任彩霞 韓昆 劉媛 邢文秀 鹿恩邦 鞏雪 萬(wàn)美燕

1青島大學(xué) 266071；2青島市市立醫(yī)院腎內(nèi)科 266011

鈣化是慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)的一個(gè)顯著特征，與心血管疾病和全因死亡率密切相關(guān)[1]。尿毒癥毒素、代謝紊亂、微量元素異常等對(duì)腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)患者免疫系統(tǒng)造成很大影響[2]。慢性腎衰竭特別是尿毒癥患者整個(gè)免疫系統(tǒng)均發(fā)生復(fù)雜的變化，包括天然性免疫和獲得性免疫，既有免疫激活(細(xì)胞因子和急性期蛋白增高)，又有免疫抑制(對(duì)感染和腫瘤免疫反應(yīng)障礙，疫苗接種后抗體生成率低)。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，免疫炎癥通過(guò)誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化、調(diào)節(jié)骨代謝因子的表達(dá)在血管鈣化(vascular calcification，VC)的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。盡管大量證據(jù)表明巨噬細(xì)胞是引發(fā)VC的關(guān)鍵成分，但天然性免疫細(xì)胞和獲得性免疫細(xì)胞之間的相互作用尚未得到充分論證[3]。本研究以PD患者為研究對(duì)象，分析影響腹主動(dòng)脈鈣化(abdominal aortic calcification，AAC)的相關(guān)因素以及淋巴細(xì)胞亞群與AAC的關(guān)系，并進(jìn)一步探討天然性和獲得性免疫在AAC發(fā)病中的作用。

資料與方法

一、研究對(duì)象

納入2018年9月至2019年10月在青島市市立醫(yī)院腎內(nèi)科確診為尿毒癥并進(jìn)行PD治療的患者作為研究對(duì)象。入選標(biāo)準(zhǔn)：持續(xù)不臥床腹膜透析(continuous ambulatory peritoneal dialysis，CAPD)至少3個(gè)月且年齡大于18歲，所有患者均使用廣州百特醫(yī)療用品有限公司生產(chǎn)的低鈣腹膜透析液(Na+132 mmol/L，Cl-95 mmol/L，Mg2+0.25 mmol/L，Ca2+1.24 mmol/L，乳酸根40 mmol/L)，透析方式為CAPD，每天換液4次，每次2000 mL，透析劑量為8 L/d，透析齡為44.10(13.20，54.00)個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)近3個(gè)月內(nèi)發(fā)生感染或使用抗生素；(2)近3個(gè)月內(nèi)使用激素或免疫抑制劑；(3)近3個(gè)月內(nèi)有過(guò)手術(shù)或創(chuàng)傷史；(4)有精神疾患或無(wú)法配合者；(5)其他嚴(yán)重疾病，如惡性腫瘤、嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良[4]、動(dòng)脈瘤、主動(dòng)脈夾層、肺動(dòng)脈高壓等。本研究經(jīng)青島市市立醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

二、方法

1.一般資料收集 記錄患者性別、年齡、透析齡、原發(fā)病(高血壓腎病、糖尿病腎病、慢性腎小球腎炎等)、用藥情況、透析前血壓等。

2.血標(biāo)本收集 所有入選的患者抽血檢查前禁食8 h，于PD治療前留取血標(biāo)本，送至我院檢驗(yàn)科檢測(cè)各項(xiàng)血生化指標(biāo)包括血紅蛋白、白蛋白、血清肌酐、尿素氮、甲狀旁腺激素、血磷、血鈣、堿性磷酸酶、超敏 C 反應(yīng)蛋白、總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等。

3.淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 所有入選的患者抽血檢查前禁食8 h，于PD治療前留取血標(biāo)本，送至我院檢驗(yàn)科使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分別得出CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD19+、CD16+CD56+、Treg淋巴細(xì)胞比例及CD8+DR+淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD4+/CD8+比值。

4.AAC評(píng)分測(cè)定 按照改善全球腎臟病預(yù)后組織(kidney disease improving global outcomes，KDIGO)指南建議，用側(cè)位腹部X線片檢測(cè)患者VC情況[5]。由放射科醫(yī)師對(duì)患者進(jìn)行腹部側(cè)位X線平片檢查，側(cè)位片上以L1～L4范圍內(nèi)對(duì)應(yīng)的主動(dòng)脈為腹主動(dòng)脈，以腰椎間隙為界分為L(zhǎng)1～L4段，分別評(píng)價(jià)AACs。AACs的評(píng)定：采用Kauppla等[6]報(bào)道的半定量積分系統(tǒng)評(píng)分方法，分別評(píng)價(jià)L1～L4每個(gè)節(jié)段腹主動(dòng)脈前壁、后壁鈣化的嚴(yán)重程度，根據(jù)該節(jié)段鈣化累及范圍給予1分(范圍<1/3)、2分(范圍1/3～2/3)和3分(范圍>2/3)，累積各節(jié)段的總得分即為該患者的AACs(0～24分)。分別由兩位有經(jīng)驗(yàn)的放射科醫(yī)生對(duì)腹部側(cè)位X平片進(jìn)行評(píng)分，取平均值；若相差5分，則請(qǐng)第3位醫(yī)生對(duì)其評(píng)分，取3個(gè)評(píng)分的平均值作為AACs。AACs分為無(wú)和輕度鈣化組(0≤AACs≤4分)、中度鈣化組(5≤AACs≤15分)和重度鈣化組(16≤AACs≤24)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)資料以Mean±SD表示，若方差齊，多組間數(shù)據(jù)比較采用F檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)；若方差不齊，多組間數(shù)據(jù)比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用以M(1/4，3/4)表示，采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)或者精確概率法。相關(guān)性研究采用Spearman相關(guān)性分析。Logistic回歸分析患者AAC的危險(xiǎn)因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、病例資料

本研究納入腹膜透析患者86例，年齡為(61.6±12.6)歲，其中男52例(60.50%)，39例(75%)發(fā)生AAC；女34例(39.53%)，29例(85.29%)發(fā)生AAC。原發(fā)病包括：糖尿病腎病35例(40.7%)，慢性腎小球腎炎34例(39.5%)，高血壓腎病10例(11.6%)，其他原因7例(8.1%)。

二、不同程度AAC組間臨床資料比較

86例PD患者中無(wú)和輕度鈣化41例、中度鈣化28例、重度鈣化17例。3組患者年齡、原發(fā)疾病為糖尿病腎病、慢性腎小球腎炎以及白蛋白、血磷、堿性磷酸酶水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其余生化指標(biāo)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(表1)

表1 不同程度AAC組間臨床資料比較

三、不同程度AAC組間外周血淋巴細(xì)胞亞群的比較

3組患者外周血CD8+DR+淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、Treg細(xì)胞百分率、NK淋巴細(xì)胞百分率、CD4+/CD8+比值組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余指標(biāo)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(表2)

表2 不同程度AAC組間外周血淋巴細(xì)胞亞群的比較(Mean±SD)

四、AAC與各臨床資料的相關(guān)性分析

PD患者AAC與年齡(r=0.352，P<0.05)、透析齡(r=0.284，P<0.05)、甲狀腺激素(r=0.226，P<0.05)、血磷(r=0.299，P<0.05)、堿性磷酸酶(r=0.265，P<0.05)、超敏C反應(yīng)蛋白(r=0.285，P<0.05)呈正相關(guān)，與白蛋白呈負(fù)相關(guān)(r=-0.222，P<0.05)。(表3)

五、AAC與淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性分析

PD患者AAC與CD8+DR+淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(r=0.292，P<0.05)、NK淋巴細(xì)胞百分率(r=0.228，P<0.05)、CD4+/CD8+比值(r=0.236，P<0.05)呈正相關(guān)，與Treg細(xì)胞百分率(r=-0.354，P<0.05)呈負(fù)相關(guān)，其余變量與AAC相關(guān)系數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(表4)

表4 AACs與外周血淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性

六、中重度AAC影響因素的多因素Logistic回歸分析

以是否發(fā)生中重度AAC(AACs>4分)為因變量，將年齡、透析齡、甲狀旁腺激素、血磷、堿性磷酸酶、超敏C反應(yīng)蛋白、白蛋白、CD8+DR+淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD4+/CD8+比值、Treg細(xì)胞百分率、NK淋巴細(xì)胞百分率作為自變量行二元Logistic回歸分析，結(jié)果顯示：高齡(OR=1.060，P=0.024)、CD4+/CD8+(OR=25.441，P=0.023)、Treg(OR=0.427，P=0.001)是AAC的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。(表5)

表5 中重度AAC影響因素的多因素Logistic回歸分析

討 論

在CKD病程發(fā)展中，一系列病理反應(yīng)如氧化應(yīng)激、高磷血癥、氮質(zhì)血癥以及透析等均會(huì)導(dǎo)致患者免疫功能改變，T淋巴細(xì)胞大量減少，表現(xiàn)出免疫功能下降的狀態(tài)。當(dāng)CKD發(fā)展至尿毒癥，因毒素潴留、代謝紊亂等影響，免疫激活和免疫抑制兩種狀態(tài)并存[7]。雖然終末期腎衰竭患者存在T淋巴細(xì)胞激活，但T淋巴細(xì)胞免疫功能是不健全的[8]。免疫系統(tǒng)的慢性激活狀態(tài)加速動(dòng)脈粥樣硬化、VC和誘發(fā)心功能不全[9]。淋巴細(xì)胞是構(gòu)成免疫系統(tǒng)和執(zhí)行免疫功能的主要細(xì)胞群體，進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群分析對(duì)于了解機(jī)體免疫功能狀態(tài)有重要意義。人體主要的淋巴細(xì)胞亞群可以分為T(mén)淋巴細(xì)胞亞群、B淋巴細(xì)胞亞群和NK淋巴細(xì)胞亞群。本研究證實(shí)了淋巴細(xì)胞亞群改變可能與PD患者的AAC有一定的關(guān)聯(lián)性，為CKD患者AAC防治提供重要的線索及理論依據(jù)。

T淋巴細(xì)胞(CD3+)介導(dǎo)適應(yīng)性細(xì)胞免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)體液免疫發(fā)揮輔助性作用。Th細(xì)胞(CD3+CD4+)即輔助性T細(xì)胞、Ts細(xì)胞(CD3+CD8+)即殺傷性T細(xì)胞，是來(lái)自兩個(gè)不同亞群的功能性T淋巴細(xì)胞，在免疫應(yīng)答中分別起著正向和負(fù)向調(diào)節(jié)作用。在機(jī)體中，CD8+淋巴細(xì)胞決定細(xì)胞免疫殺傷功能和組織損傷情況，而CD4+淋巴細(xì)胞影響細(xì)胞免疫分泌功能。所以，CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞占據(jù)的百分率以及CD4+/CD8+比值是衡量人體細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)，只有在CD4+/CD8+比值正常，才確保機(jī)體免疫功能的正常，一旦出現(xiàn)比值下降或者倒置情況，就表明機(jī)體免疫功能出現(xiàn)紊亂[10]。Treg細(xì)胞(CD4+CD25+)即調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，在調(diào)節(jié)免疫耐受和預(yù)防自身免疫性疾病中起著至關(guān)重要的作用。Treg細(xì)胞除了廣為人知的抑制CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞的活化功能，還抑制天然免疫細(xì)胞諸如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞等[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，PD患者AAC與活化的Ts細(xì)胞(CD8+DR+)計(jì)數(shù)、NK淋巴細(xì)胞百分率、CD4+/CD8+比值呈正相關(guān)，與Treg細(xì)胞百分率呈負(fù)相關(guān)，且多因素Logistic回歸分析提示CD4+/CD8+、Treg細(xì)胞百分率為AAC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。有研究發(fā)現(xiàn)，激活的T淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生細(xì)胞因子如γ-干擾素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(tumour necrosin factor,TGF)-β、腫瘤壞死因子(turnor necrasis factor,TNF)-α等炎性細(xì)胞因子，促進(jìn)VSMC表達(dá)骨堿性磷酸酶和向成骨樣表型轉(zhuǎn)化，參與VC的調(diào)控[13]。通過(guò)檢測(cè)骨堿性磷酸酶的活性和礦化基質(zhì)發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞分泌TNF-α激活cAMP，誘導(dǎo)VSMC向成骨樣細(xì)胞分化[14]。新近的研究發(fā)現(xiàn)，激活的T細(xì)胞表達(dá)核因子-κB 受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)可直接促進(jìn)骨保護(hù)素的生成，骨保護(hù)素在抑制破骨細(xì)胞生成和VC中有重要作用，提示T細(xì)胞通過(guò)RANKL調(diào)節(jié)VC的發(fā)生[15]。Treg細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生TGF-β和IL-10抗炎細(xì)胞因子來(lái)降低免疫應(yīng)答[16]。對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的研究表明，TGF-β促進(jìn)VSMC分化，但在高磷酸鹽條件下降低BMP2的表達(dá)[17]。還有研究表明，維持性血液透析患者冠狀動(dòng)脈鈣化積分與Treg細(xì)胞百分率呈負(fù)相關(guān)[18]。

B淋巴細(xì)胞(CD3-CD19+)產(chǎn)生抗體發(fā)揮特異性體液免疫功能。B細(xì)胞通過(guò)分泌抗體和細(xì)胞因子參與鈣化。既往研究證實(shí)，較高的血漿自身免疫性疾病相關(guān)抗體水平與較高的冠狀動(dòng)脈鈣化水平相關(guān)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，3組不同程度AAC患者中B淋巴細(xì)胞百分率無(wú)明顯差異，且AAC與B淋巴細(xì)胞百分率無(wú)明顯相關(guān)性。與既往研究不一致，其原因可能是樣本量不足，研究具有一定局限性和缺陷，仍需擴(kuò)大樣本量做進(jìn)一步的深入研究。

NK淋巴細(xì)胞(CD3-/CD16+CD56+)即自然殺傷細(xì)胞，具有識(shí)別被病毒感染的細(xì)胞表面相應(yīng)配體后施加殺傷的作用。NK細(xì)胞激活，釋放細(xì)胞毒性分子、顆粒酶和穿孔素或通過(guò)死亡受體配體，導(dǎo)致靶細(xì)胞凋亡，參與VC發(fā)生、發(fā)展[20]。另一方面，NK細(xì)胞可通過(guò)釋放γ-干擾素，TNF或IL-10等炎性細(xì)胞因子間接發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)，PD患者重度鈣化和中度鈣化組NK淋巴細(xì)胞百分率高于無(wú)和輕度鈣化組，且NK淋巴細(xì)胞百分率與AAC呈正相關(guān)。總體而言，這些觀察結(jié)果表明心血管鈣化通過(guò)先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)來(lái)綜合調(diào)節(jié)。

導(dǎo)致CKD患者VC因素較多，傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素有：老化、吸煙、高血壓、高膽固醇血癥和糖尿病等。除此之外，還有礦物質(zhì)代謝紊亂、心血管組織過(guò)早衰老、炎癥、氧化應(yīng)激等非傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素。本研究發(fā)現(xiàn)，AAC與年齡、透析齡、甲狀旁腺激素、血磷、堿性磷酸酶、超敏C反應(yīng)蛋白呈正相關(guān)(P<0.05)，與白蛋白呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。多因素Logistic回歸分析提示患者年齡為AAC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，充分說(shuō)明諸多因素在VC形成中的重要作用，與相關(guān)報(bào)道一致[21]。研究證實(shí)，衰老的VSMC中Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2和堿性磷酸酶的表達(dá)顯著上調(diào)，細(xì)胞向成骨細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，同時(shí)年齡也是影響成骨細(xì)胞生長(zhǎng)和礦化的獨(dú)立因素，衰老內(nèi)皮釋放的囊泡可能通過(guò)沉積在胞外基質(zhì)中促進(jìn)基質(zhì)礦化，或者進(jìn)入血管平滑肌內(nèi)部促進(jìn)其發(fā)生成骨樣轉(zhuǎn)化[22]

綜上所述，本研究表明，PD患者外周血淋巴細(xì)胞亞群構(gòu)成比例與AAC程度密切相關(guān)，天然性和獲得性免疫均參與了VC發(fā)生、發(fā)展，免疫治療可能成為PD患者AAC的潛在治療靶點(diǎn)。本研究為小樣本單中心橫斷面研究，今后需加大樣本量，多中心、前瞻性及回顧性研究來(lái)進(jìn)一步探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突