＊王元紅

（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司 山東 272021）

現(xiàn)階段，我國的藥品安全問題已經(jīng)成為了當(dāng)下社會最為關(guān)注的話題之一。2006年的“欣弗事件”，讓我國進(jìn)入了持續(xù)數(shù)年的藥品微生物污染的高發(fā)期，大眾對于藥品安全愈加重視，無菌藥品生產(chǎn)行業(yè)對于微生物鑒定技術(shù)的要求也在逐年提升。無菌藥品已經(jīng)屬于高風(fēng)險(xiǎn)藥品生產(chǎn)領(lǐng)域，尤其是隨著2010年出臺的《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》以及《中華人民共和國藥典》的實(shí)施，極大的提升了對無菌藥品生產(chǎn)的要求。目前，國內(nèi)多數(shù)的無菌藥品審查和企業(yè)已經(jīng)具備了GMP對于無菌藥品生產(chǎn)的條件，無論是在硬件還是軟件方面都有極大的提升。但不可否認(rèn)，在無菌藥品生產(chǎn)中，有關(guān)微生物鑒定技術(shù)還是有待加強(qiáng)，也并未建立完善的管理體系。從根本來看，微生物對于藥品的質(zhì)量和安全至關(guān)重要，尤其是對于臨床當(dāng)中免疫力低下人群的影響更大。基于此，無菌藥品生產(chǎn)的過程中，務(wù)必要加強(qiáng)對于微生物鑒定技術(shù)的應(yīng)用，以此提升無菌藥品的藥效。

1.無菌藥品生產(chǎn)行業(yè)中應(yīng)用微生物堅(jiān)定技術(shù)的作用分析

因許多方面都會對藥品衛(wèi)生檢測產(chǎn)生影響，因此，在進(jìn)行藥品生產(chǎn)時，微生物檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度就顯得尤為重要，同時還必須對微生物檢測的技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化和提升。尤其是在近些年，我國因藥品安全引發(fā)的事故屢見不鮮，針對無菌藥品的微生物檢測是其保障產(chǎn)品安全的重要途徑，微生物鑒定技術(shù)的優(yōu)化可以助力無菌藥品安全，使其檢測的結(jié)果也更具可靠性。如今，微生物檢測技術(shù)已經(jīng)成為了無菌藥品的重要安全保障，同時也為無菌藥品的生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。

2.無菌藥品生產(chǎn)領(lǐng)域主要應(yīng)用的微生物鑒定技術(shù)分析

2010年出臺的GMP（良好操作規(guī)范）對食品、藥品等生產(chǎn)企業(yè)提出了更高的要求，尤其是無菌藥品從其生產(chǎn)加工開始，一直到倉儲運(yùn)輸，都要確保藥品的安全衛(wèi)生，微生物作為對無菌藥品影響最重要的因素，從其藥物原料、輔料到最終的無菌藥品以及生產(chǎn)環(huán)境都要進(jìn)行微生物鑒定。無菌藥品的整個生產(chǎn)流程都務(wù)必要對微生物進(jìn)行適當(dāng)?shù)目刂?，一旦微生物出現(xiàn)控制不當(dāng)?shù)那闆r，無菌藥品的質(zhì)量必然會受到影響，這一結(jié)果不僅會為生產(chǎn)無菌藥品的企業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還會對群體的生命安全造成威脅。因此，我們對于微生物鑒別首先就要清楚微生物風(fēng)險(xiǎn)的識別和控制。

(1)在無菌藥品生產(chǎn)中應(yīng)用的PCR技術(shù)研究

PCR技術(shù)是指利用體外酶的催化作用促進(jìn)對特異性DNA片段的合成，PCR技術(shù)采用擴(kuò)增產(chǎn)物的方式，使得DNA數(shù)量驟增，以其從原有數(shù)量的基礎(chǔ)上增長百倍，之后便利用熒光條進(jìn)行檢測，這種方式對微生物種類進(jìn)行鑒定極為便捷，從實(shí)際的角度而言，在其檢測工作的過程中，PCR技術(shù)極為成熟，具有超強(qiáng)的靈敏性。而從理論的角度來看，在進(jìn)行細(xì)菌檢測的過程中，細(xì)菌的拷貝基因可以通過PCR的技術(shù)進(jìn)行檢測，此后便可以增菌，增菌的時間是受到一定限制的，這樣檢測技術(shù)的應(yīng)用，便可以在極大的程度上節(jié)省檢測的時間。

(2)無菌藥品生產(chǎn)應(yīng)用的基因芯片技術(shù)

基因芯片是指采用當(dāng)前先進(jìn)的科學(xué)技術(shù)和微加工技術(shù)，對基因的寡核酸苷酸進(jìn)行排序，其排序的載體是硅片等物質(zhì)，最終要達(dá)成的結(jié)果是要形成高密度的排序形式，而這也被稱之為信息檢測芯片。

在無菌藥品生產(chǎn)領(lǐng)域中，其主要的應(yīng)用技術(shù)為兩個，其一是基因芯片，即信息檢測芯片。其二是微生物檢測技術(shù)，主要采用熒光標(biāo)記技術(shù)融合而成，微生物檢測技術(shù)主要是通過基因探針、寡核苷酸點(diǎn)之間的雜交情況來進(jìn)行分析，將這二者的雜交情況進(jìn)行掃描，來了解熒光的分布情況，最終是要判斷出，檢測樣品當(dāng)中是否存在微生物這一問題。

基因芯片技術(shù)想要擴(kuò)大其檢測的范圍，可以采用增長探針的方式以此達(dá)到目的。而探針技術(shù)的不斷升級和優(yōu)化，不僅可以擴(kuò)大其檢測的范圍，還能提高芯片檢測的效果?；驒z測技術(shù)可以應(yīng)用的領(lǐng)域十分廣泛，而針對無菌樣品生產(chǎn)的檢測，甚至可以細(xì)化到對試驗(yàn)檢測中的致病源進(jìn)行全面的檢測。和傳統(tǒng)的基因檢測技術(shù)相比，現(xiàn)階段基因檢測技術(shù)仍舊在不斷的優(yōu)化和升級，其自動化的程度也得到了大大的提升，而且在優(yōu)化的過程中，基因檢測技術(shù)的操作也不斷簡化，不再像傳統(tǒng)基因檢測技術(shù)那般復(fù)雜，其準(zhǔn)確性也得到了提升。

(3)無菌藥品生產(chǎn)中應(yīng)用的基因探針技術(shù)

基因探針檢測技術(shù)利用核苷酸序列對生物素等進(jìn)行標(biāo)記的特性，以此通過與生物特定基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)合，并將基因、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)標(biāo)記出來，以達(dá)到方便檢測的目的。其原理并不復(fù)雜，主要是通過對熒光標(biāo)記的核苷酸，采用分子雜交的方法，使得二者進(jìn)行結(jié)合特定生物素并攜帶標(biāo)記信號，再對這一標(biāo)記信號進(jìn)行檢測。

通常情況下會針對同位素進(jìn)行檢測，但探針的標(biāo)記特定性極為鮮明，同時還是提升微生物檢測準(zhǔn)確性的重要路徑，除此之外，基因探針檢測技術(shù)還能極大的提升檢測的速度，但因在檢測的過程中，已經(jīng)被標(biāo)記的同位素具有一定的污染性，所以當(dāng)我們在進(jìn)行基因探針檢測時一定要做好防護(hù)措施，在檢測的過程中，還要注意操作的規(guī)范性，避免隨意處理檢測廢棄物而造成惡劣的影響。

(4)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜的應(yīng)用

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜，簡稱MALDITOFMS。簡單來說MALDI-TOFMS是一項(xiàng)菌種鑒定技術(shù)，其鑒定主要基于微生物核糖體和外周蛋白特異性及保守性。菌體蛋白與基質(zhì)結(jié)晶，想要進(jìn)行離子化，需要先進(jìn)行吸光，當(dāng)離子化后，會形成不同的離子峰，主要原因在于真空電場的質(zhì)荷比不同，在離子化后進(jìn)行分離而形成了不同離子峰，最終的結(jié)果是形成了蛋白指紋圖譜。

MALDI-TOFMS具有極快的檢測速度，在一次的檢測當(dāng)中，可以進(jìn)樣96宗，大樣本篩查可以使用384孔板，檢測結(jié)果在3min之內(nèi)就可以得出。而且其靈敏性也極高，可以識別0.1μL的菌液，針對不同的菌株進(jìn)行鑒定優(yōu)勢也極為明顯，尤其是苛養(yǎng)菌、厭氧菌等一類。再加上MALDI-TOFMS的準(zhǔn)確率較高，可以達(dá)到95%以上。

但MALDI-TOFMS也并非在任何鑒定中具有優(yōu)勢，它也存在一定的局限性。尤其是對于絲狀真菌的鑒定準(zhǔn)確率并不高。究其原因，因絲狀真菌的菌體破壁并不完全，想要將菌體蛋白提取出來具有較高的難度。而隨著研究的不斷推進(jìn)，想要解決絲狀真菌蛋白提取的問題，我們發(fā)現(xiàn)，SDB即沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基在進(jìn)行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)、使用研磨-超聲裂解提取法提取之前進(jìn)行處理可以很好地解決這一難題，最終鑒定的準(zhǔn)確率得到了提升。個別時候，MALDI-TOFMS也會對菌體進(jìn)行誤判，較為常見是將志賀菌認(rèn)為成大腸埃希菌，這兩個菌體在遺傳背景上具有較強(qiáng)的相似性，而且他們的DNA序列的相關(guān)性也極高，還具有相似的菌體蛋白特征峰。其數(shù)據(jù)庫有關(guān)志賀菌屬相關(guān)內(nèi)容缺失，可以使用生理生化和血清學(xué)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并對其結(jié)果進(jìn)行判斷。

(5)16SrRNA基因測序的應(yīng)用

16SrRNA為核糖體RNA的一個亞基，其存在于兩個區(qū)，其一是保守區(qū)，主要反應(yīng)親緣關(guān)系，其二是可變區(qū)，體現(xiàn)的是生物物種間的特異性。而16SrRNA基因?qū)ξ⑸镞M(jìn)行鑒定，主要是根據(jù)遺傳物質(zhì)和分子水平，這一鑒定技術(shù)獲得了業(yè)內(nèi)的極大認(rèn)可。

16SrRNA的保守性有其優(yōu)勢的一面，但同時也呈現(xiàn)出一大弊端，那就是異種同源性。有些不同種的微生物的16SrRNA序列幾近相同，而想要解決這一問題，可以通過16SrRNA/ITS基因序列分析來完成。而ITS即內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)是位于rRNA基因之間的非功能性片段，而這一非功能性片段的進(jìn)化壓力并不大，其變異性較強(qiáng)，即便極為接近的菌種，也可以在ITS序列上呈現(xiàn)出一定的差異性。

針對親緣接近的微生物鑒定，大部分采用的是16SrRNA/ITS基因測序方法，主要是因其在這一方面具有較強(qiáng)的優(yōu)越性，再通過HTS即高通量測序技術(shù)，不僅可以對痕量菌低豐度物種進(jìn)行檢測，其檢測的效率和準(zhǔn)確定都極高。

(6)VITEK2Compact系統(tǒng)的應(yīng)用

VITEK2Compact即全自動微生物鑒定系統(tǒng)，其基礎(chǔ)是微生物的升華反應(yīng)，同時與比色、比濁動態(tài)分析技術(shù)相結(jié)合，并對其進(jìn)行自動化鑒定。當(dāng)我們在使用VITEK2Compact時，需要挑取單個菌落，將其與一定濃度的菌懸液進(jìn)行配置，再根據(jù)菌落形態(tài)和革蘭氏染色結(jié)果，接種到對應(yīng)的鑒定卡上，對其進(jìn)行分析，最后要對鑒定卡內(nèi)的各孔培養(yǎng)基的生長變化值進(jìn)行讀取，最終對菌株的種屬進(jìn)行最終的確定。

鑒定卡孔共計(jì)64個，適用范圍廣泛，即便是在同一時間也可進(jìn)行多項(xiàng)生理生化試驗(yàn)，一般性的試驗(yàn)結(jié)果大概在6-8h獲得，而酵母菌試驗(yàn)結(jié)果時間較長，大約在18h左右。從中也可看出，VITEK2Compact優(yōu)勢極為明顯，不僅操作簡單，耗費(fèi)時間還相對較短。

因VITEK2Compact的主要判定依據(jù)，是菌種的生理生化特性，而因菌種的特殊性，其生長的情況對鑒定的結(jié)果具有一定的影響。菌種儲存應(yīng)該多加注意，尤其是在穩(wěn)定和儲存時間方面更應(yīng)留心。因?yàn)橐恍┚N的保存時間越長，其鑒定結(jié)果的符合率越低，而保存時間較短，其堅(jiān)定結(jié)果符合率越高，也就是說部分菌種鑒定結(jié)果符合率與其儲存時間呈負(fù)相關(guān)。基于此，在對菌種進(jìn)行鑒定時，最好是能夠使用新鮮的菌種，以便保證其鑒定結(jié)果的符合率較高。除此之外，生化反應(yīng)對于菌液濃度也有所要求，因此，在進(jìn)行生化反應(yīng)為基礎(chǔ)的鑒定時，盡可能的將生長緩慢、培養(yǎng)困難的細(xì)菌刨除在外。

3.結(jié)語

總而言之，無菌藥品的微生物檢測對其產(chǎn)品質(zhì)量起到了至關(guān)重要的影響。因此，我們需要對微生物堅(jiān)定技術(shù)持續(xù)研發(fā)，不斷將其升級換代，同時也要將其安全作用在無菌藥品的生產(chǎn)流程中呈現(xiàn)出來，以確保無菌藥品生產(chǎn)的效率和質(zhì)量。