付曉云，張紅燕

(昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

1 延齡草概述

1.1 分類及地位

延齡草(Trillium tschonoskii Maxim)，百合科延齡草屬多年生草本植物, 別名頭頂一顆珠。其味甘，性平，有小毒，以干燥根和根莖入藥(俗稱“地珠”)，或以干燥果實(shí)入藥(俗稱“天珠”)，有鎮(zhèn)靜安神，活血止血，延年益壽的功效，主治外傷出血，頭暈?zāi)垦＃驌p傷等[1]。延齡草屬植物主產(chǎn)于北美，亞洲東部，其中北美有38種，亞洲有11種，我國(guó)有3種，包括延齡草(Trillium tschonoskii Maxim)，吉 林 延 齡 草(Tril-lium kamtschaticum Pall.ex Purch)與西藏延齡草(Trilli-um govanianum Wall.ex Ruyle)，主要分布在西北、東北和西南地區(qū)[2-3]。該屬植物為少常用中藥，歷代本草中鮮有記載，主要在我國(guó)土家族和苗族地區(qū)應(yīng)用較為廣泛，且療效確切[4]。

1.2 化學(xué)成份

查閱文獻(xiàn)報(bào)到，延齡草屬植物的次生代謝主要以皂苷為主，主要為甾體皂苷，按結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可分為I-V類，同時(shí)還有黃酮苷、倍半萜苷、苯丙素苷等類型的化合物[5]；除此之外，還有鞣質(zhì)類、腺苷類和多糖類等活性物質(zhì)[19]?？傮w來(lái)說(shuō)，國(guó)內(nèi)外對(duì)延齡草的研究較少，尤其是關(guān)于多糖類活性成份。

1.3 資源與利用狀況

由于環(huán)境因素、人為因素，加之該屬植物種子休眠期長(zhǎng)，發(fā)芽率低等自身的生物學(xué)特性，延齡草種屬數(shù)量急劇下降，曾被列為國(guó)家醫(yī)藥管理局管理的二類藥材，國(guó)家三級(jí)保護(hù)植物[5-7]。隨著張國(guó)華等[8]開發(fā)的延齡草栽培技術(shù)，近些年開始了人工種植，資源相對(duì)有所提升，對(duì)其的研究也越來(lái)越深入。

2 延齡草多糖概述

多糖是由10個(gè)或10個(gè)以上的單糖通過(guò)糖苷鍵連接形成的含醛基或酮基的天然高分子聚合物，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物中。多糖作為生命物質(zhì)的組成成分之一，它廣泛參與了細(xì)胞的各種生命現(xiàn)象及生理過(guò)程的調(diào)節(jié)。具有提高免疫，降血糖，抗腫瘤，抗病毒等多種生物活性，被認(rèn)為是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一，是一項(xiàng)很有前景的天然藥物[15-17]。

2.1 延齡草多糖的提取分離

2.1.1 材料預(yù)處理

多糖在植物、動(dòng)物和微生物中均有廣泛分布。不同植物，動(dòng)物和微生物的器官和組成千差萬(wàn)別，多糖提取時(shí)，根據(jù)不同的生物體，選擇不同的預(yù)處理方法。在動(dòng)物類和植物種子中，由于含有大量的蛋白質(zhì)和脂類，提取前一般先用石油醚脫脂或用酶解法除蛋白質(zhì)；植物地上部分因含有大量的葉綠素，提取多糖時(shí)，應(yīng)依次使用石油醚、丙酮、乙酸乙酯和乙醇進(jìn)行脫色素處理；植物的地下根莖中，含有大量的淀粉，在多糖提取前或者提取過(guò)程中，應(yīng)去除植物中所含的淀粉，以免影響多糖的性質(zhì)和得率[19]。高晰等[20]采用10倍量甲醇，回流提取兩次，每次2 h，以去除藥材中的單糖、低聚糖、色素和其他脂溶性成分，同時(shí)消滅酶活性以防止酶對(duì)多糖的降解。

2.1.2 延齡草多糖的提取

多糖在自然界中分布較廣，組成復(fù)雜，其提取、分離方法也各不相同。多糖的提取、分離、純化，必須根據(jù)多糖的理化性質(zhì)、分子量，選擇合適的方法進(jìn)行。多糖的提取方法主要有傳統(tǒng)的提取方法如滲漉法、浸漬法、煎煮法、回流提取法和較現(xiàn)代的提取方法：超聲波提取法、超臨界提取法、酶提取法等。在傳統(tǒng)的提取方法中，其中滲漉法和浸漬法屬于冷提法，適用于對(duì)熱不穩(wěn)定或易被破壞成分的提取。根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)查，延齡草多糖的提取方法主要采用熱水浸提法：徐靜靜等[21]采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化延齡草多糖的熱水浸提工藝，其結(jié)果是：在最佳提取工藝下，延齡草多糖的提取率為6.75%；高晰等[20]采用水提醇沉工藝提取延齡草多糖，其結(jié)果是：在最佳提取條件下，延齡草多糖的得率為4.96%；周濃等[24]應(yīng)用正交設(shè)計(jì)，研究比較回流提取法、熱水浸提法和超聲提取法，結(jié)果表明：回流提取法在最優(yōu)條件下多糖的提取率可達(dá)18.72 mg/g；熱水浸提在最優(yōu)條件下多糖的提取率可達(dá)23.84 mg/g；超聲波提取法在最優(yōu)條件下多糖的提取率可達(dá)24.32 mg/g?？偟膩?lái)說(shuō)，延齡草多糖的提取率為5%左右，較多采用回流提取法。

2.2 延齡草多糖的純化

經(jīng)水提醇沉得到的粗多糖成分復(fù)雜，不僅包含著分子量不同的多糖成分，而且還包含著蛋白質(zhì)，色素，無(wú)機(jī)鹽等物質(zhì)。故在多糖的純化過(guò)程中，要利用有效的手段去除粗多糖中的雜質(zhì)成分。蛋白質(zhì)和多糖同屬?gòu)?qiáng)極性生物大分子，多糖提取液中含有蛋白質(zhì)是一個(gè)普遍現(xiàn)象，因此，去蛋白是多糖分離的一個(gè)重要過(guò)程。植物多糖中游離的蛋白多采用Sevag法，三氯乙酸法和三氟三氯乙烷法，結(jié)合蛋白多采用酶解法[25-26]。但目前對(duì)延齡草多糖的純化報(bào)導(dǎo)較少，只有對(duì)同屬植物重樓多糖的研究報(bào)導(dǎo)。申世安等[19]采用Sevag法研究了重樓多糖中蛋白質(zhì)的去除，其最佳次數(shù)為3次，此時(shí)蛋白質(zhì)的去除率為74.47%，多糖的損失率為20.88%。

除蛋白后的延齡草多糖仍為復(fù)雜的混合物，需要對(duì)其進(jìn)一步的分離純化。目前，植物多糖的純化常使用不同類型的DEAE-離子交換色譜和葡聚糖凝膠色譜聯(lián)合使用。申世安等[19]采用DEAE-52色譜柱進(jìn)行分離滇重樓多糖后，采用SephadexG-100色譜柱反復(fù)分離純化，并用HPLC上檢測(cè)純度。韓曉強(qiáng)等[27]采用DEAE-52離子交換柱色譜分離五種云南野生食用真菌多糖，之后用不同孔徑的凝膠柱(SephadexG-200、SephadexG-150、SephadexG-100)進(jìn)行分離純化，經(jīng)純度檢測(cè)最終分離得到了六個(gè)均一的多糖。吳向美等[28]也使用同樣的方法純化肉蓯蓉多糖，分離得到17個(gè)均一多糖。綜上表明，使用不同類型的DEAE-離子交換色譜柱和葡聚糖凝膠色譜聯(lián)用法適合植物多糖的純化，為延齡草多糖的純化提供了參考。而小分子物質(zhì)、色素、無(wú)機(jī)鹽等大多采用透析法。

2.3 延齡草多糖的含量測(cè)定

多糖的含量測(cè)定方法主要有比色法：硫酸-咔唑比色法、苯酚硫酸比色法、蒽酮-硫酸比色法、間羥基聯(lián)苯比色法、3,5-二硝基比色法等；色譜法：氣相色譜(GC)法和高效液相色譜(HPLC)法；紅外光譜定量分析多糖方法和紫外分光光度法；此外還有一些新型的測(cè)定方法：共振光散射法(RLS)法和生物傳感器法等。何佩娟等[29]綜述了多糖含量測(cè)定的各種方法，指出在多糖的測(cè)定中，比色法的應(yīng)用較為廣泛。一般常用苯酚硫酸比色法、蒽酮-硫酸比色法，兩種方法均有靈敏度高，結(jié)果較為準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，但都操作復(fù)雜、步驟多且繁瑣、只能測(cè)定多糖總含量，若存在單糖會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生巨大影響。二硝基水楊酸法操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高，在多糖含量的測(cè)定中常被應(yīng)用。光譜法具有操作簡(jiǎn)單，靈敏度和準(zhǔn)確度均相對(duì)較高的優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)儀器設(shè)備有要求。目前，延齡草多糖的含量測(cè)定方法主要使用苯酚硫酸比色法。羅利方等[30]優(yōu)化了苯酚-硫酸法測(cè)延齡草多糖含量，其中苯酚的濃度為5%，用量為1 mL，硫酸用量為6 mL，水浴溫度為沸水浴，水浴時(shí)間25 min，用常溫冷卻法冷卻。其經(jīng)測(cè)定了三批南江縣產(chǎn)延齡草多糖的含量，測(cè)得延齡草中多糖的含量高達(dá)47.98%。為保證延齡草多糖穩(wěn)定、安全和有效用藥提供了數(shù)據(jù)。

2.4 延齡草多糖的結(jié)構(gòu)鑒定

多糖的結(jié)構(gòu)鑒定需要解決單糖的構(gòu)型、單糖的組成(單糖的種類和比例)、糖與糖的連接位置和順序。

2.4.1 延齡草多糖純度和分子量的確定

研究樣品在進(jìn)行分析之前，必須對(duì)樣品進(jìn)行純度分析。多糖是大分子聚合物，即使是純品，其微觀也不均一，僅代表相似鏈長(zhǎng)的多糖分子的平均分布，即一定相對(duì)分子質(zhì)量范圍內(nèi)的多糖的平均分布。測(cè)定多糖分子量的方法有凝膠色譜法、電泳法、超速離心法、旋光度法、滲透壓法以及聯(lián)用技術(shù)等。中藥多糖主要測(cè)定數(shù)均分子量和重均分子量，目前常用體積排阻色譜法(包括凝膠滲透色譜法和高效凝膠滲透色譜法)。2005年版《中國(guó)藥典》Ⅱ部中收載了用高效凝膠滲透色譜法測(cè)定多糖分子量和分子量分布方法[31]。秦建鮮等[32]也綜述了中藥多糖相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定方法，簡(jiǎn)要的歸納分析了各方法的優(yōu)缺點(diǎn)并進(jìn)行了對(duì)比，篩選出了簡(jiǎn)單實(shí)用的多糖相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定方法為高效凝膠滲透色譜法，該方法操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏、重復(fù)性好和樣品用量少，為測(cè)定多糖相對(duì)分子量及分子分布的首選方法。金有權(quán)等[33]用高效凝膠色譜法分析了繡球花多糖，結(jié)果為4個(gè)組分多糖樣品的平均分子量分別為1.49×105、1.25×105、1.01×105、1.37×105。

2.4.2 單糖的組成分析

單糖的組成主要采用完全酸水解法，常用的酸有三氟乙酸、適當(dāng)濃度的硫酸、鹽酸等。水解產(chǎn)物可以用紙色譜或者薄層色譜來(lái)初步分析樣品是否被完全水解以及得到初步的單糖組成信息，然后根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的方法對(duì)單糖的組成進(jìn)行定量和分析。羅利方等[30]采用柱前衍生化HPLC法分析了延齡草多糖中單糖的組成，結(jié)果表明延齡草多糖主要是由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖組成，其摩爾比1.17:2.56:1.53:98.59:1.99:1.0:18.84，但仍有四個(gè)單糖未被指認(rèn)。研究表明延齡草多糖中主要的單糖為葡萄糖，含量高達(dá)36.89%，占總糖的76.88%。多糖中單糖的組成是研究多糖構(gòu)型的重要前提，單糖的連接順序和構(gòu)型等還未有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，而單糖的連接方式主要使用IR、NMR和甲基化等方法。唐韻等[34]通過(guò)熱水提取并通過(guò)Millipore(100 kD)和Sephadex G-200純化從梅葉鱗草獲得多糖，用苯酚-硫酸法測(cè)得多糖含量為89.9%，高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)估計(jì)其平均分子量為2.213×106 Da。單糖分析表明，多糖由阿拉伯糖，甘露糖，葡萄糖和半乳糖組成，摩爾比為2.134:1:2.78:2.82。經(jīng)過(guò)Smith降解，甲基化，紅外光譜和NMR后，鑒定了多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)。

2.5 延齡草多糖的生物活性研究

20世紀(jì)70年代人們發(fā)現(xiàn)了真菌多糖[35]具有抗癌活性，自此人們對(duì)多糖的生物活性有了高度重視，現(xiàn)從中草藥和食用菌中分離得到的多糖已有數(shù)百種，其中為植物多糖最多。由于多糖結(jié)構(gòu)的多樣性和復(fù)雜性，多糖具有多種多樣的得藥理活性。大量的藥理學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)表明，植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)，抗腫瘤，降血脂，抗病毒等功能，且對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒副作用。王益富等[14]探討了百花延齡草水提液對(duì)肝纖維化作用和作用機(jī)制，經(jīng)腹腔注射四氯化碳構(gòu)建雄性C57鼠肝纖維化模型，給藥百花延齡草水提液0.5 g/kg、1 g/kg，陽(yáng)性對(duì)照為扶正化瘀膠囊(0.75 g/kg),經(jīng)生化實(shí)驗(yàn)表明給藥組和陽(yáng)性對(duì)照組均能顯著抑制 CCl4 誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化程度，與模型組相比，給藥組和陽(yáng)性對(duì)照組血清 ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)，AST(天門冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶)水平及肝臟組織中 MDA(丙二醛)水平明顯降低(P<0.01)，SOD 顯著提高(P<0.01); 與模型組相比，給藥組和陽(yáng)性對(duì)照組TGF-β 蛋白表達(dá)具有顯著的抑制作用(P<0.01),表明了白花延齡草水提液對(duì)肝纖維化有顯著的改善作用；孫艷平等[12]研究了延齡草水提液對(duì)小鼠鎮(zhèn)靜催眠作用：主要通過(guò)小鼠直接睡眠法、自主活動(dòng)能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)、與閾下劑量及閾上劑量的戊巴比妥鈉協(xié)同睡眠等實(shí)驗(yàn)方法，結(jié)果表明延齡草提取物能減少小鼠自主活動(dòng)能力和行為，增加由閾下劑量及閾上劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠入睡百分率和睡眠時(shí)間，說(shuō)明了延齡草提取物對(duì)小鼠有一定鎮(zhèn)靜催眠作用。目前，關(guān)于延齡草多糖明確的生物活性尚未報(bào)導(dǎo)。

3 結(jié) 語(yǔ)

延齡草生長(zhǎng)環(huán)境、加工、提取純化方法的不同，導(dǎo)致多糖含量、分子量、單糖組成及摩爾比、連接位置及順序存有一定差異，從而影響多糖的生物活性的強(qiáng)弱。目前，延齡草多糖的提取研究較少，主要還是采用傳統(tǒng)的熱水浸提法，在此基礎(chǔ)上借助超聲和酶輔助提取，一定程度上提高了多糖的提取率，但對(duì)于延齡草多糖的工業(yè)化提取方法仍比較落后粗放。延齡草多糖分離純化過(guò)程主要包括脫蛋白、脫色和不同多糖組分之間的分離，但對(duì)此方面的研究還未有報(bào)導(dǎo)，之后可以考慮借鑒其它多糖純化的新途徑、新思路，如膜分離技術(shù)，膜分離與柱色譜聯(lián)合，以便更高效地獲取精制的延齡草多糖，分離純化后延齡草多糖的分子量、單糖組成研究比較也比較少且不完善，還需進(jìn)一步深入研究。因此，關(guān)于延齡草多糖的研究可以從提取工藝的優(yōu)化、新型技術(shù)在結(jié)構(gòu)分析和含量測(cè)定中的使用等出發(fā)，開發(fā)出提取率高、含量穩(wěn)定的延齡草多糖提取工藝和結(jié)構(gòu)確定、療效確切的分析方法，并且探索出一套可控制其質(zhì)量的質(zhì)量控制方法，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，使其能成為安全、穩(wěn)定、有效和質(zhì)量可控的保健食品和藥品原料。