李小龍 陳海生 吉飛躍

肺癌是全球惡性腫瘤相關(guān)死亡的主要原因。肺癌包括非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌兩種類型，其中非小細(xì)胞肺癌占所有肺癌病例的80%～85%，其5年生存率較低，即使對(duì)早期患者進(jìn)行有針對(duì)性的手術(shù)，術(shù)后復(fù)發(fā)率也高于其他類型的癌癥[1]。腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌死亡的主要原因，但轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的分子機(jī)制尚不清楚。最近的證據(jù)表明，miRNA在腫瘤轉(zhuǎn)移中起著重要的作用[2,3]。miR-514b-3p定位于X染色體，研究發(fā)現(xiàn)miR-514b-3p在直腸癌中明顯下調(diào)表達(dá)，miR-514b-3p通過(guò)增加上皮標(biāo)志物和減少間充質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)來(lái)減少結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移、侵襲和耐藥性[4]。但miR-514b-3p在肺癌中的表達(dá)情況筆者還未見(jiàn)報(bào)道，miR-514b-3p在肺癌中的功能和作用機(jī)制也不明確。本研究分析miR-514b-3p表達(dá)與肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的關(guān)系，探討其作用機(jī)制，以期為肺癌臨床生物靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2017年11月至2018年10月于我院確診并進(jìn)行手術(shù)切除的52例肺癌組織及其相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本，年齡30～75歲，平均年齡(50±7)歲。按照腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移分期，Ⅰ期15例，Ⅱ期17例，Ⅲ期20例?；颊咝g(shù)前均未接受放療、化療。開(kāi)展本研究前患者均簽訂知情同意書(shū)，并獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑 肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購(gòu)于美國(guó)ATCC；DMEM培養(yǎng)液、青鏈霉素混合液、胎牛血清均為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；轉(zhuǎn)染試劑Lipfectmine 2000為Invitrogen公司產(chǎn)品；兔源Ⅰ抗CyclinD1、P21、MMP-2、GAPDH購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；鼠源Ⅰ抗E-cadherin購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；羊抗兔以羊抗鼠Ⅱ抗為武漢博士德公司產(chǎn)品；miRNA反轉(zhuǎn)錄和定量PCR試劑盒購(gòu)自上海天根生化公司；miR-514b-3p mimics、miR-NC、si-MDM2、si-NC、anti-miR-NC、anti-miR-514b-3p、pcDNA3.1和pcDNA3.1-MDM2、以及WT-MDM2和MUT-MDM2的構(gòu)建測(cè)序均由上海吉瑪制藥有限公司提供；四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑盒購(gòu)于北京索萊寶公司；Transwell小室和基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)corning公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與分組 采用DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清含量和1%青鏈霉素溶液)培養(yǎng)A549細(xì)胞，后將其置于37℃、體積為5%的CO2培養(yǎng)箱中。將miR-514b-3p mimics、miR-NC、si-MDM2、si-NC分別與LipofectamineTM 2000混勻，室溫靜置20 min后，緩慢滴入培養(yǎng)液中，共培養(yǎng)4 h后，更換新鮮正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24～72 h，再用于后續(xù)研究。根據(jù)轉(zhuǎn)染物不同依次標(biāo)記為miR-514b-3p組、miR-NC組、si-MDM2組和si-NC組。為進(jìn)一步證實(shí)miR-514b-3p是通過(guò)調(diào)控MDM2表達(dá)進(jìn)而影響A549細(xì)胞的生物學(xué)行為，將miR-514b-3p mimics與pcDNA3.1或pcDNA3.1-MDM2同時(shí)轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，幾次標(biāo)記為miR-514b-3p+pcDNA3.1組、miR-514b-3p+pcDNA3.1-MDM2組，檢測(cè)細(xì)胞的生物學(xué)行為變化。

1.4 qRT-PCR檢測(cè) 用TRIzol分別提取肺癌組織、癌旁組織以及經(jīng)轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞的總RNA，分別測(cè)定其濃度和純度，采用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將miR-514b-3p逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后采用miRNA定量PCR試劑盒進(jìn)行定量分析。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 利用生物信息軟件預(yù)測(cè)miR-514b-3p的靶基因。發(fā)現(xiàn)MDM2為候選靶基因之一。構(gòu)建野生型WT-MDM2和突變型MUT-MDM2的RAP2B-3’UTR熒光素酶報(bào)告基因載體，嚴(yán)格按照LipofectamineTM 2000使用說(shuō)明將miR-514b-3p mimics和miR-NC分別與WT-MDM2和MUT-MDM2共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，將各組細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行熒光素酶活性測(cè)定。

1.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 將A549細(xì)胞按照2×103個(gè)/孔接種于96孔板，按照1.3分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，分別于轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h時(shí)利用MTT細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，采用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm 波長(zhǎng)處各孔的吸光度值。

1.7 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力/1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 遷移實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞用0.25%胰酶消化，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液。稀釋后，取300 μl細(xì)胞數(shù)1×105個(gè)細(xì)胞懸液加入到Transwell上室中，在Transwell下室加入500 μl含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用無(wú)菌棉簽擦去上室膜未過(guò)膜細(xì)胞，PBS液沖洗2次，采用甲醇固定20 min，隨后采用0.4%的結(jié)晶紫染液室溫孵育2 h，顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。侵襲實(shí)驗(yàn)采用在Transwell上室上表面包被基質(zhì)膠的Transwell小室，其他步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.8 Western blot檢測(cè) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，PBS液漂洗細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，離心收集上清液，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取適量經(jīng)煮沸變性細(xì)胞蛋白，上樣至SDS-PAGE加樣孔進(jìn)行電泳分離，之后將已分離的細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜后室溫條件采用5%脫脂牛奶封閉膜30 min，在室溫條件下孵育Ⅰ抗2 h，Western blot洗膜液洗膜3次，每次10 min，在室溫條件下孵育Ⅱ抗1 h，Western blot洗膜液洗膜3次，每次10 min。用ECL顯影檢測(cè)蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 miR-514b-3p在肺癌組織和癌旁組織中的表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)肺癌組織和癌旁組織中miR-514b-3p的表達(dá)水平。與癌旁組織相比，肺癌組織中miR-514b-3p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 miR-514b-3p在肺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

2.2 過(guò)表達(dá)miR-514b-3p對(duì)細(xì)胞A549增殖、遷移、侵襲的影響 與miR-NC組比較，miR-514b-3p組A549細(xì)胞miR-514b-3p的表達(dá)水平顯著升高，表明過(guò)表達(dá)miR-514b-3p的A549細(xì)胞株構(gòu)建成功。與miR-NC組比較，miR-514b-3p組A549細(xì)胞Cyclin D1和MMP-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低，P21和E-cadherin蛋白的表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞增殖活力顯著降低，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表2、3。

圖1 過(guò)表達(dá)miR-514b-3p對(duì)細(xì)胞A549增殖、遷移、侵襲的影響;A Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞遷移、侵襲能力;B Western blot檢測(cè)A549細(xì)胞中Cyclin D1、P21、MMP-2和E-cadherin蛋白表達(dá)

表2 過(guò)表達(dá)miR-514b-3p對(duì)細(xì)胞A549增殖的影響

表3 過(guò)表達(dá)miR-514b-3p對(duì)細(xì)胞A549遷移、侵襲的影

2.3 miR-514b-3p靶向、調(diào)控MDM2的表達(dá) 利用生物信息學(xué)軟件TargetScan在線預(yù)測(cè)miR-514b-3p的靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-514b-3p與MDM2的3’-UTR存在部分連續(xù)互補(bǔ)的堿基對(duì)。與miR-NC和WT-MDM2共轉(zhuǎn)染組比較，miR-514b-3p mimics和WT-MDM2共轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；與miR-NC和MUT-MDM2共轉(zhuǎn)染組比較，miR-514b-3p mimics和MUT-MDM2共轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞的熒光素酶活性變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與miR-NC組比較，miR-514b-3p組A549細(xì)胞MDM2蛋白的表達(dá)水平顯著降低；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-514b-3p組A549細(xì)胞MDM2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。提示MDM2是miR-514b-3p的靶基因，miR-514b-3p可負(fù)性調(diào)控MDM2表達(dá)。見(jiàn)圖2，表4、5。

圖2 miR-514b-3p靶向、調(diào)控MDM2;A MDM2的3’UTR含有miR-514b-3p的互補(bǔ)序列;B miR-514b-3p調(diào)控MDM2的表達(dá)

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表5 miR-514b-3p調(diào)控MDM2的表達(dá)

2.4 抑制MDM2表達(dá)對(duì)細(xì)胞A549增殖、遷移、侵襲的影響 與si-NC組比較，si-MDM2組A549細(xì)胞MDM2的表達(dá)水平顯著降低P<0.05)，表明抑制MDM2表達(dá)的A549細(xì)胞株構(gòu)建成功。與si-NC組比較，si-MDM2組A549細(xì)胞Cyclin D1和MMP-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低，P21和E-cadherin蛋白的表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞增殖活力顯著降低，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P<0.05)。見(jiàn)圖3，表6、7。

圖3 抑制MDM2表達(dá)對(duì)細(xì)胞A549增殖、遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

表6 抑制MDM2表達(dá)對(duì)細(xì)胞A549增殖的影響

表7 抑制MDM2表達(dá)對(duì)細(xì)胞A549遷移、侵襲的影

2.5 過(guò)表達(dá)MDM2逆轉(zhuǎn)miR-514b-3p對(duì)細(xì)胞A549增殖、遷移、侵襲的抑制作用 與miR-NC組比較，miR-514b-3p組A549細(xì)胞MDM2、Cyclin D1和MMP-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低，P21和E-cadherin蛋白的表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞增殖活力顯著降低，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P<0.05)；與miR-514b-3p+pcDNA3.1組比較，miR-514b-3p+pcDNA3.1-MDM2組A549細(xì)胞MDM2、Cyclin D1和MMP-2蛋白的表達(dá)水平顯著升高，P21和E-cadherin蛋白的表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞增殖活力顯著增強(qiáng)，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)圖4，表8、9。

表8 過(guò)表達(dá)MDM2能逆轉(zhuǎn)miR-514b-3p對(duì)細(xì)胞A549增殖的影響

圖4 過(guò)表達(dá)MDM2能逆轉(zhuǎn)miR-514b-3p對(duì)細(xì)胞A549增殖、遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

3 討論

近年來(lái)，全球肺癌發(fā)病率呈逐步上升趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約90%的肺癌死亡與腫瘤的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散有關(guān)。盡管目前臨床肺癌診療技術(shù)不斷提高，但并未取得顯著的治療效果。因此，如何有效的控制肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)散是改善肺癌患者預(yù)后的關(guān)鍵。

miRNA是一種長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼微小RNA，其通過(guò)與靶mRNA特定位點(diǎn)結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本降解或翻譯抑制，參與對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種重要細(xì)胞活動(dòng)的調(diào)控[5]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，miRNA在控制癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮著重要的作用。Liu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌組織中miR-25表達(dá)上調(diào)，miR-25的上調(diào)與非小細(xì)胞肺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，并增強(qiáng)了癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力；miR-19可引起肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并伴有生長(zhǎng)抑制[7]；然而，miR-203通過(guò)下調(diào)RGS17抑制非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[8]。miR-514隸屬于miR-506～514簇，研究發(fā)現(xiàn)，在蕈樣真菌病腫瘤期皮膚組織中miR-514b-3p表達(dá)上調(diào)[9]；然而，miR-514b-3p在結(jié)直腸癌中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-514b-3p可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移侵襲，而miR-514b-5p卻發(fā)揮促轉(zhuǎn)移作用[4]；miR-514a-3p在腎癌組織中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-514a-3p通過(guò)靶向EGFR抑制透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[10,11]；此外，在睪丸生殖細(xì)胞瘤中miR-514a-3p也呈低表達(dá)，上調(diào)miR-514a-3p可抑制PEG3表達(dá)進(jìn)而抑制NF-kappa B通路活化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-514b-3p在肺癌組織中表達(dá)顯著降低，過(guò)表達(dá)miR-514b-3p可顯著抑制Cyclin D1和MMP-2表達(dá)，促進(jìn)P21和E-cadherin表達(dá)，降低肺癌細(xì)胞的增殖和遷移侵襲能力，表明miR-514b-3p在肺癌中發(fā)揮抑癌作用，與miR-514b-3p在結(jié)直腸癌的抑癌作用[4]相一致。

表9 過(guò)表達(dá)MDM2能逆轉(zhuǎn)miR-514b-3p對(duì)細(xì)胞A549遷移、侵襲的影響

為探索miR-514b-3p抑制肺癌細(xì)胞增殖和遷移侵襲的分子機(jī)制，利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-514b-3p與MDM2存在部分連續(xù)互補(bǔ)的核苷酸。鼠雙微體基因2(murine double mimute 2，MDM2)是一種與多種類型的惡性腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的癌基因[13]。MDM2主要作為E3連接酶作用于多種底物，通常為腫瘤抑制因子，如p53和Rb，促進(jìn)其泛素化和蛋白酶體依賴降解，從而促進(jìn)腫瘤惡性化。研究發(fā)現(xiàn)，MDM2在肺癌中表達(dá)上調(diào)，且MDM2的上調(diào)促進(jìn)腫瘤的惡性增殖和轉(zhuǎn)移，可作為預(yù)后判斷指標(biāo)[14,15]；MDM2還可通過(guò)激活Smad通路促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移[16]；此外，miR-758-3p和miR-509-5p通過(guò)靶向下調(diào)MDM2表達(dá)分別抑制肝癌和前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[17,18]。本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和Western blot證實(shí)，miR-514b-3p可負(fù)性調(diào)控MDM2的表達(dá)。隨后，構(gòu)建抑制MDM2表達(dá)肺癌細(xì)胞株發(fā)現(xiàn)，抑制MDM2表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。進(jìn)一步研究顯示過(guò)表達(dá)MDM2可逆轉(zhuǎn)miR-514b-3p對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。提示，過(guò)表達(dá)miR-514b-3p通過(guò)下調(diào)MDM2抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，miR-514b-3p在肺癌組織中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-514b-3p可通過(guò)抑制MDM2表達(dá)進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，為肺癌的臨床靶向分子治療提供了新的方向。