張 梅，吳 悅，蘇 麗，朱耀東，李 平，王 婷

腸黏膜屏障作為機(jī)體最重要的屏障之一，能夠抵御毒素和腸外病原體預(yù)防炎癥的發(fā)生。多種因素均可以導(dǎo)致該屏障的損害，如臨床上化療性腸黏膜損傷(chemotherapy-induced intestinal mucosal injury, CIMI)，嚴(yán)重影響了患者的治療效果，甚至縮短生存期。對(duì)于CIMI 的防治，集中在癥狀控制上，不能從根源上解決障礙。因此，尋找防治CIMI 的有效手段已成為目前腫瘤學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

亮菌口服液(

Armillariella

oral solution, AOS)是一種擁有完全知識(shí)產(chǎn)權(quán)的中成藥，臨床上被用于放化療引起的白細(xì)胞減少的輔助治療等。AOS能夠緩解5-FU 誘導(dǎo)的小鼠腸黏膜的損傷。亮菌多糖(

Armillariella

tabescens polysaccharides, ATPS)作為其中最主要成分，研究表明其能夠保護(hù)順鉑所導(dǎo)致的小鼠腸黏膜損傷。然而，ATPS 如何保護(hù)腸黏膜損傷的分子機(jī)制尚未有報(bào)道?，F(xiàn)通過(guò)體外構(gòu)建細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)的IEC-6 腸上皮細(xì)胞損傷為模型，觀察ATPS 對(duì)腸上皮細(xì)胞活性以及緊密連接蛋白表達(dá)的影響，并探討ATPS對(duì)腸上皮細(xì)胞功能損傷的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司，美國(guó))；熒光共聚焦顯微鏡(Laica公司，德國(guó))；凝膠成像儀(Bio-Rad公司，美國(guó))；EPS300 型電泳儀(北京天龍公司，中國(guó))；流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter FC500公司，美國(guó))；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化公司，中國(guó))；光學(xué)倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Sanyo公司，日本)；微量取樣槍(Eppendorf公司，德國(guó))；恒溫?fù)u床(北京六一生物科技有限公司，中國(guó))；低溫高速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司，中國(guó))。

1.2 主要試劑

大鼠腸上皮細(xì)胞系IEC-6 購(gòu)自ATCC 細(xì)胞庫(kù)；ATPS購(gòu)自合肥誠(chéng)志生物制藥有限公司公司；苦參堿購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；PERK(ab229912)、p-eIF2α(ab169528)、GRP78(ab108615)、Occludin(ab216327)、ZO-1(ab96587)抗體均購(gòu)自英國(guó)abcam 公司；p-PERK(CST#3179)、CHOP(CST#5554)、Arrb1(CST#12697)抗體均購(gòu)自德國(guó)CST 公司；內(nèi)參β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司；MTT 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；RIPA 裂解液(組織/細(xì)胞)、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、DAPI 染色液均購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 體外腸上皮細(xì)胞損傷模型建立方法

根據(jù)參考文獻(xiàn)的模型建立方法，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，進(jìn)行LPS處理IEC-6細(xì)胞建立體外腸上皮細(xì)胞損傷模型，LPS的最佳作用濃度通過(guò)此部分結(jié)果來(lái)選取。具體的實(shí)驗(yàn)方法如下：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×10個(gè)/ml；將100 μl的細(xì)胞懸液接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，使用不含血清的培養(yǎng)基配制不同濃度的LPS(0、10、20、40、80、160 μg/ml)，分別加入100 μl對(duì)應(yīng)濃度的LPS置各對(duì)應(yīng)孔中，置于37 ℃、5% CO細(xì)胞培養(yǎng)箱中處理24 h后，各孔中分別加入10 μl MTT(濃度：5 mg/ml)溶液，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h，吸去孔內(nèi)上清液終止培養(yǎng)，每孔加入150 μl DMSO，溫和振蕩10 min；通過(guò)酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔的吸光度(OD)值。細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組A孔OD值/對(duì)照組A孔OD值×100 %。

1.4 光學(xué)顯微鏡觀察和MTT法檢測(cè)ATPS對(duì)LPS誘導(dǎo)損傷的IEC-6 腸上皮細(xì)胞活性的影響

設(shè)置分組：對(duì)照組、LPS組、LPS+ATPS組、LPS+Matrine組，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×10個(gè)/ml；將100 μl的細(xì)胞懸液接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，使用不含血清的培養(yǎng)基配制不同濃度的ATPS(30、60、120 μg/ml)分別加入至LPS+ATPS組細(xì)胞中，LPS+Matrine組加入不含血清的培養(yǎng)基配制Matrine 100 μg/ml，對(duì)照組加入不含血清的培養(yǎng)基，37 ℃孵育3 h后，棄去培養(yǎng)基，LPS、LPS+ATPS、LPS+Matrine組分別加入不含血清的培養(yǎng)基配制的20 μg/ml LPS，37 ℃孵育24 h后，光學(xué)顯微鏡觀察拍照記錄各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)，各孔中分別加入10 μl MTT，按照1.3方法檢測(cè)細(xì)胞活性。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ATPS對(duì)LPS誘導(dǎo)損傷的IEC-6腸上皮細(xì)胞凋亡的影響

按照1.4方法中的分組，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為3.5×10個(gè)/ml；將1 ml的細(xì)胞懸液接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，按照1.4的加藥方法操作，37 ℃孵育24 h后，收集細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min，棄上清液，用PBS 輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取5×10個(gè)細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min，棄上清液，用195 μl Annexin V-FITC 結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，加入5 μl FITC-Annexin V-和10 μl PI染色液輕輕混勻。室溫避光孵育15 min，隨后置于冰浴中。可以使用鋁箔進(jìn)行避光，立即上機(jī)檢測(cè)。

1.6 免疫熒光檢測(cè)ATPS對(duì)LPS誘導(dǎo)損傷的IEC-6腸上皮細(xì)胞凋亡的影響

按照1.4方法中的分組，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×10個(gè)/ml；將1 ml的細(xì)胞懸液接種于含有載玻片的6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，按照1.4的加藥方法操作，37 ℃孵育24 h后，取出載玻片，4%多聚甲醛固定細(xì)胞2 min，PBS 洗滌，5 min/(次×3)。加入DAPI 染色液，室溫10 min，室溫PBS洗凈，5 min/(次×3)，涼干后用含熒光淬滅劑的封片液封片，熒光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.7 Western blot檢測(cè)ATPS對(duì)LPS誘導(dǎo)損傷的IEC-6腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白以及腸黏膜損傷重要蛋白Arrb1表達(dá)水平的影響

按照1.4方法中的分組、給藥方法及1.5中的細(xì)胞種植密度操作。收集細(xì)胞加入RIPA (含蛋白磷酸酶抑制劑)蛋白裂解液，并按1 ∶100加入PMSF混勻。冰上搖床振蕩30 min。4 ℃、15 000 r/min離心20 min后，將上清液轉(zhuǎn)入至新的EP 管中并進(jìn)行BCA 定量。取所需體積蛋白樣本與5×SDS loading buffer以4 ∶1的體積比例混勻，煮沸10 min，冷卻后置于-20 ℃冰箱，分裝備用。蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、轉(zhuǎn)移到5%脫脂奶粉-TBST封閉液于室溫封閉2 h(磷酸化的蛋白檢測(cè)用5% BSA-TBST封閉)。PVDF 膜分別加入稀釋的PERK、p-PERK、GRP78、CHOP、Occludin、ZO-1、Arrb1、β-actin 一抗，4 ℃過(guò)夜；TBST 洗滌后加入相應(yīng)的二抗，常溫?fù)u床孵育1 h后TBST洗滌，顯影。

2 結(jié)果

2.1 LPS成功誘導(dǎo)IEC-6腸上皮細(xì)胞損傷

利用不同濃度(0、10、20、40、80、160 μg/ml)的LPS 作用于腸上皮IEC-6 細(xì)胞24 h 后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)存活率，通過(guò)并按照改良寇式法計(jì)算IC。結(jié)果顯示，與0 μg/ml組比較，IEC-6 腸上皮細(xì)胞損傷隨著LPS濃度的增加呈現(xiàn)濃度依賴性趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0 μg/ml組細(xì)胞與低濃度20 μg/ml的LPS組比較，

F

=1.999 8，

P

=0.009 54)。見圖1和表1，IC=20 μg/ml。

圖1 MTT 法檢測(cè)不同濃度LPS 對(duì)IEC-6 腸上皮細(xì)胞活性的影響與0 μg/ml組比較：**P<0.01，***P<0.001

表1 不同濃度LPS對(duì)IEC-6腸上皮細(xì)胞活性的影響

2.2 ATPS抑制LPS誘導(dǎo)的IEC-6腸上皮細(xì)胞的凋亡

為了探索ATPS對(duì)LPS 誘導(dǎo)的IEC-6 腸上皮細(xì)胞損傷的作用，首先利用MTT 法確定ATPS 在IEC-6 腸上皮細(xì)胞中的安全使用濃度，結(jié)果顯示，與對(duì)照組(未加入ATPS)和陽(yáng)性對(duì)照組(苦參堿Matrine)相比，ATPS 在30、60、120 μg/ml 的濃度下對(duì)細(xì)胞的活性未有明顯的影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2A。當(dāng)ATPS 預(yù)先與IEC-6 腸上皮細(xì)胞孵育后，再利用LPS 誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，結(jié)果顯示與LPS(20 μg/ml)處理組比較，隨著ATPS 濃度的增加，顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)目增多，MTT 統(tǒng)計(jì)結(jié)果也表明細(xì)胞的活性越明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(20 μg/ml的LPS 組與低濃度20 μg/ml LPS+30 μg/ml ATPS組比較，

F

=4.122 1，

P

=0.028 975)。見圖2B、C和表2。通過(guò)免疫熒光(DAPI 染色)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)(FITC-Annexin V 和PI 雙染法)結(jié)果顯示，ATPS 的保護(hù)作用主要是通過(guò)阻止LPS 所誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞的凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。見圖2D、E。

圖2 ATPS 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的損傷IEC-6 腸上皮細(xì)胞凋亡的影響A：各組不同濃度ATPS 處理后的IEC-6 細(xì)胞(每組n=6個(gè)復(fù)孔)存活率；B：顯微鏡下各組IEC-6 細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)變化，光學(xué)顯微鏡×10；C：各組IEC-6 細(xì)胞(每組n=6個(gè)復(fù)孔)存活率；D：免疫熒光顯微鏡各組IEC-6 細(xì)胞DAPI染色，免疫熒光圖×10；E：各組IEC-6細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞圖；1：對(duì)照組；2：20 μg/ml LPS 組；3：20 μg/ml LPS+30 μg/ml ATPS 組；4：20 μg/ml LPS+60 μg/ml ATPS組；5：20 μg/ml LPS+120 μg/ml ATPS 組；6：20 μg/ml LPS+100 μg/ml Matrine組；與LPS(20 μg/ml)組比較：*P<0.05，***P<0.001

表2 不同濃度ATPS 對(duì)經(jīng)LPS 誘導(dǎo)損傷的IEC-6 細(xì)胞活性的影響

2.3 ATPS促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的IEC-6腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)

緊密連接蛋白及其相關(guān)蛋白(膜蛋白ZO-1、跨膜蛋白Occludin)對(duì)于維持細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附性、上皮屏障結(jié)構(gòu)的完整性是必不可少的，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LPS在誘導(dǎo)IEC-6腸上皮細(xì)胞發(fā)生損傷時(shí)，ZO-1、Occludin 的表達(dá)減少，而ATPS 能夠起到逆轉(zhuǎn)的作用，并與ATPS濃度呈正比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(針對(duì)20 μg/ml的LPS 組與低濃度20 μg/ml LPS+30 μg/ml ATPS 組比較，ZO-1 的蛋白表達(dá)，

F

=1.014 4，

P

=0.000 191；Occludin的蛋白表達(dá)，

F

=4.435 4，

P

=0.000 072 8)。見圖3。

圖3 ATPS 對(duì)LPS誘導(dǎo)損傷的IEC-6腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的影響A：ZO-1、Occludin蛋白條帶圖；B：ZO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量；C：Occludin蛋白相對(duì)表達(dá)量；1：對(duì)照組；2：20 μg/ml LPS 組；3：20 μg/ml LPS+30 μg/ml ATPS組；4：20 μg/ml LPS+60 μg/ml ATPS組；5：20 μg/ml LPS+120 μg/ml ATPS組；6：20 μg/ml LPS+100 μg/ml Matrine組；與LPS(20 μg/ml)組比較：***P<0.001

2.4 ATPS調(diào)控Arrb1及下游內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑PERK/eIF2α信號(hào)通路的變化抑制LPS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

研究表明具有多種功能如調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、生存、凋亡及運(yùn)動(dòng)功能和基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程的Arrb1 分子(又名β-arrestin 1)，在調(diào)節(jié)腸黏膜損傷過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，可能是介導(dǎo)腸上皮細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控分子。而Arrb1 介導(dǎo)腸上皮細(xì)胞增殖的抑制，其機(jī)制可能與近年來(lái)才發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡途徑，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(epdoplasmic reticulum stress，ERS)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路密切相關(guān)。因此，探究Arrb1 及ERS 凋亡通路的相關(guān)蛋白分子在ATPS 保護(hù)IEC-6 腸上皮細(xì)胞免受LPS 誘導(dǎo)損傷中的變化。Western blot 結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，LPS 處理組中Arrb1、ERS 介導(dǎo)的凋亡通路中p-PERK、p-eIF2α、GRP78、CHOP 蛋白的表達(dá)升高，當(dāng)ATPS 預(yù)先處理細(xì)胞后再經(jīng)LPS 處理，上述蛋白的表達(dá)隨著ATPS 濃度的增加而逐漸降低，Matrine 作為陽(yáng)性對(duì)照組。見圖4。

圖4 ATPS 對(duì)LPS 誘導(dǎo)損傷的IEC-6 腸上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白以及調(diào)節(jié)腸黏膜損傷蛋白Arrb1 表達(dá)水平的影響Arrb1、p-PERK、p-eIF2α、GRP 78、CHOP 蛋白條帶圖；1：對(duì)照組；2：20 μg/ml LPS組；3：20 μg/ml LPS+30 μg/ml ATPS 組；4：20 μg/ml LPS+60 μg/ml ATPS 組；5：20 μg/ml LPS+120 μg/ml ATPS 組；6：20 μg/ml LPS+100 μg/ml Matrine 組

3 討論

腸黏膜屏障在維持腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起重要作用，其中腸黏膜上皮細(xì)胞屏障以單層上皮細(xì)胞和細(xì)胞間的緊密連接為基礎(chǔ)，ZO-1、Occludin 是構(gòu)成細(xì)胞間緊密連接的組成部分。當(dāng)腸道黏膜屏障出現(xiàn)損傷時(shí)，會(huì)引起腸道的通透性變大，腸道的菌群失去正常比例，甚至?xí)T發(fā)或加重機(jī)體全身的炎癥反應(yīng)，使得多個(gè)臟器的功能出現(xiàn)障礙，如CIMI，到目前為止，尚且缺乏有效的治療方案。亮菌作為中國(guó)最初發(fā)現(xiàn)并擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的一種真菌，其主要成分ATPS具有抗腫瘤、升白、抗菌等防護(hù)作用。本文采用LPS 誘導(dǎo)的IEC-6 腸上皮細(xì)胞損傷模型，探討ATPS 對(duì)腸上皮細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制。結(jié)果顯示ATPS 抑制LPS 誘導(dǎo)的IEC-6 腸上皮細(xì)胞的凋亡，并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。此外，LPS 能夠誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞中Occludin 和ZO-1 表達(dá)降低，而ATPS 上調(diào)這些蛋白的表達(dá)。

Arrb1 分子作為銜接蛋白具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、生存、凋亡、運(yùn)動(dòng)和基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程等功能，在調(diào)節(jié)CIMI 病變過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，可能是腸上皮細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控分子。本結(jié)果顯示，LPS 能夠促進(jìn)腸上皮細(xì)胞中Arrb1 的表達(dá)，而ATPS 能夠逆反這種作用，呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。

ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡途徑，多種信號(hào)通路、分子伴侶都參與其中。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding proteinhomologous protein,CHOP)是目前公認(rèn)的ERS 標(biāo)志物，在ERS 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)/真核生物翻譯起始因子2α亞基(eukaryotic translation initiation factor 2 alpha subunit, eIF2α)信號(hào)通路是ERS 過(guò)程中的重要信號(hào)通路之一。文獻(xiàn)報(bào)道，Arrb1的減少能夠保護(hù)腸黏膜損傷，其機(jī)制可能與維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)平衡有關(guān)。本結(jié)果顯示，LPS 能夠促進(jìn)腸上皮細(xì)胞p-PERK、p-eIF2α、GRP78、CHOP 蛋白的表達(dá)發(fā)揮促凋亡作用，而ATPS 以劑量依賴的方式干預(yù)LPS 介導(dǎo)的凋亡作用。

綜上所述，ATPS 可能是通過(guò)上調(diào)緊密連接蛋白Occludin 和ZO-1 的表達(dá)，減少IEC-6 腸上皮細(xì)胞的凋亡，緩解LPS 介導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與Arrb1 分子、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及PERK/eIF2α 信號(hào)通路有關(guān)。