羅彥竹 黎冬平 周娜 李俊萍 王育紅

1中南大學(xué)愛爾眼科學(xué)院，長沙 410015；2武漢愛爾眼科醫(yī)院漢口醫(yī)院眼科 430021

上瞼下垂指平視前方時，上眼瞼遮蓋角膜上緣的范圍超過2 mm[1]。單純性先天性上瞼下垂(simple congenital ptosis，SCP)是臨床上常見的一種上瞼下垂亞型，不僅影響患者的美觀，還可能導(dǎo)致視覺及心理發(fā)育障礙[2-5]。研究表明，SCP可能有多種發(fā)病機制，大多數(shù)病例是由于提上瞼肌或動眼神經(jīng)核的發(fā)育不良所致，少數(shù)病例是由于提上瞼肌內(nèi)外角以及上方的節(jié)制韌帶過緊，或是眶隔纖維化，從而限制了提上瞼肌的活動[6-10]。也有研究提出SCP提上瞼肌的病理學(xué)改變應(yīng)歸納為營養(yǎng)不良而非發(fā)育不良[11-12]，故關(guān)于SCP的發(fā)病機制仍無定論。在進行病理學(xué)觀察時，某些提上瞼肌標本中可能無法觀察到骨骼肌纖維，反而可以觀察到較多的平滑肌纖維，這類肌纖維在過去往往被認為是Müller肌[13]。但Alshehri等[14]觀察到SCP患者的Müller肌呈萎縮性改變，肌肉中的平滑肌數(shù)目明顯少于腱膜性上瞼下垂患者。有研究發(fā)現(xiàn)，正常人的提上瞼肌腱膜中也含有少量獨立的平滑肌纖維，并且免疫組織化學(xué)檢測提示α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)在這些肌纖維中呈陽性表達[15-16]。以上研究表明將SCP患者提上瞼肌標本中的平滑肌纖維完全視為Müller肌的觀點可能并不準確。鑒于此，本研究擬通過光學(xué)顯微鏡觀察SCP患者提上瞼肌中的骨骼肌纖維，為肌肉病理學(xué)的分類提供更多證據(jù)；并通過平滑肌標志性蛋白的免疫組織化學(xué)檢測和肌細胞的透射電子顯微鏡觀察等方法，對患者提上瞼肌中的平滑肌纖維進行定性研究，探討SCP的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1取材及組織來源 收集2018年8月至2019年10月于武漢愛爾眼科醫(yī)院漢口醫(yī)院行提上瞼肌縮短術(shù)的SCP患者68例102眼的提上瞼肌標本作為觀察組，其中男48例，女20例；年齡2～36歲，中位數(shù)年齡為7.50歲；單側(cè)上瞼下垂患者34例，雙側(cè)上瞼下垂患者34例。同時選取武漢市紅十字會愛爾眼庫提供的8名正常供體的新鮮提上瞼肌腱膜和肌腹組織作為對照組，其中男5名，女3名；年齡55～70歲，中位數(shù)年齡為63.5歲。參照《上瞼下垂診治專家共識》[1]，上瞼下垂的診斷標準為患者平視前方，抵消額肌力量后，上瞼緣遮蓋角膜上緣的范圍大于2 mm。觀察組納入標準：(1)明確診斷為SCP，且擬接受手術(shù)治療的患者；(2)患者依從性好。排除標準：(1)其他類型的先天性上瞼下垂或后天性上瞼下垂患者；(2)重癥肌無力、進行性肌營養(yǎng)不良等全身骨骼肌疾病合并有局部上瞼下垂表現(xiàn)者；(3)既往有眼瞼外傷史、手術(shù)史者；(4)提上瞼肌肌力差，需聯(lián)合筋膜鞘手術(shù)或額肌懸吊術(shù)的患者。對照組納入標準：(1)簽署中國人體器官捐獻志愿登記卡，供者家屬知情同意；(2)死亡時間不超過12 h。排除標準：(1)既往有眼瞼外傷史、手術(shù)史者；(2)患者死亡前即有明確的上瞼下垂表現(xiàn)。參照上眼瞼遮蓋角膜的范圍將所有觀察組標本分為遮蓋范圍≤4 mm組35眼、遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組30眼和遮蓋范圍>6 mm組37眼，觀察組提上瞼肌標本的臨床特征見表1。所有患者均接受提上瞼肌縮短術(shù)，術(shù)中取材時盡可能剔除Müller肌，將靠近肌腹部的提上瞼肌標本用于病理學(xué)研究。本研究遵循《赫爾辛基宣言》，研究方案經(jīng)武漢愛爾眼科醫(yī)院漢口醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(批文號：HKAIER2018IRB-005-01)，所有患者及其法定監(jiān)護人了解治療方法和取材目的并自愿簽署知情同意書。

表1 各組SCP患者提上瞼肌標本臨床特征比較[M(Q1,Q3),mm]Table 1 Comparison of clinical features of levator palpebrae superiors musclespecimens among the three groups in SCP patients [M(Q1,Q3),mm]組別眼數(shù)提上瞼肌肌力上瞼遮蓋范圍手術(shù)縮短量遮蓋范圍≤4 mm組3511.00(10.00,13.00)3.00(2.50,3.00)10.00(8.00,14.00)遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm307.00(5.00,8.00)5.00(4.63,5.88)16.00(15.00,24.00)遮蓋范圍>6 mm組373.50(3.00,4.00)7.00(7.00,8.00)24.00(20.00,26.00)H值73.09074.37063.430P值<0.05<0.05<0.05 注:(Kruskal-Wallis H檢驗) SCP:單純性先天性上瞼下垂 Note:(Kruskal-Wallis H test) SCP:simple congenital ptosis

1.1.2主要試劑及儀器 蘇木精-伊紅染色試劑盒、Masson三色染色試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)試劑盒、鼠抗人α-SMA單克隆抗體(BM0002)(武漢博士德生物工程有限公司)；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記山羊抗小鼠二抗(5220-0341)(武漢安諾倫生物科技有限公司)。脫水機、包埋機、凍臺、組織攤片機(武漢俊杰電子有限公司)；病理切片機(上海徠卡儀器有限公司)；烤箱(天津市萊玻瑞儀器設(shè)備有限公司)；微波爐(廣東格蘭仕微波爐電器有限公司)；水浴鍋(金壇市江南儀器廠)；脫色搖床(北京六一儀器廠)；渦旋混合器(南京天悅電子科技股份有限公司)；正置光學(xué)顯微鏡、成像系統(tǒng)(日本Nikon公司)；鉆石切片刀(瑞士戴通公司)；透射電子顯微鏡(美國FEI公司)。

1.2 方法

1.2.1提上瞼肌取材及石蠟切片的制作 觀察組所有患者術(shù)前均詳細詢問病史，行常規(guī)眼部及全身檢查，與上瞼下垂相關(guān)的?？茩z查包括上瞼緣遮蓋角膜上緣的范圍、瞼裂大小、提上瞼肌肌力、額肌肌力、Bell征、新斯的明試驗及咀嚼試驗。所有患者均由同一位經(jīng)驗豐富的手術(shù)醫(yī)師行提上瞼肌縮短術(shù)，術(shù)中截取Whitnall韌帶以上的提上瞼肌組織進行病理學(xué)觀察，若縮短的范圍未達到Whitnall韌帶，則盡可能靠近肌腹端取材，截取組織長度約5 mm。將術(shù)中留取的提上瞼肌標本用手術(shù)貼膜覆蓋，盡量減小牽拉、挫傷與擠壓等機械損傷，使用彎剪快速截取約1 mm×1 mm×1 mm大小的標本，于1 min內(nèi)浸入體積分數(shù)2.5%戊二醛溶液，4 ℃固定24 h，以備制作透射電子顯微鏡切片。另一部分放置在質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛溶液中固定，行常規(guī)石蠟包埋，3 μm厚連續(xù)切片，備用。

1.2.2Masson三色染色法檢測肌纖維面積 將石蠟切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ溶液各15 min脫蠟，逐級放入無水乙醇、體積分數(shù)95%乙醇、85%乙醇各5 min，自來水清洗。將切片放入質(zhì)量分數(shù)3%重鉻酸鉀溶液中浸泡過夜，水洗；鐵蘇木素染液(鐵蘇木素A液與B液等體積混合)染色3 min，分化，水洗，返藍，流水沖洗；麗春紅酸性品紅染色5～10 min，漂洗。將切片放入磷鉬酸水溶液浸染1～3 min，苯胺藍染液染3～6 min。切片用質(zhì)量分數(shù)1%冰醋酸分化，連續(xù)快速浸入2缸無水乙醇洗掉醋酸和部分水，并浸入第3缸無水乙醇中徹底脫水5 min，二甲苯透明5 min，中性樹膠封片。每張Masson染色切片于40倍光學(xué)顯微鏡下任意選取3個視野拍照，采用ImageJ 1.52a圖像分析軟件分別計算圖像中膠原纖維及骨骼肌纖維面積，分別除以組織總面積，將結(jié)果取平均值進而得出每個標本的膠原纖維面積比及骨骼肌纖維面積比。膠原纖維呈藍色，肌纖維呈紅色。骨骼肌纖維呈長柱形，肌細胞內(nèi)含多個細胞核，位于肌膜的下方；平滑肌纖維呈長梭形，肌細胞內(nèi)含單個呈長橢圓形或桿狀的細胞核，位于細胞中央。染色結(jié)果由2位病理科醫(yī)師進行雙盲讀片，結(jié)果不一致則共同討論決定。

1.2.3免疫組織化學(xué)染色法測定標本中α-SMA表達 將石蠟切片置于65 ℃烘箱中烘片2 h，常規(guī)脫蠟至水，置于EDTA修復(fù)液中微波修復(fù)；冷卻后磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗15 min，質(zhì)量分數(shù)3%牛血清白蛋白封閉30 min，加入50 μl鼠抗人α-SMA單克隆抗體(1∶ 100)，4 ℃過夜孵育；PBS沖洗，加入50 μl HRP標記山羊抗小鼠抗體(1∶ 100)，常溫孵育50 min;PBS沖洗，加50 μl DAB溶液顯色；顯色完全后水洗，蘇木素復(fù)染，體積分數(shù)1%鹽酸乙醇分化，水洗，返藍，脫水，透明封片。每張免疫組織化學(xué)染色切片于光學(xué)顯微鏡下任意選取3個視野拍照，染色結(jié)果由2位病理科醫(yī)師進行雙盲讀片，結(jié)果不一致則共同討論決定。采用ImageJ 1.52a圖像分析軟件計算α-SMA的積分吸光度(integrated absorbance，IA)值。

1.2.4透射電子顯微鏡下觀察標本組織的超微結(jié)構(gòu) 采用簡單隨機抽樣方法選取17個(對照組2個，遮蓋范圍≤4 mm組、遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組、遮蓋范圍>6 mm組各5個)提上瞼肌標本行透射電子顯微鏡檢查。將所取組織加入0.1 mol/L PBS(pH 7.4)漂洗3次，每次15 min；0.1 mol/L PBS(pH 7.4)配置的質(zhì)量分數(shù)1%鋨酸固定液室溫(20 ℃)固定2 h，0.1 mol/L PBS(pH 7.4)漂洗。將組織放入不同體積分數(shù)乙醇中梯度脫水，每次15 min；丙酮和812包埋劑等體積混合液滲透過夜，純812包埋劑滲透過夜，60 ℃聚合48 h。使用切片機將組織縱向切為60～80 nm超薄切片，鈾鉛雙染色(質(zhì)量分數(shù)2%醋酸鈾飽和水溶液和枸櫞酸鉛各染色15 min)，室溫干燥過夜。透射電子顯微鏡下觀察并采集圖像，由2位病理科醫(yī)師進行雙盲讀片，結(jié)果不一致則共同討論決定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。采用Shapiro-Wilk檢驗分析所有計量資料的正態(tài)性，提上瞼肌肌力、上瞼遮蓋范圍、手術(shù)縮短量、膠原纖維和骨骼肌纖維面積比、α-SMA的IA值均不符合正態(tài)分布，以M(Q1，Q3)表示。遮蓋范圍≤4 mm組、遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組、遮蓋范圍>6 mm組和對照組各檢測指標總體差異比較采用Kruskal-WallisH檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。組間兩兩比較采用Bonferroni法，調(diào)整檢驗水準α'=0.05/6=0.008 3。

2 結(jié)果

2.1 各組提上瞼肌標本的組織病理學(xué)表現(xiàn)

光學(xué)顯微鏡下觀察可見，對照組標本的肌腹部為排列整齊、連接緊密的骨骼肌纖維，肌細胞膜結(jié)構(gòu)完整且有清晰的橫紋，細胞核位于周邊，肌細胞間結(jié)締組織分布均勻且稀疏。觀察組102個標本中共有18個標本(遮蓋范圍≤4 mm組10個、遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組6個、遮蓋范圍>6 mm組2個)檢測到骨骼肌纖維，遮蓋范圍≤4 mm組8個標本中僅含有纖維結(jié)締組織而無肌纖維。與對照組相比，觀察組標本中肌纖維數(shù)量均明顯減少，細胞間質(zhì)中膠原纖維及脂肪組織增生，部分骨骼肌細胞橫紋消失，肌內(nèi)膜不完整(圖1)。遮蓋范圍>6 mm組與遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組骨骼肌纖維病理改變相似。對照組、遮蓋范圍≤4 mm組、遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組與遮蓋范圍>6 mm組標本的膠原纖維面積比分別為16.03%(14.85%，17.18%)、35.87%(26.75%，45.14%)、25.33%(23.10%，29.53%)和31.37%(25.72%，34.27%)，總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(H=37.488，P<0.05)，其中遮蓋范圍≤4 mm組、遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組及遮蓋范圍>6 mm組的膠原纖維面積比明顯高于對照組，遮蓋范圍≤4 mm組標本的膠原纖維面積比明顯高于遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組標本，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.008 3)。對照組、遮蓋范圍≤4 mm組、遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組和遮蓋范圍>6 mm組標本的骨骼肌纖維面積比分別為43.74%(40.47%，48.37%)、0.00%(0.00%，11.98%)、0.00%(0.00%，0.00%)和0.00%(0.00%，0.00%)，總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(H=45.336，P<0.05)，其中對照組標本的骨骼肌纖維面積比明顯高于遮蓋范圍≤4 mm組、遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組及遮蓋范圍>6 mm組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.008 3)，遮蓋范圍≤4 mm組標本骨骼肌纖維面積比高于遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組及遮蓋范圍>6 mm組，但3個組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P≥0.008 3)(圖2)。

圖1 各組提上瞼肌標本中骨骼肌纖維的組織病理學(xué)表現(xiàn)(Masson ×40，標尺=500 μm) A：對照組標本的肌腹部含有豐富的骨骼肌纖維(黑色箭頭) B：遮蓋范圍≤4 mm組標本中無肌纖維分布，僅觀察到膠原纖維和血管(黑色箭頭) C：遮蓋范圍≤4 mm組標本骨骼肌纖維數(shù)量減少，排列稀疏，部分肌纖維橫紋消失，肌內(nèi)膜不完整(黑色箭頭) D：遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組標本中骨骼肌纖維數(shù)量減少，走行紊亂，部分肌纖維橫紋消失、肌內(nèi)膜不完整(黑色箭頭)，細胞間質(zhì)中膠原纖維及脂肪組織大量增生(★)，部分標本中可同時觀察到梭狀的平滑肌纖維(黃色箭頭)Figure 1 Histopathological manifestations of skeletal muscle fibers in levator palpebrae superiors muscle specimens of each group(Masson ×40,bar=500 μm) A:The muscle belly of specimens in the control group was rich in skeletal muscle fibers (black arrow) B:No muscle fiber was found in specimens of coverage ≤4 mm group,only collagen fibers and blood vessels (black arrows) were observed C:In specimens of coverage ≤4 mm group,the skeletal muscle fibers in the specimens were reduced and sparsely arranged;the striation of some muscle fibers disappeared;the endomysium (black arrow) was incomplete D:In specimens of coverage >4 mm to ≤6 mm group,the skeletal muscle fibers were reduced and disordered;the striation of some muscle fiber disappeared,and the endomysium (black arrow) was incomplete;collagen fibers and adipose tissue (★) in the intercellular substance were proliferated;spindle-shaped smooth muscle fibers (yellow arrow) were found in some specimens

圖2 各組提上瞼肌中膠原纖維面積比及骨骼肌纖維面積比的比較 與對照組比較，aP<0.008 3；與遮蓋范圍≤4 mm組比較，bP<0.008 3(Kruskal-Wallis H檢驗，Bonferroni校正法，n=6) A：各組膠原纖維面積比 B：各組骨骼肌纖維面積比 1：對照組；2：遮蓋范圍≤4 mm組；3：遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組；4：遮蓋范圍>6 mm組Figure 2 Comparison of collagen fiber area ratio and skeletal muscle fiber area ratio in levator palpebrae superiors muscle specimens among various groups Compared with the control group,aP<0.008 3;compared with the coverage ≤4 mm group,bP<0.008 3 (Kruskal-Wallis H test,Bonferroni correction, n=6) A：Collagen fiber area ratio among various groups B:Skeletal muscle fiber area ratio among various groups 1:Control group;2:Coverage ≤4 mm group;3:Coverage >4 mm to ≤6 mm group;4:Coverage >6 mm group

對照組提上瞼肌腱膜標本中主要為纖維結(jié)締組織，含有少量稀疏分布的平滑肌纖維，肌纖維呈梭狀，無橫紋結(jié)構(gòu)，單個細胞核位于中央。觀察組標本中共有78個標本(遮蓋范圍≤4 mm組17個、遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組26個、遮蓋范圍>6 mm組35個)檢測到平滑肌纖維，遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組有2個標本同時觀察到骨骼肌和平滑肌纖維。觀察組標本平滑肌纖維數(shù)量多于對照組，排列較紊亂，著色程度深淺不一，細胞間質(zhì)可觀察到膠原纖維和脂肪組織增生，3個組標本的平滑肌纖維數(shù)量、膠原纖維和脂肪組織的增生程度存在差異(圖3)。

圖3 各組提上瞼肌中平滑肌纖維組織病理學(xué)表現(xiàn)(Masson ×40，標尺=500 μm) A：對照組的提上瞼肌腱膜含有豐富的膠原纖維(★)和少量平滑肌纖維(黃色箭頭) B：遮蓋范圍≤4 mm組標本中觀察到稀疏分布的平滑肌纖維(黃色箭頭)和血管(黑色箭頭) C：遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組標本中觀察到較多的平滑肌纖維(黃色箭頭)，細胞間質(zhì)中可見較多的膠原纖維和脂肪組織增生(★) D：遮蓋范圍>6 mm組標本中觀察到大量平滑肌纖維(黃色箭頭)，細胞間質(zhì)中可見大量膠原纖維和脂肪組織增生(★)Figure 3 Histopathological manifestations of smooth muscle fibers in levator palpebrae superiors muscle specimens of each group(Masson ×40,bar=500 μm) A：Levator aponeurosis of the control group contained abundant collagen fibers (★) and a small amount of smooth muscle fibers (yellow arrows) B：Sparsely distributed smooth muscle fibers (yellow arrows) and blood vessels (black arrows) were found in specimens of the coverage ≤4 mm group C:More smooth muscle fibers (yellow arrows),collagen fibers and adipose tissue hyperplasia (★) were found in specimens of the coverage >4 mm to ≤6 mm group D:Abundant smooth muscle fibers (yellow arrows),collagen fibers and adipose tissue hyperplasia (★) were found in specimens of the coverage >6 mm group

2.2 各組提上瞼肌標本中α-SMA表達情況比較

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，α-SMA在提上瞼肌的平滑肌和血管平滑肌中均有陽性表達，對照組和遮蓋范圍≤4 mm組標本中可見少量的α-SMA陽性表達，遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組和遮蓋范圍>6 mm組標本中α-SMA陽性表達面積明顯多于對照組和遮蓋范圍≤4 mm組(圖4)。各組提上瞼肌標本中α-SMA的IA值總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(H=60.573，P<0.05)。遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組和遮蓋范圍>6 mm組的IA值明顯大于對照組和遮蓋范圍≤4 mm組，遮蓋范圍>6 mm組標本的IA值明顯大于遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.008 3)(表2)。

圖4 各組提上瞼肌標本中α-SMA的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×40，標尺=500 μm) 遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組和遮蓋范圍>6 mm組提上瞼肌的平滑肌纖維(黃色箭頭)和血管平滑肌纖維(黑色箭頭)中α-SMA的陽性表達面積明顯多于對照組和遮蓋范圍≤4 mm組 A：對照組 B：遮蓋范圍≤4 mm組 C：遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組 D：遮蓋范圍>6 mm組Figure 4 Immunohistochemical staining results of α-SMA in levator palpebrae superiors muscle specimens in each group (×40,bar=500 μm) Positive expression area of α-SMA in smooth muscle fibers (yellow arrow) and vascular smooth muscle fibers (black arrow) in the coverage >4 mm to ≤6 mm group and coverage ≥6 mm group were significantly larger than that in the control group and coverage ≤4 mm group A:Control group B:Coverage ≤4 mm group C:Coverage >4 mm to ≤6 mm group D:Coverage >6 mm group

表2 各組患者提上瞼肌標本中α-SMA的IA值比較[M(Q1,Q3)]Table 2 Comparison of the IA value of α-SMA in levatorpalpebrae superiors muscle specimens among the four groups[M(Q1,Q3)]組別眼數(shù)IA值對照組85 543.03(4 867.67,8 312.02)遮蓋范圍≤4 mm組177 195.28(5 935.69,14 058.29)遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組2655 584.18(33 861.88,80 419.32)ab遮蓋范圍>6 mm組35166 507.76(119 121.95,187 890.86)abcH值60.573P值<0.05 注:與對照組比較,aP<0.008 3;與遮蓋范圍≤4 mm組比較,bP<0.008 3;與遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組比較,cP<0.008 3(Kruskal-Wallis H檢驗,Bonferroni校正法) α-SMA:α-平滑肌肌動蛋白;IA:積分吸光度 Note:Compared with the control group,aP<0.008 3;compared with the coverage ≤4 mm group,bP<0.008 3;compared with the coverage >4 mmto ≤6 mm group,cP<0.008 3 (Kruskal-Wallis H test,Bonferroni correction) α-SMA:α-smooth muscle actin;IA:integrated absorbance

2.3 觀察組提上瞼肌標本中平滑肌細胞的超微結(jié)構(gòu)觀察

透射電子顯微鏡下觀察到10個標本(遮蓋范圍≤4 mm組1個、遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組4個、遮蓋范圍>6 mm組5個)中的平滑肌細胞呈長梭狀，細胞核較大，位于細胞中心，細胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的細胞器，部分線粒體損傷，細胞質(zhì)內(nèi)可見大量排列紊亂的肌絲，未見明顯的密斑及密體結(jié)構(gòu)，肌細胞膜表面可見大量膠原纖維附著，細胞外基質(zhì)中觀察到異常細胞外物質(zhì)分布(圖5)。其余7個標本未見平滑肌細胞，僅觀察到膠原纖維。

圖5 SCP患者提上瞼肌標本中平滑肌細胞的透射電子顯微鏡觀察 A：視野內(nèi)為縱切面的平滑肌細胞，細胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的細胞器，細胞核內(nèi)異染色質(zhì)著色較深(紅色箭頭)；部分線粒體損傷，線粒體脊壞死、溶解，線粒體內(nèi)可見因溶解形成的空泡(黃色箭頭)(×1 700，標尺=4 μm) B：視野內(nèi)為縱切面的平滑肌細胞，細胞膜表面附著有膠原纖維(黃色箭頭)，細胞間質(zhì)可見大量排列紊亂的膠原纖維(★)(×2 500，標尺=2 μm) C：視野內(nèi)為橫切面的平滑肌細胞，細胞質(zhì)內(nèi)可見大量排列紊亂的肌絲，可見異常著色物質(zhì)(紅色箭頭)(×2 500，標尺=2 μm) D：細胞外基質(zhì)中可見異常著色物質(zhì)(★)(×1 700，標尺=4 μm)Figure 5 Smooth muscle cells in the levator palpebrae superiors muscle specimens of the SCP patients observed by transmission electron microscopy A:The longitudinal section of smooth muscle cells was showed.The cytoplasm contained abundant organelles.The heterochromatin staining (red arrow) in the nucleus was deep;some mitochondria were damaged with necrotic and dissolved mitochondrial ridges,and visible vacuoles (yellow arrows) caused by dissolution (×1 700,bar=4 μm) B：The longitudinal section of smooth muscle cells was presented.Collagen fibers (yellow arrows) were attached to the cell membrane surface.A large number of disordered collagen fibers (★) were found in the intercellular substance (×2 500,bar=2 μm) C：The transverse section of smooth muscle cells was displayed.Abundant and disordered myofilaments,and abnormally stained substances (red arrow) were found in the cytoplasm (×2 500,bar=2 μm) D:Abnormally stained substances (★) was found in the extracellular matrix (×1 700,bar=4 μm)

3 討論

對SCP患者的提上瞼肌標本進行病理學(xué)觀察是研究其發(fā)病機制的主要方法。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，觀察組骨骼肌纖維的病理改變?yōu)榧M紋消失、數(shù)量減少及走行紊亂，并伴隨有纖維組織和脂肪組織增生，與既往研究報道一致[1,7-8,10]。由于不同下垂程度患者術(shù)中的提上瞼肌縮短量有較大差異，遮蓋范圍≤4 mm組標本僅含有少量的提上瞼肌肌腹部組織，而遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組及遮蓋范圍>6 mm組標本中含有的肌肉組織普遍多于遮蓋范圍≤4 mm組，但遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組及遮蓋范圍>6 mm組標本的骨骼肌纖維面積比低于遮蓋范圍≤4 mm組，SCP患者提上瞼肌中骨骼肌纖維的減少程度與上瞼下垂的嚴重程度相關(guān)，與既往研究結(jié)果相符[7-8]。在不同程度SCP患者的提上瞼肌標本中，我們觀察到遮蓋范圍≤4 mm組標本纖維化程度最高，這可能是因為其標本中含有較多的提上瞼肌腱膜組織，而腱膜組織富含膠原纖維。研究表明，提上瞼肌在Whitnall韌帶附近逐漸移行為腱膜組織，在顯微鏡下可以觀察到骨骼肌纖維逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槟z原纖維[15]。本研究中遮蓋范圍≤4 mm組部分標本中不含肌纖維而僅含纖維結(jié)締組織，術(shù)中提上瞼肌縮短量普遍小于10 mm，這表明靠近上瞼板的提上瞼肌腱膜組織中不含骨骼肌纖維。此外，在SCP患者3個組標本中均未觀察到再生肌纖維、萎縮性肌纖維和炎性細胞浸潤等骨骼肌營養(yǎng)不良的特征性病理改變。從臨床表現(xiàn)來看，SCP患者的上瞼下垂癥狀大多自出生起即被發(fā)現(xiàn)，并且無明顯的進行性加重，這與骨骼肌營養(yǎng)不良的典型臨床表現(xiàn)不符[17]，因此本研究結(jié)果支持SCP的發(fā)病機制為骨骼肌發(fā)育不全。

本研究的創(chuàng)新點在于觀察到SCP患者的提上瞼肌中含有平滑肌細胞，這類肌細胞是位于提上瞼肌肌腹部而非Müller肌中。Müller肌是上眼瞼的平滑肌，其從瞼板上10～14 mm處、提上瞼肌的下側(cè)發(fā)出，與提上瞼肌腱膜共同附著于上瞼板，形成提上瞼肌腱膜-Müller肌復(fù)合體[18]。在提上瞼肌縮短術(shù)中獲得的標本可能是該復(fù)合體[13]。因此同時觀察到骨骼肌和平滑肌時，平滑肌常被視為Müller肌，然而，Müller肌位于上瞼板和Whitnall韌帶之間，其與提上瞼肌腱膜連接疏松而與結(jié)膜連接緊密，術(shù)者沿著腱膜后間隙能夠盡可能將其與提上瞼肌分離[19-20]。本研究在取材時發(fā)現(xiàn)，遮蓋范圍≤4 mm組患者術(shù)中提上瞼肌的分離范圍大多位于Whitnall韌帶之下，因此其標本可能混有少量Müller肌。但在遮蓋范圍>4 mm患者的手術(shù)中，提上瞼肌分離的位置往往在Whitnall韌帶之上，取材時基本不會截取到Müller肌，因此按照理論來說，遮蓋范圍>4 mm患者標本中應(yīng)幾乎不含有平滑肌纖維。但本研究中遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組及遮蓋范圍>6 mm組大部分標本中仍可觀察到較多平滑肌纖維，這表明遮蓋范圍>4 mm患者提上瞼肌中含有平滑肌細胞。Alshehri等[14]研究發(fā)現(xiàn)，SCP患者Müller肌中的平滑肌纖維數(shù)量減少，Müller肌呈纖維化改變，其病理特征與本研究遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組及遮蓋范圍>6 mm組標本中平滑肌纖維增多的病理特征并不相符，這也進一步證實了本研究的觀點。

研究顯示，提上瞼肌中的骨骼肌細胞是由眶周間充質(zhì)細胞分化而來，Müller肌中平滑肌細胞的來源尚存爭議，但有研究推測其也可能來源于眶周間充質(zhì)細胞，表明二者在組織學(xué)上可能具有同源性[21-23]。在正常人提上瞼肌和Müller肌的連續(xù)組織切片上可以觀察到骨骼肌和平滑肌細胞在一定區(qū)域內(nèi)互相交織在一起，解剖學(xué)上該區(qū)域大致定位在Whitnall韌帶附近[24]。正常人的這2種肌細胞為發(fā)育正常的骨骼肌與平滑肌細胞，而本研究在SCP患者Whitnall韌帶以上的提上瞼肌組織中觀察到的平滑肌細胞不具有一般平滑肌細胞所特有的密斑、密體等結(jié)構(gòu)，細胞質(zhì)中肌絲排列紊亂，部分細胞器出現(xiàn)損傷，但免疫組織化學(xué)染色顯示α-SMA在該細胞內(nèi)呈陽性表達，證明了其為平滑肌源性，因此稱之為異常的平滑肌細胞。胚胎學(xué)研究表明，提上瞼肌、上直肌和上斜肌均由上中胚層復(fù)合體形成，提上瞼肌在胚胎發(fā)育的第16周與上直肌分離后進一步發(fā)育[11,19]。提上瞼肌中骨骼肌細胞的發(fā)育受肌肉神經(jīng)分布和多種信號通路的調(diào)節(jié)，其在胚胎發(fā)育至分娩后6個月期間對內(nèi)部因素的改變都十分敏感[21]。由于平滑肌的神經(jīng)支配、分化調(diào)節(jié)因子及信號傳導(dǎo)通路均與骨骼肌有較大差異[25-26]，因此本研究認為這類異常的平滑肌細胞可能會直接或間接影響提上瞼肌，尤其是提上瞼肌前部的骨骼肌發(fā)育過程，與骨骼肌纖維數(shù)量減少相關(guān)，這可以解釋為何其他研究在影像學(xué)上觀察到患者提上瞼肌前部的病理改變更加嚴重[27]。目前尚不清楚是何種因素導(dǎo)致了SCP患者的提上瞼肌中平滑肌細胞異常，具體的分子病理學(xué)機制也有待進一步研究。本研究結(jié)果表明，SCP的發(fā)病機制可能不僅是提上瞼肌中骨骼肌纖維的病變，還涉及到提上瞼肌中平滑肌纖維的病理改變，這為SCP的基礎(chǔ)研究提供了新的思路。

本研究仍存在一定的局限性。由于目前暫無合適的方法獲取到同年齡段的正常標本進行病理觀察，本研究中對照組標本均來自于遺體捐獻者，人群以50歲以上的中老年人為主，與觀察組年齡不匹配。SCP患者提上瞼肌的病理改變與年齡的相關(guān)性目前尚存爭議[8-9,11]，后續(xù)的研究需選取相同下垂程度的不同年齡段患者，進一步探討這些病理改變與年齡的相關(guān)性。盡管本研究中所有手術(shù)均由同一位經(jīng)驗豐富的眼整形科醫(yī)生進行，并遵循靠近提上瞼肌肌腹部取材的原則，然而不同下垂程度患者的取材部位仍然存在差異，故在進行病理分析時，需將病理標本的觀察結(jié)果與其取材部位相結(jié)合，以便更合理地探討SCP的發(fā)病機制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

志謝武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院病理科劉蓓、亢銘淇醫(yī)師參與本研究的病理閱片，透射電子顯微鏡的檢查結(jié)果由中國科學(xué)院武漢病毒研究所提供

作者貢獻聲明羅彥竹：采集數(shù)據(jù)，研究實施，參與選題、設(shè)計及資料的分析和解釋，統(tǒng)計分析，論文撰寫；黎冬平、王育紅：醞釀和設(shè)計實驗，分析數(shù)據(jù)，對文章的知識性內(nèi)容作批判性審閱，提供經(jīng)費；周娜、李俊萍：采集數(shù)據(jù)、分析數(shù)據(jù)，修改論文關(guān)鍵性結(jié)果和結(jié)論