（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088）

目前我國大陸沿海龍蝦貨源緊缺，產(chǎn)品供不應(yīng)求，需從國外進(jìn)口應(yīng)市[2]。我國目前主要的龍蝦養(yǎng)殖方式是捕撈天然龍蝦苗種進(jìn)行人工養(yǎng)殖，由于自然海區(qū)苗種資源有限，無法滿足養(yǎng)殖的需求，因此開展龍蝦人工繁殖研究勢在必行。波紋龍蝦（Panulirus homarus）隸屬于十足目（Decapoda）腹胚亞目（Pleocyemata）龍蝦科（Palinuroidea）龍蝦屬（Panulirus）[1]，在印度洋和西太平洋均有分布，是我國東南沿海的地方經(jīng)濟(jì)種類。波紋龍蝦具有生長快、個體大等優(yōu)點(diǎn)，波紋龍蝦的人工繁殖具有很高的研究價值和經(jīng)濟(jì)價值。

龍蝦的胚胎發(fā)育是龍蝦生活史中的重要階段之一，也是龍蝦人工繁殖研究中重要的領(lǐng)域之一。龍蝦的人工繁殖研究主要集中在葉狀幼體和成蝦階段[3-5]，對于胚胎發(fā)育關(guān)注較少[1,6]。生態(tài)因子如溫度、鹽度、pH、氨氮和亞硝酸鹽氮對波紋龍蝦胚胎存活的影響尚未見有相關(guān)報道。波紋龍蝦繁殖時胚胎在母體的腹肢剛毛上黏附發(fā)育，發(fā)育時間長達(dá)20～24 d[6]。在胚胎發(fā)育過程中，容易受到細(xì)菌、真菌和原生動物等病原體的侵害，引起部分的胚胎黏污，抵抗力下降甚至死亡等現(xiàn)象發(fā)生。溫度對甲殼類胚胎的影響主要表現(xiàn)為影響胚胎的發(fā)育速度、胚胎的孵化和導(dǎo)致胚胎畸形等，如水溫對中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）的影響表現(xiàn)為在適宜的溫度范圍內(nèi)，溫度越高卵裂越快，但同步率越低[7]；鹽度會影響甲殼類胚胎的孵化率、孵化時間等，如在凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）胚胎孵化中，鹽度由33升至36時孵化率由74.67%降到50.79%[8]；pH會影響甲殼類胚胎存活和孵化時間，如在不適的pH條件下，鋸緣青蟹（Scylla serrata）胚胎的孵化率降低，畸形率升高[9]。而氨氮和亞硝酸鹽氮在水中不斷積累，會使水體不斷惡化，影響?zhàn)B殖生物生長發(fā)育、呼吸代謝，使生物免疫力下降、生理功能紊亂、組織器官受損，甚至引起養(yǎng)殖生物大量死亡。本研究通過探討波紋龍蝦胚胎對溫度、鹽度、pH、氨氮和亞硝酸鹽氮五種生態(tài)因子的耐受能力，以期為人工繁育提供理論依據(jù)，并為龍蝦胚胎發(fā)育的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗龍蝦胚胎 本實(shí)驗采用的波紋龍蝦抱卵親蝦購自湛江市霞山區(qū)水產(chǎn)品批發(fā)市場，暫養(yǎng)于廣東海洋大學(xué)東海島基地室內(nèi)1 m3的塑料圓桶中，桶內(nèi)設(shè)置人工掩體，桶表面覆蓋黑色遮陽膜。于溫度（30±0.5） ℃，鹽度30，pH（8.10±0.1）和溶解氧（DO）為（5.0±0.5）mg/L條件下暫養(yǎng)3 d后，待抱卵親蝦穩(wěn)定，對波紋龍蝦胚胎進(jìn)行離體手術(shù)，用20 mL/m3甲醛溶液消毒20 s。通過光學(xué)顯微鏡下觀察，選擇表面潔凈光滑不黏污，附肢清晰的胚胎進(jìn)行實(shí)驗。

1.1.2實(shí)驗用水準(zhǔn)備 實(shí)驗用水為自然海區(qū)海水，溫度為（30±0.5） ℃，鹽度為30，pH為（8.10±0.1），DO為（5.0±0.5）mg/L。經(jīng)過沉淀、砂濾和孔徑5 μm過濾袋過濾，用20 mL/m3甲醛溶液消毒24 h后充分曝氣。

溫度、鹽度和pH驟變適應(yīng)性實(shí)驗分別根據(jù)實(shí)驗要求調(diào)節(jié)實(shí)驗用海水。溫度設(shè)置5個梯度，分別為15、20、25、30（對照組）和35 ℃，用水浴鍋增溫和冰塊降溫方法調(diào)節(jié)，實(shí)驗開始前連續(xù)監(jiān)測以保證水溫在實(shí)驗過程中的波動小于0.5 ℃。鹽度設(shè)置8個梯度：10、15、20、25、30（對照組）、35、40和45，用人工速溶海水晶和經(jīng)20 mL/m3甲醛消毒曝氣的淡水進(jìn)行調(diào)節(jié)。pH設(shè)置8個梯度：6.0、6.5、7.0、7.5、8.0（對照組）、8.5、9.0和9.5，用HCl或NaOH進(jìn)行調(diào)節(jié)。

1.1.3實(shí)驗藥品 實(shí)驗用氯化銨和亞硝酸鈉均為分析純試劑（廣州化學(xué)試劑廠），實(shí)驗前先用蒸餾水配制成母液，再根據(jù)實(shí)驗具體要求配制成不同濃度的溶液。

1.2 方法

1.2.1溫度、鹽度和pH驟然變化實(shí)驗 驟變實(shí)驗即將自然海區(qū)條件（溫度30 ℃，鹽度30，pH 8.0，作為對照組）下的胚胎分別放置于溫度、鹽度和pH的實(shí)驗梯度溶液中，其瞬間變化幅度大。實(shí)驗采用封閉靜水的方法，將配制好實(shí)驗條件的溶液注滿體積為1 L的一次性塑料餐盒，放置30粒復(fù)眼色素形成期胚胎后密封。每12 h及時清除死卵及更換一次溶液，以保持溶解氧在5 mg/L以上，同時能保證這3種生態(tài)因子維持在實(shí)驗要求梯度。設(shè)定12、24、48、72 h 這4個觀察時間點(diǎn)，觀察統(tǒng)計存活胚胎數(shù)量，求出各個時間點(diǎn)胚胎的存活率。每組實(shí)驗設(shè)置3個平行組。

1.2.2溫度、鹽度和pH逐漸變化實(shí)驗 漸變實(shí)驗即以自然海區(qū)條件為起始梯度（溫度30 ℃，鹽度30，pH 8.0，作為對照組），將溫度漸變實(shí)驗的溶液每24 h升高或降低1 ℃，鹽度漸變實(shí)驗按照鹽度每24 h升高或降低2，pH漸變實(shí)驗按照pH值每24 h升高或降低2，以此速度使胚胎逐漸過渡適應(yīng)。實(shí)驗以30粒膜內(nèi)無節(jié)幼體期胚胎為材料，每24 h觀察統(tǒng)計胚胎死亡情況，及時清除死卵并換水。實(shí)驗設(shè)置3個平行組。

1.2.3氨氮和亞硝酸鹽氮毒性預(yù)實(shí)驗 按照毒理學(xué)實(shí)驗方法，分別確定氨氮和亞硝酸鹽氮96 h胚胎100%死亡的濃度和100 %存活的濃度，再設(shè)置不同的濃度梯度正式實(shí)驗。

1.2.4氨氮毒性實(shí)驗 實(shí)驗采用封閉靜水的方法，根據(jù)預(yù)實(shí)驗結(jié)果，總氨氮含量按照等對數(shù)間距設(shè)置10.00、14.95、22.36、33.44和50.00 mg/L 5個梯度及空白對照組。將配制好的溶液注入1 L容器之后放置30粒復(fù)眼色素形成期胚胎。設(shè)定24、48、72和96 h 這4個觀察時間點(diǎn)，每24 h更換一次溶液，并觀察記錄胚胎存活數(shù)量，及時去除死亡胚胎。實(shí)驗設(shè)置3個平行組。

1.2.5亞硝酸鹽氮毒性實(shí)驗 實(shí)驗方法參照1.2.4，根據(jù)預(yù)實(shí)驗結(jié)果，總亞硝酸鹽氮含量按照等對數(shù)間距設(shè)置30.00、44.86、67.08、100.31和150.00 mg/L 5個梯度及空白對照組。

1.2.6死亡胚胎鑒定方法 在光學(xué)顯微鏡下，卵膜邊緣清晰、無附著物、復(fù)眼色素正常、心臟跳動正常者為存活的胚胎；卵膜有較多雜物或不完整，復(fù)眼色素暗淡，不明亮，卵子混濁、扁塌，心臟停止跳動者則確認(rèn)是死亡胚胎。

1.2.7數(shù)據(jù)收集及處理 統(tǒng)計各個實(shí)驗組胚胎的存活數(shù)目，按照下列公式計算實(shí)驗組波紋龍蝦胚胎的存活率。

式中Nt為胚胎在設(shè)定時間點(diǎn)時的存活數(shù)量（粒），N0為起始胚胎數(shù)量（粒）。

氨氮和亞硝酸鹽氮毒性實(shí)驗中對照組的波紋龍蝦胚胎若有死亡，則按Abbott公式死亡率校正：

式中，P為校正后死亡百分?jǐn)?shù)，P1為觀察死亡百分?jǐn)?shù)，C為對照組死亡百分?jǐn)?shù)。

胚胎死亡率由平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。

經(jīng)過Excel軟件操作和數(shù)據(jù)處理后，即可得到相應(yīng)關(guān)系趨勢圖。生成死亡率與藥物濃度的回歸方程和置信區(qū)間，求出24、48、72和96 h的半致死濃度（LC50）和安全濃度（SC）。安全濃度為 0.1 × 96 h時LC50。

采用 SPSS 23.0進(jìn)行方差分析(One-way ANOVA) 檢驗其差異顯著性；用LSR法的新復(fù)極差檢驗（SSR檢驗）法（Duncan）進(jìn)行組間多重比較；α設(shè)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 溫度變化對波紋龍蝦胚胎存活率的影響

2.1.1溫度驟然變化對波紋龍蝦胚胎存活率的影響 波紋龍蝦胚胎在鹽度30、pH 8.0、不同溫度條件下存活率如圖1所示。暴露12 h，各組胚胎存活率均在98%以上。暴露24 h和48 h，除35 ℃下存活率下降至54.44%和26.67%，其余溫度組存活率始終高于93%，35 ℃溫度組與其余溫度組之間存在顯著差異（P＜ 0.05）。暴露72 h，15～25 ℃時存活率均在87%以上，無顯著差異（P＞ 0.05），其中20 ℃下胚胎存活率最高（SR=94.44%）；30 ℃時存活率為84.44%，與20 ℃下有顯著差異（P＜ 0.05），與15 ℃和25 ℃組無顯著差異（P＞ 0.05）；35 ℃下存活率為5.56%，與其他各組差異顯著（P＜ 0.05）。

圖1 溫度驟然變化對波紋龍蝦胚胎存活率的影響Fig.1 Effect of abrupt temperature change on embryonic survival ratio of Panulirus homarus

2.1.2溫度逐漸變化對波紋龍蝦胚胎存活率的影響 波紋龍蝦胚胎在鹽度30、pH 8.0條件下，隨著溫度的升高和下降，胚胎存活率呈緩慢下降的趨勢（表1、2）。升至35 ℃時，胚胎平均存活率為76.67%，當(dāng)溫度升至36 ℃時胚胎全部死亡，胚胎卵膜發(fā)白，原生質(zhì)體收縮，卵子混濁。當(dāng)溫度降至7 ℃時，雖仍有少量胚胎存活，但3個平行組平均存活率低于10%，即認(rèn)定7 ℃為波紋龍蝦胚胎的存活最低臨界溫度。

表1 升溫漸變對波紋龍蝦胚胎存活率的影響Table 1 Effect of increasing temperature gradually on embryonic survival ratio of Panulirus homarus

表2 降溫漸變對波紋龍蝦胚胎存活率的影響Table 2 Effect of decreasing temperature gradually on embryonic survival ratio of Panulirus homarus

2.2 鹽度變化對波紋龍蝦胚胎存活率的影響

2.2.1鹽度驟然變化對波紋龍蝦胚胎存活率的影響 波紋龍蝦胚胎在溫度30 ℃、pH 8.0、不同鹽度條件下存活率如圖2所示。暴露12 h，鹽度為10的存活率最低（SR=85.56%），與其他各組差異顯著（P＞ 0.05）。暴露24 h，鹽度25～45 胚胎存活率仍在98%以上，與鹽度10、15、20組之間有顯著性差異（P＜ 0.05），在鹽度10～20范圍內(nèi)胚胎存活率隨鹽度下降而降低。暴露48 h，胚胎存活率隨鹽度增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，其中鹽度30～40之間沒有顯著性差異（P＞ 0.05），鹽度30組的胚胎存活率最高（SR=94.44%），鹽度10下存 活率最低（SR=40.00%）。暴露72 h，胚胎存活率仍是隨鹽度增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，鹽度30時的存活率最高（SR=87.78%），鹽度10時的 存活率最低（SR=11.11%），鹽度15和45次之，分別是26.67%和27.78%。

圖2 鹽度驟然變化對波紋龍蝦胚胎存活率的影響Fig.2 Effect of abrupt Salinity change on embryonic survival ratio of Panulirus homarus

波紋龍蝦胚胎在鹽度30～35暴露12～72 h，兩者存活率沒有顯著性差異（P＞ 0.05），而且存活率較高。

2.2.2鹽度逐漸變化對波紋龍蝦胚胎存活率的影響 波紋龍蝦胚胎在溫度30 ℃、pH 8.0條件下，漸變升高鹽度組和降低鹽度組的胚胎存活率結(jié)果如表3、4所示，均為緩慢下降趨勢。當(dāng)鹽度升至44時，胚胎存活率為11.11%。鹽度升至45時雖有少量胚胎存活，但3個平行組平均存活率低于10%，即認(rèn)定鹽度45為波紋龍蝦存活最高臨界鹽度。漸變降低鹽度組在16時，胚胎存活率為11.11%，當(dāng)鹽度降至15，胚胎全部死亡。

表3 高鹽度漸變對波紋龍蝦胚胎存活率的影響Table 3 Effect of increasing salinity gradually on embryonic survival ratio of Panulirus homarus

表4 低鹽度漸變對波紋龍蝦胚胎存活率的影響Table 4 Effect of decreasing salinity gradually on embryonic survival ratio of Panulirus homarus

2.3 pH變化對波紋龍蝦胚胎存活率的影響

2.3.1pH驟然變化對波紋龍蝦胚胎存活率的影響 波紋龍蝦胚胎在溫度30 ℃、鹽度30、不同pH條件下存活率如圖3所示。波紋龍蝦胚胎在各梯度溶液中暴露12～72 h，在pH 6.0～9.5范圍內(nèi)，其存活率隨pH值的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其中pH 8.0的存活率最高，隨著暴露時間越長，趨勢越明顯。暴露12 h，pH 6.5～9.0時存活率較高（SR ＞ 96%），組間差異不顯著（P＞ 0.05），與pH 6.0和9.0時有顯著差異（P＜ 0.05）。暴露24 h，pH在6.5～8.5組間存活率差異不顯著（P＞ 0.05），與pH 6.0、9.0、9.5組間的差異顯著（P＜ 0.05）。暴露48 h，pH 7.0～8.5組間存活率差異不顯著（P＞ 0.05），與其余各組間差異顯著（P＜ 0.05），pH 9.5存活率最低（SR=45.56%）。暴露72 h，pH 7.0～8.5組間差異不顯著（P＞ 0.05），其中pH 8.0存活率最高（SR=93.33%），pH 6.0存活率最低（SR=36.67%）與pH 9.5（SR=41.11%）組間差異不顯著（P＞ 0.05）。

圖3 pH驟然變化對波紋龍蝦胚胎存活率的影響Fig.3 Effect of abrupt pH change on embryonic survival ratio of Panulirus homarus

2.3.2pH逐漸變化對波紋龍蝦胚胎存活率的影響 pH逐漸變化對波紋龍蝦胚胎存活率的影響如表4、5所示。波紋龍蝦胚胎在溫度30 ℃、鹽度30條件下，漸變升高pH組在pH 8.0～8.8范圍內(nèi)，胚胎存活率緩慢下降。當(dāng)pH＞8.8時，胚胎存活率下降趨勢加快，pH升至9.4時胚胎全部死亡。漸變降低pH組隨著pH的降低，胚胎存活率緩慢下降，當(dāng)pH低于7.0時，胚胎存活率下降趨勢加快，pH降至5.8時雖有少量胚胎仍存活，但3個平行組平均存活率低于10%，即認(rèn)定pH 5.8為波紋龍蝦存活最低臨界pH。

表5 高pH漸變對波紋龍蝦胚胎存活率的影響Table 5 Effect of increasing pH gradually on embryonic survival ratio of Panulirus homarus

表6 低pH漸變對波紋龍蝦胚胎存活率的影響Table 6 Effect of decreasing pH gradually on embryonic survival rate of Panulirus homarus

2.4 氨氮對波紋龍蝦胚胎的毒性影響

波紋龍蝦胚胎在不同氨氮濃度溶液中暴露96 h的致死情況如表7所示，胚胎死亡率隨濃度的升高和暴露在藥物中時間的增加而增加。由表7所見，24 h時各濃度組的死亡率沒有顯著差異（P＞ 0.05）。48 h時，氨氮質(zhì)量濃度≥33.44 mg/L時死亡率與對照組差異顯著（P＜ 0.05），但≤22.36 mg/L時死亡率與對照組差異不顯著（P ＞0.05）。72 h時，氨氮質(zhì)量濃度為10 mg/L時死亡率與對照組差異不顯著（P＞ 0.05），但14.95 mg/L及以上死亡率與對照組差異顯著（P＜ 0.05）。96 h時，氨氮實(shí)驗組死亡率顯著高于對照組（P＜ 0.05）。

根據(jù)表7數(shù)據(jù)，進(jìn)行回歸分析計算，得到氨氮對波紋龍蝦胚胎的LC50與SC如表8所示。氨氮對波紋龍蝦的24、48、72和96 h LC50分別為180.46、61.11、41.87、26.58 mg/L，SC為2.66 mg/L。

表7 氨氮對波紋龍蝦胚胎的致死情況Table 7 Lethal effect of ammonia nitrogen on embryo of Panulirus homarus

表8 氨氮對波紋龍蝦胚胎的半致死濃度和安全濃度Table 8 Half lethal concentration and safe concentration of ammonia nitrogen to embryo of Panulirus homarus

2.5 亞硝酸鹽氮對波紋龍蝦胚胎的毒性影響

波紋龍蝦胚胎在不同亞硝酸鹽氮濃度溶液中暴露96 h的致死情況如表9所示。

胚胎死亡率隨濃度的升高和暴露在藥物中時間的增加而增加。24 h和48 h時，亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度≥100.31 mg/L時死亡率與對照組差異顯著（P＜ 0.05），但≤67.08 mg/L時死亡率與對照組差異不顯著（P＞ 0.05）。72 h和96 h時，亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度≥44.86 mg/L及以上死亡率與對照組差異顯著（P＜ 0.05），但30 mg/L死亡率與對照組差異不顯著（P＞ 0.05）

表9 亞硝酸鹽氮對波紋龍蝦胚胎的致死情況Table 9 The lethal effect of nitrite nitrogen on embryo of Panulirus homarus

根據(jù)表9數(shù)據(jù)，進(jìn)行回歸分析計算，得到亞硝酸鹽氮對波紋龍蝦胚胎的LC50與SC如表10所示。亞硝酸鹽氮對波紋龍蝦的24、48、72和96 h 的LC50分別為839.50、423.75、214.48和135.41 mg/L，SC為13.54 mg/L。

表10 亞硝酸鹽氮對波紋龍蝦胚胎的半致死和安全濃度Table 10 Half lethal concentration and safe concentration of nitrite nitrogen to embryo of Panulirus homarus

3 討論

3.1 溫度變化對波紋龍蝦胚胎的影響

波紋龍蝦分布范圍較廣，對溫度的耐受范圍較大。在鹽度30、pH 8.0條件下對波紋龍蝦胚胎進(jìn)行溫度逐漸變化實(shí)驗所得結(jié)果顯示，波紋龍蝦胚胎的耐受范圍為7～36 ℃，屬于典型熱帶和亞熱帶種類，與波紋龍蝦分布范圍較廣的事實(shí)相符合。黃東科等[10]在溫度對波紋龍蝦的存活、攝食影響實(shí)驗中得出，波紋龍蝦的生存溫度范圍為13～36 ℃，與本實(shí)驗結(jié)果相似。本實(shí)驗基于胚胎的溫度耐受范圍設(shè)置溫度梯度，溫度驟然變化實(shí)驗數(shù)據(jù)顯示，在鹽度30、pH 8.0條件下波紋龍蝦胚胎在20 ℃的存活率最高，但與同期處于相對較高溫度條件下的胚胎相比，其發(fā)育較為緩慢；25和30 ℃的波紋龍蝦胚胎存活率始終高于80%，并且發(fā)育較快；35 ℃的胚胎發(fā)育畸形現(xiàn)象較多，死亡率也較高。升溫組存活率始終低于降溫組，表明波紋龍蝦胚胎對高溫突變的耐受性較差。當(dāng)水溫超過適宜范圍時，孵化率下降且畸形率明顯升高，即在適宜范圍內(nèi)，隨著水溫的升高，胚胎的發(fā)育速度加快，但進(jìn)一步提高溫度會引起胚胎畸形，產(chǎn)生敗育[11]；溫度低于適宜范圍，胚胎發(fā)育速度減慢甚至?xí)Ｖ拱l(fā)育和死亡。宋盛憲等[12]以野生捕獲的日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）為材料，觀察胚胎發(fā)育過程，結(jié)果得到32和20 ℃分別為孵化時的溫度上限和溫度下限，在適宜溫度范圍內(nèi)，水溫與孵化時間呈負(fù)相關(guān)，與本實(shí)驗研究結(jié)果相似。因此可以初步推測波紋龍蝦胚胎適宜溫度為15～30 ℃。

3.2 鹽度變化對波紋龍蝦胚胎的影響

甲殼類動物受鹽度的影響主要體現(xiàn)在鹽度影響甲殼類動物機(jī)體的滲透壓。在不同的鹽度環(huán)境條件下，蝦蟹類動物通過調(diào)節(jié)自身代謝狀況從而適應(yīng)環(huán)境。當(dāng)胚胎處于非等滲的溶液中，為調(diào)節(jié)胚胎與環(huán)境的滲透壓平衡，會消耗胚胎的能量以維持滲透壓的平衡，并隨著處于這種狀態(tài)的時間的延長，鹽度對胚胎的影響越來越顯著。在溫度30 ℃、pH 8.0條件下對波紋龍蝦胚胎進(jìn)行鹽度的逐漸變化實(shí)驗，得出波紋龍蝦胚胎的鹽度耐受范圍為15～45。黃東科等[13]研究表明，波紋龍蝦的鹽度耐受范圍為9～45，與本實(shí)驗研究結(jié)果相似，說明波紋龍蝦胚胎耐受鹽度變化的能力與成蝦相似。在溫度30 ℃、pH 8.0條件下進(jìn)行波紋龍蝦胚胎的鹽度驟然變化實(shí)驗，結(jié)果顯示，24 h前，隨著時間的推移，降低鹽度組的胚胎存活率有明顯地下降趨勢，而升高鹽度組均沒有胚胎死亡的現(xiàn)象，說明短時間內(nèi)，波紋龍蝦胚胎對低鹽度的適應(yīng)能力較差。暴露72 h時，以鹽度30為對照組，鹽度每升高或降低5，升高鹽度組和降低鹽度組的存活率組間無顯著差異，說明隨著暴露時間的延長，波紋龍蝦胚胎對升高和降低鹽度的適應(yīng)性基本相同，這是由于波紋龍蝦屬于廣鹽性動物。在鹽度30和35的實(shí)驗溶液中暴露72 h后，其存活率保持在78%以上，且沒有顯著差異。Dilip等[14]研究發(fā)現(xiàn)，波紋龍蝦早期葉狀幼體最適鹽度范圍為31～33，與本實(shí)驗結(jié)果相似。因此可以初步推測波紋龍蝦胚胎的適宜鹽度范圍為30～35。

3.3 pH變化對波紋龍蝦胚胎的影響

在胚胎孵化過程中，由于卵膜具有調(diào)節(jié)能力，pH在胚胎適宜范圍內(nèi)變化不會影響胚胎的發(fā)育，但這種變化一旦超出胚胎承受范圍，影響胚胎內(nèi)環(huán)境的平衡，就會對胚胎發(fā)育產(chǎn)生很大的影響[15]。孵化水體pH過低容易使受精卵卵膜軟化，失去彈性，胚胎破膜死亡；而pH過高，卵膜會提早溶解，也會使胚胎死亡。丁宏印等[16]在pH對鋸緣青蟹胚胎發(fā)育的影響研究中，得出鋸緣青蟹胚胎的發(fā)育適宜pH為7.0～9.0，最適pH為7.8～8.2，且pH值對胚胎的存活率、畸形率、孵化率均有顯著的影響。梁華芳等[17]研究四種生態(tài)因子對錦繡龍蝦（Panulirus ornatus）胚胎發(fā)育的影響，結(jié)果表明，錦繡龍蝦胚胎發(fā)育適宜的pH為8.1～8.4，pH在＜7.5和＞8.7時受精卵極易出現(xiàn)畸形。波紋龍蝦胚胎在溫度30 ℃、鹽度30條件下進(jìn)行pH的逐漸變化實(shí)驗，結(jié)果顯示，波紋龍蝦胚胎的pH耐受范圍為5.8～9.4，雖然胚胎耐受范圍廣，但是在pH過高的溶液中，胚胎卵膜會逐漸發(fā)白或變黃；pH過低的溶液中，胚胎卵膜會逐漸變黑；pH高于8.8或低于7.0時胚胎的存活率會大幅下降，因此，要控制養(yǎng)殖水體的pH避免超過7.0～8.8的范圍。在pH驟然變化實(shí)驗中，胚胎存活率呈現(xiàn)中間高，兩邊低的趨勢，其中胚胎在pH 8.0存活率最高。胚胎在溶液中暴露24 h，其存活率在pH 6.0、6.5、9.0、9.5有顯著下降，存在胚胎發(fā)育畸形、卵膜出現(xiàn)孔洞等現(xiàn)象導(dǎo)致胚胎的死亡，表明胚胎對pH的大幅變化適應(yīng)能力較差，而在pH 7.0～8.5范圍內(nèi)暴露了72 h，其存活率較高且沒有顯著性差異，表明pH 7.0～8.5為波紋龍蝦胚胎的承受范圍，在此范圍內(nèi)pH的變化對胚胎發(fā)育的影響較小。

3.4 氨氮和亞硝酸鹽氮對波紋龍蝦胚胎的影響

在封閉的高密度養(yǎng)殖系統(tǒng)中，氨氮和亞硝酸鹽氮是引起暴發(fā)性疾病的主要環(huán)境因子。在養(yǎng)殖過程中，隨著養(yǎng)殖時間的增加，養(yǎng)殖水體中氨氮或亞硝酸鹽氮會逐漸積累，當(dāng)其濃度達(dá)到養(yǎng)殖生物難以適應(yīng)的值時，養(yǎng)殖生物的免疫系統(tǒng)會受到抑制，免疫功能下降，還會引起肝胰臟組織病變，誘發(fā)多種疾病。何碧華[18]對三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）胚胎的研究結(jié)果表明，當(dāng)氨氮質(zhì)量濃度高于3.125 mg/L時胚胎的存活率明顯下降，在氨氮質(zhì)量濃度高于6.25 mg/L時胚胎不能孵化出溞狀幼體。當(dāng)亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度高于6.25 mg/L 時，胚胎不能正常孵化；當(dāng)亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度在 0～6.25 mg/L 時，隨著亞硝酸鹽氮濃度的升高，胚胎發(fā)育速度減慢，孵化所需要的時間延長。波紋龍蝦胚胎在氨氮組和亞硝酸鹽氮組隨著暴露時間延長，半致死濃度均有所變化，從24 h到96 h，氨氮組的半致死濃度從180.46降至26.58 mg/L；亞硝酸鹽組的半致死濃度從839.50降至135.41 mg/L。而在相同時間內(nèi)，波紋龍蝦胚胎在氨氮組和亞硝酸鹽氮組隨著濃度的提升，其死亡率上升。說明波紋龍蝦胚胎死亡率與氨氮和亞硝酸鹽氮的脅迫時間及濃度成正相關(guān)關(guān)系，與脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）[19]、日本囊對蝦幼體[20]、紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）[21]、擬穴青蟹（Scylla paramamosain）[22]的毒性實(shí)驗結(jié)果相似。亞硝酸鹽氮組波紋龍蝦胚胎的安全濃度（13.54 mg/L）比氨氮組的胚胎安全濃度（2.66 mg/L）高，與王煜恒 等[23]對中華絨螯蟹、劉慧玲等[24]對墨吉明對蝦（Fenneropenaeus merguiensis）的研究結(jié)果相似，說明氨氮對波紋龍蝦胚胎的急性毒性強(qiáng)于亞硝酸鹽氮。這也是養(yǎng)殖生產(chǎn)中影響波紋龍蝦胚胎存活率的關(guān)鍵因素之一。所以，在養(yǎng)殖過程中要注意監(jiān)控氨氮的變化，提高池塘的溶解氧，減少殘餌和其他代謝產(chǎn)物的富集，避免出現(xiàn)氨氮中毒等癥狀。

4 結(jié)論

波紋龍蝦胚胎發(fā)育的溫度、鹽度和pH耐受范圍分別為7～36 ℃、15～45和5.8～9.4；波紋龍蝦胚胎適宜溫度為15～30 ℃，適宜鹽度為30～35，適宜pH為7.0～8.5。氨氮對波紋龍蝦胚胎24、48、72和96 h的半致死濃度分別是180.46、61.11、41.87、26.58 mg/L，安全濃度為2.66 mg/L；亞硝酸鹽氮對波紋龍蝦胚胎24、48、72和96 h的LC50分別是839.50、423.75、214.48、135.41 mg/L，SC為13.54 mg/L。波紋龍蝦胚胎死亡率與氨氮和亞硝酸鹽氮的脅迫時間及濃度成正相關(guān)關(guān)系，且氨氮對波紋龍蝦胚胎的急性毒性強(qiáng)于亞硝酸鹽氮。