李彤彤，張則，陳佳靜，李陳飛，盧安然，周廣防，馮秀麗

( 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物細(xì)菌學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/教育部動(dòng)物健康與食品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095)

眾所周知，法氏囊(bursa of fabricius，BF)是公認(rèn)的鳥類特有的中樞體液免疫器官，為研究人類及哺乳動(dòng)物的中樞體液器官功能機(jī)制、疫苗開發(fā)等提供了理想的研究模型[1-3]。早在1956年，手術(shù)切除新生雛雞的法氏囊損害了該雞只對(duì)鼠傷寒沙門菌O型抗原2的抗體反應(yīng)，就證實(shí)了法氏囊是鳥類B淋巴細(xì)胞生成的關(guān)鍵部位[1-3]?？蒲腥藛T對(duì)法氏囊功能機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，與人或小鼠模型相比，鳥類B細(xì)胞的發(fā)育具有一些獨(dú)特的特性。據(jù)報(bào)道B細(xì)胞的發(fā)育經(jīng)歷了3個(gè)不同的階段，即法氏囊前、法氏囊和法氏囊后，這3個(gè)階段在B細(xì)胞發(fā)育中所起的作用有根本的不同[4-5]。B細(xì)胞分化和抗體多樣化伴隨著生物活性分子的調(diào)節(jié)和免疫誘導(dǎo)的激活[3,6]。法氏囊源的活性分子對(duì)B細(xì)胞及抗體的影響是科研人員非常關(guān)注的話題。囊素三肽(Lys-His-Gly-NH2)是最早報(bào)道的來源于BF的活性分子，可促進(jìn)B細(xì)胞的分化[7]，可選擇性誘導(dǎo)雞B細(xì)胞分化，促進(jìn)免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)從IgM向IgG的轉(zhuǎn)變[8]。法氏囊來源的法氏囊五肽Ⅱ(bursal pentapeptide，BPP-Ⅱ)，調(diào)節(jié)了禽前B淋巴細(xì)胞DT40參與同源重組的各種基因表達(dá)，增強(qiáng)了雞免疫抗體的產(chǎn)生[9]。而且，BPP-Ⅱ能夠調(diào)節(jié)涉及多種途徑和免疫相關(guān)的生物學(xué)過程的雜交瘤細(xì)胞中多個(gè)基因的差異表達(dá)[10]。這些結(jié)果揭示了法氏囊源活性多肽調(diào)節(jié)抗體反應(yīng)及B細(xì)胞功能的機(jī)制，不過法氏囊源活性肽調(diào)節(jié)未成熟B細(xì)胞的功能及分子基礎(chǔ)還有待于進(jìn)一步探索。

法氏囊活性肽BP7是近期報(bào)道的一種來源于法氏囊、促進(jìn)抗體反應(yīng)及B細(xì)胞自噬的一種活性七肽[11]。為了研究法氏囊源性肽對(duì)雞未成熟B細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，本研究采用基因芯片，對(duì)BP7處理后DT40細(xì)胞的基因表達(dá)譜進(jìn)行了篩選，并應(yīng)用富集途徑和功能分類分析方法，對(duì)禽未成熟B細(xì)胞系DT40細(xì)胞中差異表達(dá)的基因及生物學(xué)功能進(jìn)行分析，從而為未成熟B細(xì)胞的分化發(fā)育提供重要的參考信息。

1 材料與方法

1.1 法氏囊活性肽和細(xì)胞系

BP7由南京金斯瑞科技公司合成，純度為95%以上。

DT40細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，采用含有10%胎牛血清和5%雞血清的1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 DT40細(xì)胞的培養(yǎng)及檢測(cè)

將生長狀態(tài)良好的DT40細(xì)胞分裝到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)12 h后，將2 μg/mL、0.2 μg/mL、0.02 μg/mL 3個(gè)劑量的BP7加入到6孔細(xì)胞板中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，同時(shí)設(shè)計(jì)PBS和0.02 μg/mL BSA分別作為對(duì)照。收獲全細(xì)胞，加入TRIzol試劑提取總RNAs，設(shè)計(jì)DT40細(xì)胞的IgM引物序列，Primer-F-GTCAAAGGAGGAGCTGAACG和Primer-R-TGTGTGTGACCCTGCAGGTG，采用一步法定量PCR試劑盒檢測(cè)IgM的mRNA水平。

1.3 基因芯片分析

將生長狀態(tài)良好的DT40細(xì)胞分裝到T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，然后用0.02 μg/mL BP7加入到細(xì)胞瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，收獲全細(xì)胞，加入TRIzol試劑提取總RNAs，由北京博奧公司完成基因表達(dá)譜分析。試驗(yàn)步驟為：采用TRIzol (Invitrogen,Gaithersburg,MD,USA)提取細(xì)胞中的總 RNA。并進(jìn)一步采用 NucleoSpin?RNA清理試劑盒(MACHEREY-NAGEL,Germany)對(duì)總 RNA 進(jìn)行過柱純化及質(zhì)檢合格。

樣品RNA的熒光標(biāo)記及雜交，即采用晶芯?cRNA 擴(kuò)增標(biāo)記試劑盒進(jìn)行樣品RNA 熒光標(biāo)記。基本步驟如下：以總RNA起始，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA的第一條鏈，然后用RNase H 將雜合鏈中的RNA 切成短片段，DNA 聚合酶 以RNA短片段為引物延伸，合成2nd-strand cDNA，并純化雙鏈cDNA。以cDNA 為模板，體外轉(zhuǎn)錄合成 cRNA；然后用CbcScriptⅡ酶，隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄；最后cDNA用KLENOW酶標(biāo)記。標(biāo)記的DNA溶于雜交液中(2倍GEx Hyb Buffer，HI-RPM,25%甲酰胺)，于45 ℃雜交過夜。雜交結(jié)束后，先在42 ℃左右含0.2%十二熔基硫酸鈉(SDS)，2倍檸檬酸鈉緩沖液(SSC)的液體中洗5 min，而后在0.2倍SSC中室溫洗5 min。玻片甩干后即可用于掃描。

芯片用安捷倫芯片掃描儀進(jìn)行掃描，得到雜交圖片。采用特征提取圖像分析軟件對(duì)芯片圖像進(jìn)行分析，把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，并采用GeneSpring GX軟件對(duì)信號(hào)值進(jìn)行歸一化處理，然后用絕對(duì)變化倍數(shù)≥2進(jìn)行差異基因篩選，并進(jìn)一步開展差異表達(dá)基因的通路分析，即在GenMAPP和KEGG的系列通路中的分布情況。此外，基因本體論(Gene Ontology,GO)分析差異表達(dá)基因在GO體系中各亞型分類的情況。

1.4 靶基因的定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)

用0.02 μg/mL BP7處理DT40細(xì)胞4 h，提取細(xì)胞總RNA，從芯片數(shù)據(jù)的差異表達(dá)的基因中，隨機(jī)選擇Ppara、Atg2a1、Rap1b、Fzr1、Fgf8、Gal13等6個(gè)差異表達(dá)基因，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行驗(yàn)證。特異引物序列如表1所示。

表1 選定基因的定量PCR引物

使用ABI 7300實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)進(jìn)行RT-qPCR操作。GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 BP7誘導(dǎo)雞未成熟B細(xì)胞分泌IgM產(chǎn)生

以DT40細(xì)胞系為模型，BP7刺激后檢測(cè)IgM水平，結(jié)果如圖1所示。與PBS對(duì)照組相比，經(jīng)0.02 μg/mL BP7刺激的DT40細(xì)胞組，產(chǎn)生的IgM mRNA水平明顯升高(圖1A)，而0.2 μg/mL和2 μg/mL BP7刺激的DT40細(xì)胞組的IgM水平與PBS對(duì)照組相似，無顯著差異。同時(shí)，0.02 μg/mL BP7刺激的DT40細(xì)胞組產(chǎn)生的IgM mRNA水平也明顯高于0.02 μg/mL BSA對(duì)照組(圖1B)。

2.2 BP7調(diào)節(jié)DT40細(xì)胞的基因表達(dá)譜

以DT40細(xì)胞為模型，采用基因芯片技術(shù)檢測(cè)了0.02 μg/mL BP7刺激的DT40細(xì)胞的基因表達(dá)譜，結(jié)果如圖2所示。熱圖分析顯示了BP7處理后DT40細(xì)胞中的基因表達(dá)情況(圖2A)。在規(guī)定的閾值下，與對(duì)照組相比，BP7處理的DT40細(xì)胞中有733個(gè)上調(diào)基因和612個(gè)下調(diào)基因(圖2B)，其中BP7處理的DT40細(xì)胞中大部分基因的調(diào)控倍數(shù)在1和-1 lg2比值之間(圖2B)。

為了證實(shí)基因芯片的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，采用qRT-PCR技術(shù)，從芯片數(shù)據(jù)中差異表達(dá)的基因中，隨機(jī)檢測(cè)了BP7處理DT40細(xì)胞的6個(gè)差異表達(dá)基因。與對(duì)照組相比，BP7處理后DT40細(xì)胞Ppara、Atg2a1和Rap1b基因表達(dá)上調(diào)，而Fzr1、Fgf8和Gal13基因表達(dá)下調(diào)。這些結(jié)果與BP7處理的DT40細(xì)胞的基因芯片數(shù)據(jù)分析一致(圖2C)

2.3 BP7調(diào)節(jié)DT40細(xì)胞的通路分析

為了全面了解雞未成熟B細(xì)胞的生物途徑調(diào)控，利用GAGE分析工具，在KEGG數(shù)據(jù)庫和PANTHER數(shù)據(jù)庫中，對(duì)BP7處理的DT40細(xì)胞的差異基因所涉及的信號(hào)和代謝途徑進(jìn)行分析,結(jié)果如表2所示。BP7誘導(dǎo)DT40細(xì)胞的差異表達(dá)基因涉及17條通路，包括神經(jīng)活性配體受體相互作用、ECM受體互作、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體互作3個(gè)受體互作通路，以及胰島素/IGF途徑蛋白激酶B信號(hào)級(jí)聯(lián)、泛素蛋白酶體途徑、胰島素/IGF途徑絲裂原活化蛋白激酶/MAP激酶級(jí)聯(lián)和Jak-STAT 信號(hào)通路4個(gè)信號(hào)通路。代謝和蛋白質(zhì)分解相關(guān)的通路包括煙酸和煙酰胺代謝、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解和黑色素生成3種。此外，其他細(xì)胞生物學(xué)功能相關(guān)的通路包括緊密連接、粘著、粘合連接、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子、血管平滑肌收縮、縫隙連接和吞噬體。此外，本文還對(duì)BP7刺激DT40細(xì)胞的差異基因涉及的通路進(jìn)一步分析，其富集途徑網(wǎng)絡(luò)如圖3所示。c細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體互作是BP7刺激后DT40細(xì)胞相關(guān)途徑中的關(guān)鍵通路，與Jak-STAT信號(hào)通路、粘合連接和縫隙連接等通路密切相關(guān)。

A.基因表達(dá)譜熱圖；B.差異表達(dá)基因柱狀圖分析；C.差異基因驗(yàn)證圖2 BP7調(diào)節(jié)DT40細(xì)胞的基因表達(dá)譜

表2 BP7刺激后DT40細(xì)胞中差異表達(dá)基因涉及的通路分析

續(xù)表2

圖3 BP7刺激后DT40細(xì)胞中涉及的通路相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

2.4 BP7調(diào)節(jié)DT40細(xì)胞中GO功能分析

為進(jìn)一步探討B(tài)P7在未成熟B細(xì)胞生物學(xué)功能中的分子基礎(chǔ)，根據(jù)GO數(shù)據(jù)庫對(duì)BP7刺激的DT40細(xì)胞的差異表達(dá)基因進(jìn)行了細(xì)胞組分、分子功能和生物學(xué)過程分析。圖4總結(jié)了P值TOP30的顯著富集項(xiàng)。BP7處理的DT40細(xì)胞中P值TOP30的GO項(xiàng)中，包括15個(gè)分子功能，8個(gè)生物過程和7個(gè)細(xì)胞成分。

圖4 BP7刺激后DT40細(xì)胞差異表達(dá)基因涉及的GO功能分析(P值在TOP30以內(nèi))

為了證實(shí)免疫系統(tǒng)的分子特征，本文還分析了參與免疫相關(guān)功能過程的差異基因表達(dá)。如表3所示，在BP7處理的DT40細(xì)胞中，涉及的免疫相關(guān)GO項(xiàng)主要包括免疫應(yīng)答、免疫應(yīng)答信號(hào)、Th1型免疫應(yīng)答、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)及其受體活性等方面。

表3 BP7刺激后DT40細(xì)胞中差異表達(dá)基因涉及的免疫相關(guān)功能分析

3 討論

法氏囊是目前公認(rèn)的鳥類特有的中樞免疫器官，是B淋巴細(xì)胞分化成熟的關(guān)鍵部位。然而法氏囊源生物活性肽在未成熟B細(xì)胞發(fā)育中獨(dú)特的分子基礎(chǔ)和作用機(jī)制卻鮮有報(bào)道。DT40細(xì)胞是來源于禽白血病病毒感染引起的法氏囊淋巴瘤細(xì)胞，是一種常見的、研究B細(xì)胞功能和機(jī)制的未成熟B細(xì)胞模型[12-13]。BP7是近期報(bào)道的一種法氏囊活性肽，能夠促進(jìn)明顯的疫苗免疫反應(yīng)，且誘導(dǎo)鼠源未成熟B細(xì)胞中多種信號(hào)通路，同時(shí)發(fā)現(xiàn)BP7促進(jìn)鼠源未成熟B細(xì)胞自噬[11]，然而其調(diào)控雞B細(xì)胞的功能機(jī)制尚不清楚。

為了探討B(tài)P7對(duì)雞未成熟B細(xì)胞的作用機(jī)制，本研究中選擇禽DT40細(xì)胞作為雞未成熟B細(xì)胞模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.02 μg/mL BP7能顯著提高DT40細(xì)胞IgM的mRNA水平。高通量測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，BP7誘導(dǎo)DT40細(xì)胞中差異表達(dá)的基因涉及到胰島素/IGF途徑蛋白激酶B信號(hào)級(jí)聯(lián)、泛素蛋白酶體途徑、胰島素/IGF途徑絲裂原活化蛋白激酶/MAP激酶級(jí)聯(lián)和Jak-STAT信號(hào)通路4個(gè)信號(hào)通路。胰島素樣生長因子受體的上游調(diào)節(jié)因子Klotho在CD19+B細(xì)胞中高表達(dá)，提示了胰島素通路參與了B細(xì)胞相關(guān)的淋巴瘤的發(fā)展[14 ]。泛素化蛋白通路參與B細(xì)胞的介導(dǎo)的MHC-Ⅱ抗原遞呈功能且與BCR功能相關(guān)[15]。據(jù)報(bào)道，MAP激酶級(jí)聯(lián)和Jak-STAT信號(hào)通路也參與B細(xì)胞的生物過程[16-17]。這些結(jié)果提示，多種信號(hào)通路可能均參與B細(xì)胞的分化發(fā)育過程。為了進(jìn)一步探索BP7調(diào)節(jié)的通路對(duì)B細(xì)胞的功能，本文中通路網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體互作是BP7刺激DT40細(xì)胞的重要靶功能通路。據(jù)報(bào)道，抗原和細(xì)胞因子受體信號(hào)引導(dǎo)未成熟B細(xì)胞的發(fā)育[18]。本研究中，GO通路分析發(fā)現(xiàn)，BP7能夠調(diào)節(jié)未成熟B細(xì)胞中細(xì)胞因子的產(chǎn)生及分泌。由此可以推測(cè)，上述信號(hào)通路與B細(xì)胞發(fā)育及分化成熟等生物學(xué)功能密切相關(guān)。

此外，差異表達(dá)的基因還參與了多種免疫相關(guān)的生物學(xué)過程，主要包括免疫應(yīng)答、免疫應(yīng)答信號(hào)、Th1型免疫應(yīng)答、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)及其受體活性等方面。未成熟B細(xì)胞的分化成熟是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，而且B細(xì)胞發(fā)育不僅是體液免疫反應(yīng)的重要組成部分，也是先天性免疫及獲得性免疫應(yīng)答的重要組成部分[19-20]。抗原和細(xì)胞因子受體信號(hào)引導(dǎo)幼稚成熟B細(xì)胞的發(fā)育。未成熟B細(xì)胞到外周成熟B細(xì)胞池的陽性選擇主要受強(qiáng)BCR信號(hào)調(diào)節(jié)，其次受BAFFR信號(hào)調(diào)節(jié)。這些信號(hào)促進(jìn)了未成熟B細(xì)胞向過渡和成熟B細(xì)胞的分化，對(duì)成熟B細(xì)胞的存活起重要作用[21]。Th1免疫反應(yīng)與B細(xì)胞分化及功能密切相關(guān)[22-23]。本研究結(jié)果顯示，法氏囊活性肽BP7能夠促進(jìn)B細(xì)胞分泌IgM，揭示了其調(diào)節(jié)B細(xì)胞的分子基礎(chǔ)，為研究B細(xì)胞的分化成熟及功能機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。

總之，本研究證實(shí)了法氏囊活性肽BP7能夠誘導(dǎo)禽未成熟B細(xì)胞產(chǎn)生顯著的IgM水平；生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，BP7誘導(dǎo)雞未成熟B細(xì)胞的差異表達(dá)基因參與了多種通路，其中細(xì)胞因子受體互作是其中的關(guān)鍵通路，而且涉及到多種免疫相關(guān)的生物學(xué)過程。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究法氏囊活性肽調(diào)控B細(xì)胞分化的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。