姜 偉，楊 囈，黃 猛，黃麗萍，張家祥，朱啟星,2

三氯乙烯(trichloroethylene，TCE)是一種傳統(tǒng)有機溶劑，廣泛存在于工業(yè)生產(chǎn)中。部分接觸TCE的工人會出現(xiàn)職業(yè)性三氯乙烯藥疹樣皮炎(occupational medicamentosa-like dermatitis due to TCE, OMLDT)，OMLDT患者發(fā)病過程中常會出現(xiàn)肝臟損傷，其中肝功能衰竭是該患者死亡的主要原因之一。因而TCE介導的免疫性肝損害的機制探究在OMLDT發(fā)病及防治中很有意義。研究顯示， OMLDT患者及TCE接觸動物體內氧化應激相關指標均有升高跡象，臟器損傷部位檢測到氧化應激升高。過量ROS通過多種途徑由多種細胞因子的聯(lián)合作用造成不同程度肝臟損傷。白細胞介素(interleukin，IL)-22是機體調節(jié)組織應答炎癥反應重要的小分子蛋白質，兼有保護和增強炎癥應答的雙重功能；IL-2作為細胞生長因子，不僅能增強機體的免疫監(jiān)視作用，而且能誘導T細胞增殖與分化，在機體調節(jié)中有著不可或缺的作用。氧化應激可介導炎癥因子釋放從而加重機體損傷，但在TCE致敏小鼠免疫性肝損傷過程中的機制還未闡明。為此，該研究基于TCE致敏小鼠模型，使用Tempol抑制小鼠氧化應激觀察在TCE致敏小鼠免疫性肝損傷中IL-22和IL-2表達水平，探究氧化應激在TCE致肝臟損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

三氯乙烯(TCE分析純)、Tempol及弗氏完全佐劑購自美國Sigma公司，谷草轉氨酶(AST/GOT)、谷丙轉氨酶(ALT/GPT)及丙二醛試劑盒購自南京建成科技公司，橄欖油和丙酮購自國藥集團，蘇木精-伊紅(HE)染液、IHC檢測試劑盒購自北京中杉金橋公司，RIPA裂解試劑、5×蛋白上樣緩沖液、PMSF、BCA試劑盒和一抗稀釋液購自上海碧云天公司，多克隆抗體IL-22(bs-2623R，兔來源)和IL-2(bs-1191R，兔來源)購自中國博奧森公司，單克隆β-actin一抗(KM9001T，小鼠)購自天津三箭公司，Universal 320/320R低溫高速離心機(型號：LD5-2A，德國Hettich公司)，顯微鏡( 型號：BX53+DP26，日本Olympus公司) ，電泳電源(型號：EPS 300，中國Tanon公司)，Image Pro Plus軟件(美國Media Cybernetics公司)，艾科浦純水機(型號：ASW1-0501-V，重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司)。

1.2 動物

40只SPF級Balb/c小鼠購自安徽省實驗動物中心，6～8周齡，雌性，16～18 g。于溫度 20～25 ℃、濕度為60%左右無特定病原菌的室內飼養(yǎng)，自主攝取清潔的食水，人工控制各12 h的晝夜節(jié)律。該實驗相關內容經(jīng)由安徽醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會審查并批準。

1.3 方法

1.3.1

動物處理 將Balb/c小鼠進行7 d適應性喂養(yǎng)，用簡單隨機抽樣法將其分為空白組(5只)、溶劑組(5只)、TCE組(15只)與TCE+Tempol組(15只)。TCE小鼠致敏模型參考該課題組前期建模方法，每次染毒前將小鼠腰背處除去2 cm×2 cm范圍大小的鼠毛，實驗第1天給TCE組和TCE+Tempol組背部皮下注射50%TCE(體積比為TCE ∶橄欖油 ∶丙酮=5 ∶2 ∶3)和等體積的FCA溶液共100 μl混合液，溶劑組則后背皮下注射無TCE等體積比的橄欖油同丙酮混合溶液；第4、7、10天， TCE組和TCE+Tempol組背部涂抹100 μl 50%TCE(體積比為TCE ∶橄欖油 ∶丙酮=5 ∶2 ∶3)，溶劑組后背涂抹無TCE等體積比的橄欖油同丙酮混合液；第17、19天對TCE組和TCE+Tempol組背部涂抹100 μl 30%的TCE(體積比為TCE ∶橄欖油 ∶丙酮=3 ∶2 ∶5)進行激發(fā)處理，溶劑組則涂抹等體積比的橄欖油和丙酮但不含TCE的混合溶液。在第19天末次激發(fā)前30 min給TCE+Tempol組每只小鼠腹腔注射100 mg/kg的Tempol試劑，TCE組和溶劑組則使用等量0.9%氯化鈉溶液代替注射。空白組不作處理。

1.3.2

皮膚致敏評分 在小鼠末次激發(fā)24 h后觀察皮膚致敏狀態(tài)并對其反應給分：皮膚沒有反應不得分，存在小塊紅斑或離散紅斑得1分，有輕度水腫或中度彌漫性紅斑得2分，有嚴重紅斑或水腫評為3分。背部皮膚評分分數(shù)≥1分為致敏小鼠,將TCE組和TCE+Tempol組由此再分作致敏陽性組和致敏陰性組。

1.3.3

肝臟組織采集 小鼠于末次激發(fā)72 h后用水合氯醛腹腔注射麻醉后眼靜脈取全血，頸部脫臼法處死小鼠剖取肝臟。取每只小鼠相同位置的肝臟組織，部分存放在4%多聚甲醛溶液里固定，制成石蠟切片進行小鼠肝臟組織的病理學變化以及相關炎癥指標的檢測，其余分裝于-80 ℃保存，用于后續(xù)檢測。

1.3.4

TBA法檢測MDA含量 稱取50 mg肝組織加入450 μl 0.9%氯化鈉溶液后勻漿， 4 ℃、12 000 r/min離心10 min取上清液。MDA檢測按說明書操作：準備空白管、標準管、測定管、對照管，向標準管中加入0.1 ml的10 nmol/ml標準品，向空白管加0.1 ml無水乙醇，測定管和對照管各加0.1 ml測試樣品，4個離心管均加0.1 ml試劑一，將4管溶液各自搖晃混勻；給4個離心管分別加入3.0 ml試劑二；對照管加1.0 ml 50%乙酸，其余3管均加1.0 ml試劑三；用封口膜給所有離心管封口再用針頭在膜上刺孔，放入95 ℃水中孵育40 min，冰水中快速降溫至室溫，4 000 r/min離心10 min，取上清液，1.0 cm光徑，三蒸水校準后于532 nm波長測各管吸光度值，BCA法測定上清液蛋白濃度，計算得MDA含量。

1.3.5

肝臟組織HE檢查 用固定于4%多聚甲醛溶液中的肝臟石蠟包埋處理，制成4 μm厚薄片，經(jīng)由二甲苯和乙醇梯度脫蠟后，流水沖洗水化。PBS清洗后滴加蘇木精染色3 min后水沖洗4 min,再用伊紅染色1 min,流水沖洗后烤干，封片。光學顯微鏡觀測組織病理損傷情況。

1.3.6

血清AST、ALT測定 將小鼠血清分離后按照AST、ALT試劑盒說明書進行實驗，先制作標準曲線再加樣于96孔板，孵育后使用酶標儀在510 nm波長處檢測吸光度值(optical density，OD)，應用標準曲線分析得AST、ALT活力值。

1.3.7

免疫組化檢測肝臟中IL-22和IL-2表達 將4 μm厚石蠟切片放入烤片機中98 ℃烤片20 min，依濃度高低從二甲苯到乙醇完成脫蠟和水化，經(jīng)流水及PBS清洗，HO除去內源性生物素，PBS洗后加枸櫞酸鈉在微波爐中熱抗原修復，后自然冷卻，PBS洗后加山羊血清于恒溫箱內封閉，加對應一抗(IL-22抗體或IL-2抗體)，存放在4 ℃冰箱過夜，隔日拿出后恢復至室溫再PBS清洗，滴加二抗(山羊抗小鼠/兔IgG聚合物)，放37 ℃ 恒溫箱中15 min，PBS清洗后加辣根過氧化物酶試劑于37 ℃汽浴15 min，取出用PBS洗滌后加DAB著色，流水灌洗后蘇木精染核，水洗去多余殘液，烤干封片，顯微鏡下觀察并拍片，用Image Pro plus進行處理，測定OD。

1.3.8

Western blot檢測IL-22和IL-2蛋白水平 RIPA加PMSF提取肝臟總蛋白后經(jīng)BCA法檢測肝臟總蛋白濃度，蛋白液待濃度變性后取20 μg成品上樣，SDS-PAGE電泳分離，轉膜，牛奶封閉，加入相應抗體IL-22(1 ∶1 000)、IL-2(1 ∶1 000)及β-actin(1 ∶1 000)孵育過夜，洗滌后加入對應的兔來源二抗和小鼠來源二抗(1 ∶5 000)室溫反應2 h。洗滌后加入1 ∶1配成的ECL化學發(fā)光試劑經(jīng)化學發(fā)光成像系統(tǒng)成像，用Image Pro Plus 6.0軟件將目的蛋白條帶與內參蛋白條帶進行比較判斷各組IL-22和IL-2蛋白相對表達水平。

2 結果

2.1 小鼠致敏評分結果

空白組與溶劑組小鼠背處皮膚皆無異常。TCE組和TCE+Tempol組小鼠致敏率分別為40.0%和33.3%，差異無統(tǒng)計學意義(

P

>0.05)，見表1。

表1 小鼠背部皮膚致敏評分[ n(%)]

2.2 肝臟組織MDA含量

致敏陰性組、溶劑組與空白組小鼠相比，肝組織中MDA含量無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義。同溶劑組及致敏陰性組比較，TCE致敏陽性組和TCE+Tempol致敏陽性組小鼠肝組織中MDA含量均有上升，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)；同時與TCE致敏陽性組相比，TCE+Tempol致敏陽性組含量有下降，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05，

F

=50.33，

P

=0.017 6)。見圖1。

圖1 肝臟組織中MDA含量A:空白組; B:溶劑組; C:TCE致敏陽性組；D:TCE致敏陰性組;E: TCE+Tempol致敏陽性組；F: TCE+Tempol致敏陰性組；與溶劑組比較: *P<0.05；與致敏陰性組比較: #P<0.05；與TCE+Tempol致敏陽性組比較:△P<0.05

2.3 肝臟HE檢測結果

空白組、溶劑組、致敏陰性組小鼠肝組織均未見明顯異常。TCE致敏陽性組小鼠肝細胞存在明顯空泡樣變性，胞質呈現(xiàn)疏松狀態(tài)且細胞有水腫表現(xiàn)，而TCE+Tempol致敏陽性組表現(xiàn)為部分區(qū)域有水腫的肝細胞，面積有所減少，較TCE致敏陽性組肝損傷有減輕。見圖2。

圖2 小鼠肝臟HE染色 ×400A:空白組；B:溶劑組；C:TCE致敏陽性組；D:TCE致敏陰性組；E: TCE+Tempol致敏陽性組；F: TCE+Tempol致敏陰性組

2.4 血清AST、ALT含量

致敏陰性組、溶劑組與空白組小鼠相比AST、ALT含量無統(tǒng)計學意義。與溶劑組、致敏陰性組比較，致敏陽性組小鼠血清內AST、ALT水平均上調；同時與TCE致敏陽性組相比，TCE+Tempol致敏陽性組小鼠的AST、ALT水平有所下調，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05 )。見圖3。

圖3 血清AST、ALT水平A:空白組；B:溶劑組；C:TCE致敏陽性組；D:TCE致敏陰性組；E: TCE+Tempol致敏陽性組；F: TCE+Tempol致敏陰性組；與溶劑組比較:*P<0.05；與致敏陰性組比較:#P<0.05；與TCE+Tempol致敏陽性組比較:△P<0.05

2.5 肝臟IL-22、IL-2免疫組化結果

致敏陰性組、溶劑組與空白組小鼠相比IL-22和IL-2蛋白沉積量差異無統(tǒng)計學意義。致敏陽性組小鼠肝組織 IL-22和IL-2表達量皆高于溶劑及致敏陰性組，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05); 較TCE致敏陽性組，TCE+Tempol致敏陽性組小鼠IL-22和IL-2沉積量下調，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)。見表2,圖4、5。

圖4 小鼠肝臟中IL-22表達水平 DAB×400A: 空白組；B:溶劑組；C:TCE致敏陽性組；D:TCE致敏陰性組；E: TCE+Tempol致敏陽性組；F: TCE+Tempol致敏陰性組

表2 小鼠肝臟IL-22和IL-2蛋白表達含量的IHC評分

2.6 肝臟IL-22和IL-2蛋白表達結果

致敏陰性組、溶劑組與空白組相比IL-22和IL-2條帶灰度值差異均無統(tǒng)計學意義(

P

>0.05)；致敏陽性組小鼠IL-22和IL-2蛋白含量與溶劑組和致敏陰性組相比均有明顯增加，且TCE+Tempol致敏陽性組蛋白表達水平低于TCE致敏陽性組，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)，與IHC結果一致。見圖6。

圖6 肝臟組織中IL-22和IL-2蛋白含量變化A:空白組；B:溶劑組；C:TCE致敏陽性組；D:TCE致敏陰性組；E: TCE+Tempol致敏陽性組；F: TCE+Tempol致敏陰性組；與溶劑組比較:*P<0.05；與致敏陰性組比較:#P<0.05；與TCE+Tempol致敏陽性組比較:△P<0.05

3 討論

目前，OMLDT的發(fā)病機制不明確，多數(shù)學者認為其屬于Ⅳ型變態(tài)反應，但其還可能與Ⅱ、Ⅲ型變態(tài)反應有關。課題組前期研究表明，TCE可引起致敏豚鼠肝損傷，其中肝臟的MDA與超氧化物歧化酶(SOD)表達水平明顯升高，提示氧化應激在TCE致敏肝損傷中發(fā)揮作用。同樣，在Balb/c致敏小鼠中也表明腎臟損傷和氧化應激相關。有研究表明多種自身免疫性疾病與TCE 的暴露相關，包括自身免疫性肝炎可能因機體產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species, ROS)導致。氧化應激水平上升后，ROS可通過上下游聯(lián)合反應導致機體失衡損傷。

圖5 小鼠肝臟中IL-2表達水平 DAB×400A:空白組；B:溶劑組；C:TCE致敏陽性組；D:TCE致敏陰性組；E: TCE+Tempol致敏陽性組； F: TCE+Tempol致敏陰性組

氧化應激(oxidative stress，OS)是機體氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)，過氧化導致中性粒細胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物從而帶來負作用。Tempol是一種氧化還原循環(huán)的一氧化氮和可透過膜的抗氧化劑，具有清除過氧化氫誘導的細胞內ROS的能力，并增加了SOD與過氧化氫酶這類抗氧化蛋白的表達水平，通過在細胞中提供更多的NADPH來增加細胞內谷胱甘肽進而去除ROS，降低氧化應激水平。研究顯示Tempol可通過降低氧化應激水平來減輕肝臟炎癥，提示氧化應激水平與機體內肝臟炎癥有重要關聯(lián)。因此，該實驗通過腹腔注射抗氧化劑Tempol，以研究 TCE 致敏小鼠肝臟損傷的機制。結果表明，TCE組和TCE+Tempol組小鼠致敏率相比差異無統(tǒng)計學意義，各組小鼠肝臟病理檢測表明，TCE致敏陽性組小鼠肝細胞有明顯的空泡樣變性，有水腫表現(xiàn)，胞質呈現(xiàn)疏松狀態(tài)，而TCE+Tempol致敏陽性組肝細胞有部分區(qū)域存在水腫狀況，面積較少，肝臟損傷有所減輕。提示Tempol對TCE致免疫性肝損傷有保護意義，但其機制尚不清楚。

藥疹患者和肝炎患者血清中IL-22表達水平均有所升高，治療后均有下調表現(xiàn)。體外實驗顯示，TCE及其氧化代謝產(chǎn)物三氯乙酸和二氯乙酸顯著活化T細胞增加IL-2分泌以及T細胞CD25和CD69的表達，動物實驗也表明TCE致敏小鼠皮膚中有IL-2大量沉積。IL-22屬于IL-10細胞因子家族，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種免疫介質，而且是唯一一種由免疫細胞產(chǎn)生但不作用于免疫系統(tǒng)的白介素。IL-22所處環(huán)境、本身濃度以及發(fā)揮作用的時間將聯(lián)合決定其是產(chǎn)生保護作用還是促炎癥作用。研究表明，IL-22可以磷酸化肝臟的STAT3,抑制肝臟氧化，同時IL-22也可促使乙醛誘導的肝星狀細胞內Nrf2核轉位，增強抗氧化軸Nrf2-Keap1-ARE活性進一步減輕機體氧化水平；IL-22還可通過自噬途徑降低大鼠胰島細胞內ROS含量；也有實驗表明，IL-22可以通過減少ROS累積，緩解線粒體功能障礙和減輕NLRP3炎性小體活化來改善腎損傷。這些說明IL-22與機體氧化應激相關。IL-2作為一種細胞生長因子在細胞調節(jié)中發(fā)揮著不可替代的作用，誘導T細胞增殖分化的同時也起到增強機體免疫監(jiān)視功能的作用。研究表明，IL-2可維持機體免疫常態(tài),同時也能保持Treg細胞穩(wěn)態(tài)和其產(chǎn)生的耐受性免疫,故具有雙向免疫調節(jié)作用。ROS的蓄積可以上調IL-2表達，而IL-2是作為T淋巴細胞活化的第三信號，T細胞活化后又能調節(jié)下游氧化應激水平。整體動物實驗表明，

D

-半乳糖介導小鼠過氧化損傷引起IL-2水平顯著升高；同時也有研究表明過度氧化應激能增加血清和細胞培養(yǎng)液中IL-2表達，提示IL-2能與機體氧化應激互相調節(jié)。該研究結果顯示，致敏陽性組小鼠肝臟組織IL-22和IL-2表達量皆高于空白組、溶劑組及致敏陰性組(

P

<0.05)，TCE+Tempol致敏陽性組肝組織IL-22和IL-2表達量較TCE致敏陽性組有所下調(

P

<0.05)。提示TCE誘導的肝損傷過程中IL-22和IL-2表達增加，抑制機體氧化應激水平而減少IL-22和IL-2表達可能緩解TCE導致的免疫性肝損傷。

該研究提示氧化應激可能通過影響IL-22和IL-2的表達參與了TCE引起的免疫性肝臟損傷，降低氧化應激水平對其具有一定的保護作用。但氧化應激調節(jié)IL-22和IL-2的表達機制以及介導肝損傷的具體機制尚未闡明，還需進行深入研究。