xì)胞腫脹、變形和嚴(yán)重增生,最終導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)缺氧死亡[68],其他研究也報(bào)道了有孔蟲(chóng)和貝類(lèi)等生物Cu2+暴露后出現(xiàn)脂質(zhì)囊泡增殖和組織損傷等細(xì)胞學(xué)異?，F(xiàn)象[69-71]。有研究表明短期暴露于酸化海水或鋅、鎘等重金屬污染物會(huì)極大地影響水母毒素的生物活性,造成水母毒素的溶血性降低[70]。此外,Morabito等[72]還發(fā)現(xiàn)重金屬或海水酸化暴露下,夜光游水母(Pelagianoctiluca)離體刺細(xì)胞的離子通道和共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性降低,極大影響水母刺絲囊反應(yīng)；低pH條件下細(xì)胞膜水滲透性降低,刺細(xì)胞釋放過(guò)程延長(zhǎng)甚至失去釋放能力。含有毒素的刺細(xì)胞對(duì)于刺胞動(dòng)物的捕食和生存至關(guān)重要,刺細(xì)胞損傷將影響水母的捕食行為,最終影響其能量攝入以及生長(zhǎng)發(fā)育。

工業(yè)革命以來(lái),人類(lèi)活動(dòng)造成的海洋環(huán)境變化速度正在加劇,這導(dǎo)致了水母暴發(fā)、赤潮、滸苔暴發(fā)等海洋生物災(zāi)害事件頻繁發(fā)生,給人類(lèi)生產(chǎn)生活和海洋生態(tài)系統(tǒng)多樣性造成嚴(yán)重威脅。因此,利用生物評(píng)估模型預(yù)測(cè)海洋生物在未來(lái)海洋環(huán)境下的生理代謝變化和種群趨勢(shì)具有重要意義。作為新興的環(huán)境監(jiān)測(cè)方法,生物評(píng)估模型中的生物化學(xué)(例如免疫應(yīng)激有關(guān)的酶)和生理(例如生長(zhǎng)率和收縮頻率)變化等生物標(biāo)記物可以比物理和化學(xué)監(jiān)測(cè)手段更為直觀地反映海洋生物受到環(huán)境污染的影響。

4 結(jié)論

海水酸化和Cu2+暴露共同影響海月水母生活史早期階段碟狀幼體的生理代謝和生長(zhǎng)發(fā)育。在實(shí)驗(yàn)設(shè)置水平下,海水酸化和Cu2+對(duì)海月水母碟狀幼體CAT、Ca2+-ATP酶活性具有抑制作用,造成SOD活性升高,引起免疫應(yīng)激效應(yīng)；呼吸率則表現(xiàn)出Cu2+促進(jìn)效應(yīng),海洋酸化和Cu2+暴露下水母需要將更多的能量用于抵御逆境,但海洋酸化和Cu2+表現(xiàn)為拮抗效應(yīng),酸化可以緩解Cu2+對(duì)呼吸率的刺激作用；在Cu2+暴露下,海月水母的收縮頻率顯著降低,這可能導(dǎo)致海月水母捕食能力下降；海月水母碟狀幼體的生長(zhǎng)也受到海水酸化和Cu2+的抑制,傘徑長(zhǎng)度隨pH降低和Cu2+濃度增加而減小。