岳朝馳,楊向東,李 俊,陳小朝,李遠(yuǎn)志

(1. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 瀘州 646000;2. 成都肛腸專科醫(yī)院/中國PPH培訓(xùn)中心，四川 成都 610015 )

潰瘍性結(jié)腸炎是炎癥性腸病的一種類型，患者主要表現(xiàn)為腹瀉、黏液或膿血便、腹痛、里急后重等，病程容易遷延，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降，給患者帶來巨大痛苦并且給社會帶來很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。該病病因不明，確切發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，世界衛(wèi)生組織(WHO)已將其列為現(xiàn)代難治病的行列，因此尋找其發(fā)病機(jī)制和防治手段迫在眉睫。 目前對潰瘍性結(jié)腸炎的主流治療藥物是西藥氨基水楊酸、免疫抑制劑及糖皮質(zhì)激素，短期治療可改善癥狀，但長期應(yīng)用不良反應(yīng)大，停藥易反復(fù)。而新型生物制劑等分子靶向藥物因其療程長、價(jià)格昂貴等原因，目前在我國廣泛推廣應(yīng)用不現(xiàn)實(shí)[2]。傳統(tǒng)中醫(yī)中藥治療潰瘍性結(jié)腸炎有一定優(yōu)勢，可降低復(fù)發(fā)率[3-4]。槐花是一味傳統(tǒng)中藥，是豆科植物槐(SophorajaponicaL.)的花和干燥的花蕾，具有涼血止血、清瀉血分熱的功效，其提取物具有抗氧化作用[5]。蘆丁是槐花的有效成分之一，其可以提高毛細(xì)血管穩(wěn)定性，降低毛細(xì)血管通透性，可用于高血壓、血小板減少性紫癜、腦出血等疾病的防治[6]。本實(shí)驗(yàn)觀察了蘆丁對潰瘍性結(jié)腸炎的干預(yù)作用，并探討了其作用機(jī)制是否與NLRP3炎癥小體有關(guān)，旨在為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1動物 SPF級C57BL/6J雄性小鼠60只，購買于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司，體質(zhì)量(20.2±2)g，動物合格證號：SCXK(川)2018-37。分籠飼養(yǎng)，每籠10只。飼養(yǎng)環(huán)境：SPF動物房內(nèi)中央空調(diào)持續(xù)通風(fēng)，維持室溫22～26 ℃，相對濕度50%～65%，白天(6:00—18:00)保持日光燈照明，夜間(18:00—次日6:00)關(guān)燈。

1.2藥品與試劑 蘆丁(蕓香苷，純度>98%)，美國Sigma公司；美沙拉嗪緩釋顆粒(商品名：艾迪莎)，上海愛的發(fā)制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20143164；葡聚糖硫酸鈉(DSS，相對分子量40 000),美國Sigma公司；白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)試劑盒(小鼠ELISA)，中國欣博盛生物科技有限公司；白細(xì)胞介素-18(IL-18)試劑盒(小鼠ELISA)，中國欣博盛生物科技有限公司；BCA蛋白濃度試劑盒,美國PIERCE公司； 預(yù)染蛋白分子marker，美國MBI公司；PVDF膜，美國MILLIPORE公司；內(nèi)參β-actin單克隆(兔抗小鼠)抗體，CST公司；NLRP3單克隆(兔抗小鼠)抗體，CST公司；Cleaved caspase-1單克隆(兔抗小鼠)抗體，CST公司；Cleaved IL-1β單克隆(兔抗小鼠)抗體，CST公司；HRP標(biāo)記(山羊抗兔)抗體,中國碧云天公司。

1.3儀器設(shè)備 垂直電泳儀(美國伯樂公司)；電轉(zhuǎn)膜儀(美國伯樂公司)；qRT-PCR儀(加拿大楓嶺公司)；Gel Doc 1000 凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)；分光光度儀(德國Sartorious公司)；水平搖床(美國Thermo公司)；光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.4分組、造模及干預(yù) 采用隨機(jī)平行對照法將60只小鼠分為空白組、模型組、美沙拉嗪組和蘆丁高、中、低劑量組，每組10只?？瞻捉M不造模，其余組均制備潰瘍性結(jié)腸炎模型：將DSS溶入蒸餾水配制成3%DSS溶液(每日現(xiàn)配現(xiàn)用)，每天及時更換，不能出現(xiàn)明顯渾濁，自由飲用5 d，每日統(tǒng)計(jì)小鼠飲用量。于造模當(dāng)天開始，蘆丁高、中、低劑量組分別給予100 mg/(kg·d)、50 mg/(kg·d)、25 mg/(kg·d)蘆丁溶液(1%羧甲基纖維素鈉作為溶劑)灌胃， 美沙拉嗪組給予美沙拉嗪緩釋顆粒灌胃[小鼠用量(g/kg)=人每天口服藥量(g)×0.002 6/0.02 kg]，空白組、模型組給予等體積1%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃，均連續(xù)5 d。

1.5檢測指標(biāo)及方法

1.5.1疾病活動度(DAI)評分 每天用電子天平稱量小鼠體質(zhì)量，觀察小鼠的糞便性狀(軟便、糊狀便或稀水便)，用聯(lián)苯胺法檢測大便隱血情況。根據(jù)小鼠糞便和體質(zhì)量變化情況完成DAI評分，0分：體質(zhì)量無下降，大便性狀正常，無肉眼血便，大便隱血陰性；1分：體質(zhì)量下降1%～5%，大便松散，大便隱血陽性；2分：體質(zhì)量下降5%～10%，軟便，大便隱血陽性；3分：體質(zhì)量下降10%～15%，糊狀便，大便隱血陽性；4分：體質(zhì)量下降>15%，水樣便，肉眼血便。

1.5.2組織病理學(xué)HE染色觀察和組織學(xué)評分 實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死各組小鼠，多聚甲醛固定小鼠結(jié)腸組織24 h，常規(guī)包埋切片后HE染色。每張HE染色切片隨機(jī)選擇3個視野進(jìn)行組織學(xué)評分，觀察黏膜完整性，腸壁是否水腫，炎細(xì)胞尤其淋巴細(xì)胞浸潤情況，是否存在隱窩炎和隱窩膿腫，計(jì)算杯狀細(xì)胞數(shù)量，觀察病變是否穿透黏膜層并累及肌層。由2位病理科?？漆t(yī)師依據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)，按雙盲原則評分，取其平均值。 0分：無炎癥和隱窩損害；1分：輕度炎癥，累及黏膜層，約1/3隱窩受損，損傷面積1%～25%；2分：中度炎癥，累及黏膜層和黏膜下層，約2/3隱窩受損，損傷面積26%～50%；3分：重度炎癥，累及黏膜全層，隱窩缺失、表面上皮存在，損傷面積51%～75%；4分：隱窩及表面上皮均缺失，損傷面積76%～100%。

1.5.3外周血清和結(jié)腸組織中IL-1β和IL-18水平 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后麻醉小鼠，眼眶采血法取血約2 mL，2 000 r/min離心20 min，收集上清，按組分裝標(biāo)記后放置于-20 ℃冰箱備用。取3 mm×1 mm×1 mm結(jié)腸組織放入組織勻漿器中，加入適量PBS冰上研磨后于低溫離心機(jī)中12 000×g離心20 min，取上清液按小鼠組別分裝標(biāo)記后放置-80 ℃?zhèn)溆?。按ELISA試劑盒說明書檢測血清和結(jié)腸組織勻漿上清液中IL-1β和IL-18水平。

1.5.4結(jié)腸組織中NLRP3和IL-1 βmRNA表達(dá)量通過試劑盒提取小鼠結(jié)腸組織mRNA，采用qRT-PCR檢測各組小鼠結(jié)腸組織中NLRP3和IL-1β mRNA相對表達(dá)量。采用Primer5軟件設(shè)計(jì)目的基因NLRP3、IL-1β和內(nèi)參基因β-actin的上游引物和下游引物：NLRP3上游引物為5’- AGAAGAGACCACGGCAGAAAG -3’，下游引物為5’-CTTGGAACCAGGTTGAGTGT-3’；IL-1β上游引物為5’-GTCTTTCCCGTGACCTTC- 3’,下游引物為5’-ATCTCGGAGCCTGTTAGTGC-3’；β-actin上游引物為5’-ACCTCTATGCCAACACAGTG-3’，下游引物為5’-GGACTCATCGTACTCCTGCT-3’。于FTC2000實(shí)時熒光定量PCR儀內(nèi)進(jìn)行實(shí)時定量PCR擴(kuò)增，目的基因與內(nèi)參基因循環(huán)閾值的差異為目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA的相對表達(dá)量,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.5結(jié)腸組織中NLRP3、Cleaved caspase-1、Cleaved IL-1β蛋白表達(dá)水平 采用Western blot法檢測：提取小鼠結(jié)腸組織蛋白樣本，BCA法檢測蛋白濃度，蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳后，經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、封閉、一二抗孵育，凝膠成像儀顯影。分析各組目的蛋白NLRP3、Caspase1、IL-1β條帶灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值的比值(蛋白表達(dá)相對灰度值),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠一般情況和DAI評分比較 模型組小鼠造模第2天開始出現(xiàn)懶動，體毛凌亂和精神萎靡，其中2只小鼠出現(xiàn)大便隱血陽性；造模3 d后，小鼠開始出現(xiàn)明顯腹瀉、大便隱血或血便、體質(zhì)量逐步減輕等臨床癥狀。蘆丁高、中劑量組和美沙拉嗪組小鼠也出現(xiàn)了潰瘍性結(jié)腸炎臨床表現(xiàn)，但程度較模型組輕。造模第5天，空白組、模型組、美沙拉嗪組和蘆丁高、中、低劑量組DAI評分分別為0分、(3.92±0.64)分、(1.42±0.24)分、(1.53±0.45)分、(2.45±0.52)分、(3.33±0.43)分，模型組明顯高于空白組(P<0.05)，蘆丁高、中劑量組和美沙拉嗪組均明顯低于模型組(P均<0.05)，蘆丁高劑量組和美沙拉嗪組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2各組小鼠結(jié)腸病理組織病理表現(xiàn)及組織學(xué)評分比較 HE染色光鏡下見空白組小鼠結(jié)腸組織黏膜正常；模型組小鼠結(jié)腸組織黏膜明顯充血、水腫，有糜爛脫落、重度糜爛和多個呈圓形或橢圓形的潰瘍，潰瘍邊緣充血水腫，周圍炎細(xì)胞浸潤；美沙拉嗪組和蘆丁高、中、低劑量組小鼠結(jié)腸組織病變輕于模型組，以美沙拉嗪組和蘆丁高劑量組顯著，見圖1?？瞻捉M、模型組、美沙拉嗪組和蘆丁高、中、低劑量組組織學(xué)評分分別為(0.49±0.25)分、(3.32±0.82)分、(1.02±0.34)分、(1.13±0.48)分、(1.87±0.24)分、(2.83±0.63)分，模型組明顯高于空白組(P<0.05)，蘆丁高、中劑量組和美沙拉嗪組均明顯低于模型組(P均<0.05)，蘆丁高劑量組和美沙拉嗪組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織HE染色表現(xiàn)(×100)

2.3各組小鼠外周血和結(jié)腸組織中IL-1β和IL-18水平 模型組小鼠血清和結(jié)腸組織中IL-1β和IL-18水平均明顯高于空白組(P均<0.05)，蘆丁高、中、低劑量組和美沙拉嗪組均明顯低于模型組(P均<0.05)，且蘆丁高劑量組均明顯低于美沙拉嗪組(P均<0.05)。見圖2。

圖2 各組小鼠外周血和結(jié)腸組織中IL-1β和IL-18水平

2.4各組小鼠結(jié)腸組織中NLRP3和IL-1β mRNA表達(dá)量比較 模型組小鼠結(jié)腸組織中NLRP3和IL-1β mRNA表達(dá)量均明顯高于空白組(P均<0.05)，蘆丁高、中劑量組和美沙拉嗪組均明顯低于模型組(P均<0.05)，且蘆丁高劑量組均明顯低于美沙拉嗪組(P均<0.05)。見圖3。

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織中NLRP3和IL-1β mRNA表達(dá)量

2.5各組小鼠結(jié)腸組織中NLRP3、Cleaved caspase-1和Cleaved IL-1β蛋白表達(dá)水平比較 模型組小鼠結(jié)腸組織中NLRP3、Cleaved caspase-1和Cleaved IL-1β蛋白表達(dá)水平均明顯高于空白組(P均<0.05)，蘆丁高、中劑量組和美沙拉嗪組均明顯低于模型組(P均<0.05)，且蘆丁高劑量組均明顯低于美沙拉嗪組(P均<0.05)。 見圖4及圖5。

圖4 各組小鼠結(jié)腸組織中NLRP3、Cleaved caspase-1和Cleaved IL-1β 蛋白表達(dá)條帶

圖5 各組小鼠結(jié)腸組織中NLRP3、Cleaved caspase-1和Cleaved IL-1β 蛋白表達(dá)水平

3 討 論

潰瘍性結(jié)腸炎主要表現(xiàn)為彌漫性連續(xù)性分布的慢性非特異性炎癥和潰瘍，可累及遠(yuǎn)端結(jié)腸黏膜，也可向近端結(jié)腸發(fā)展。多數(shù)潰瘍性結(jié)腸炎反復(fù)發(fā)作并呈慢性發(fā)展，部分患者有累及結(jié)節(jié)性紅斑、眼葡萄膜炎、外周關(guān)節(jié)炎等腸外表現(xiàn)。潰瘍性結(jié)腸炎患者后期因營養(yǎng)不良可出現(xiàn)貧血、低蛋白血癥、體質(zhì)量減輕等表現(xiàn)，甚至?xí)l(fā)下消化道大出血、腸穿孔、中毒性巨結(jié)腸等嚴(yán)重并發(fā)癥，需及時采取外科手術(shù)治療[7-8]。

中醫(yī)沒有潰瘍性結(jié)腸炎的病名，《黃帝內(nèi)經(jīng)》中記載了“腸澼”，并有“下白沫”“下膿血”等描述，這與潰瘍性結(jié)腸炎的急性期癥狀一致。《傷寒雜病論》中記載“下利已差，至其年、月、日、時復(fù)發(fā)者，以病不盡故也”，這與潰瘍性結(jié)腸炎反復(fù)發(fā)作、病情纏綿、遷延不愈的病情特點(diǎn)一致。目前大量研究表明中西醫(yī)結(jié)合長期治療可改善潰瘍性結(jié)腸炎患者的臨床癥狀，降低復(fù)發(fā)率[4]。

槐花作為藥物始載于《日華子本草》，至今已有上千年的藥用歷史。明代《本草原始》中記載“腸風(fēng)瀉血赤白痢并炒研服，涼大腸炒香”；《炮炙大法》指出槐花“若止血，炒黑”?，F(xiàn)代藥物研究顯示，槐花含有黃酮、鞣質(zhì)、氨基酸、植物甾類、烯酸及微量元素等多種有效成分，并鑒定出蘆丁為槐花的主要藥理成分[6]。蘆丁可誘導(dǎo)血小板集聚，縮短凝血時間，有一定的抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗衰老、抗輻射、抗病毒和提高免疫力等作用，且毒性低[9]。目前，槐花一般以蘆丁作為定量的標(biāo)準(zhǔn)。故本實(shí)驗(yàn)選擇蘆丁進(jìn)行研究，結(jié)果顯示蘆丁高、中劑量組小鼠臨床表現(xiàn)較模型組輕，DAI評分明顯低于模型組；HE染色顯示，蘆丁各劑量組小鼠炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，結(jié)腸的架構(gòu)修復(fù)完整，沒有明顯潰瘍，且蘆丁高、中劑量組組織學(xué)評分明顯低于模型組。上述結(jié)果提示蘆丁對潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠具有一定的治療作用。

目前研究認(rèn)為，IL-1β可廣泛調(diào)節(jié)各類炎癥細(xì)胞趨化浸潤，其水平與潰瘍性結(jié)腸炎活動性呈明顯的正相關(guān)性，抑制IL-1β與受體結(jié)合可以減輕潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠的腸道炎癥和臨床癥狀[10]。與IL-1β類似，IL-18同樣是NLRP3炎癥小體信號下游重要的靶蛋白，NLRP3炎性小體活化可誘導(dǎo)IL-18成熟和分泌，導(dǎo)致炎性損傷[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠血清和結(jié)腸組織中IL-1β和IL-18水平均明顯高于空白組，蘆丁高、中、低劑量組和美沙拉嗪組均明顯低于模型組，且蘆丁高劑量組更低。提示IL-1β和IL-18屬于致病性炎癥介質(zhì)，與結(jié)腸局部及全身炎癥狀態(tài)、腸黏膜潰瘍出血等正相關(guān)；蘆丁可抑制IL-1β和IL-18成熟和釋放，阻斷其介導(dǎo)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)而減輕潰瘍性結(jié)腸炎病情。

NLRP3炎性小體活化與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病密切相關(guān)[12]。相關(guān)動物模型研究發(fā)現(xiàn)，相較于野生型動物，NLRP3基因敲除/敲降動物對DSS/TNBS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎均更易感，腸道屏障完整性容易被破壞，腸上皮細(xì)胞增殖能力減弱和黏膜損傷程度更嚴(yán)重[13]，據(jù)此認(rèn)為NLRP3炎性小體在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病中起保護(hù)作用[14]。然而有些研究認(rèn)為NLRP3炎癥小體活化可誘導(dǎo)腸道黏膜炎癥性損傷，加速潰瘍性結(jié)腸炎的致病，而NLRP3基因敲除或缺陷動物或抑制NLRP3炎癥小體激活可緩解DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎臨床癥狀[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠結(jié)腸組織中NLRP3 mRNA表達(dá)量、IL-1β mRNA表達(dá)量和NLRP3、Cleaved caspase-1、 Cleaved IL-1β蛋白表達(dá)水平均明顯高于空白組，蘆丁高、中劑量組和美沙拉嗪組上述指標(biāo)均明顯降低，且蘆丁高劑量組更低。證明潰瘍性結(jié)腸炎狀態(tài)下NLRP3炎癥小體被激活，蘆丁可抑制NLRP3炎癥小體活化。綜上所述，蘆丁可有效改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥損傷，可能是潰瘍性結(jié)腸炎防治潛在的候選藥物，其作用機(jī)制可能與抑制NLRP3炎癥小體活化有關(guān)。由于條件所限，未繼續(xù)探索蘆丁對NLRP3基因敲除/過表達(dá)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型的作用，有待驗(yàn)證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。