葉新如 劉建汀 李永平 朱海生 溫慶放

(1福建省蔬菜遺傳育種重點實驗室，福建 福州 350013；2福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究中心，福建 福州 350013)

冬瓜屬于葫蘆科(Cucurbitaceae) 冬瓜屬(Benincasa Savi)一年生蔓性草本植物。冬瓜是我國傳統(tǒng)種植的蔬菜品種，已有2 000 多年的栽培歷史[1]。冬瓜中富含氨基酸、維生素C、酚類等活性物質(zhì)，兼具藥用和保健功能，經(jīng)濟價值較高。冬瓜最初起源于中國南部、東南亞及印度等國家[2-3]?，F(xiàn)階段，我國國家種質(zhì)資源庫收集保存冬瓜資源300 余份，其中大部分為我國地方品種[4]。冬瓜育種方式主要是常規(guī)雜交育種，在雜交組合配制過程中隨機性高、品種間遺傳基礎(chǔ)狹窄，導(dǎo)致出現(xiàn)雜種優(yōu)勢不明顯等問題，大大影響育種效率。我國冬瓜資源較為豐富，常出現(xiàn)各地域間相互引種栽培、育種，并各自命名的現(xiàn)象[4-6]，也容易出現(xiàn)同物異名或同名異物的問題。因此，利用DNA 分子標(biāo)記系統(tǒng)地鑒定和評價冬瓜種質(zhì)資源具有重要意義。

DNA 分子標(biāo)記技術(shù)以個體間核苷酸序列差異為基礎(chǔ)，在DNA 水平上直接反映遺傳變異的標(biāo)記，具有精確度高、不受外界環(huán)境影響等優(yōu)點，并廣泛應(yīng)用于作物分子輔助育種、品種鑒定、遺傳多樣性分析等方面[7-10]。目前常用的DNA 標(biāo)記技術(shù)有核苷酸重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)、限制性片段多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、隨機擴增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)、序列相關(guān)擴增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)等[11-14]。SSR 是一類由幾個堿基組成的基因序列串聯(lián)重復(fù)而成的DNA 序列。根據(jù)來源不同，SSR 分為基因組SSR 和植物表達序列標(biāo)簽SSR(expressed sequence tags SSR，EST-SSR)。ESTSSR 標(biāo)記是以PCR 技術(shù)為關(guān)鍵，直接從獲得的EST 序列中篩選SSR。因此，EST-SSR 除了具有基因組SSR 的共顯性遺傳、分布趨勢隨機、多態(tài)性強等優(yōu)點外，其通用性和保守性較基因組SSR 高[15]，已廣泛應(yīng)用于水稻(Oryza satiraL.)[16]、黃皮(Clausena lansium)[17]、南瓜(Cucurbiha maxima)[18]、鐵皮石斛(Dendrobium officinale)[19]等多種作物的SSR 分子標(biāo)記開發(fā)。

人工繪制品種鑒別示意圖(manual cultivar identification diagram，MCID)法是基于DNA 分子標(biāo)記快速鑒定品種的一種方法。MCID 法可以根據(jù)特異性引物和PCR 擴增后的特征性譜帶直觀地顯示出鑒別過程，繪制不同品種間的圖譜關(guān)系[20]，目前已在葡萄(Vitis viniferaL.)[21]、柿子(Diospyros kaki)[22]、蘿卜(Raphanus sativusL.)[23]、青花菜(Brassica oleracevar italica)[24]等作物上成功應(yīng)用。但有關(guān)冬瓜的MCID法研究尚鮮見報道。本研究利用組前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果[25]，挖掘EST-SSR 引物，最終共篩選出7 對SSR 引物，對40 份冬瓜種質(zhì)資源進行PCR 擴增，利用全自動核酸蛋白分析儀檢測擴增產(chǎn)物，分析冬瓜資源遺傳多樣性并構(gòu)建品種鑒別示意圖(cultivar identification diagram，CID)圖譜，以期從分子水平上對冬瓜種質(zhì)資源的鑒定和新品種選育提供科學(xué)依據(jù)和參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以40 份冬瓜資源的嫩葉為材料(表1)，利用Illumina HiSeqTM2000 測序平臺進行轉(zhuǎn)錄組測序。冬瓜嫩葉采自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所福清市東張鎮(zhèn)蔬菜科研基地，測序由廣州基迪奧生物有限公司完成。

1.2 DNA 提取

利用CTAB 法[26]提取冬瓜葉片基因組DNA，分別采用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDropND-2000 超微量蛋白核酸測定儀(Eppendorf 公司，德國)對DNA 的品質(zhì)和濃度進行檢測，最終將DNA 濃度稀釋至50 ng·μL-1，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 冬瓜轉(zhuǎn)錄組SSR 鑒別及引物設(shè)計

利用MISA 軟件對冬瓜轉(zhuǎn)錄組Unigene 進行SSR位點搜索。篩選標(biāo)準:單核苷酸最少重復(fù)次數(shù)10 次；二核苷酸最少重復(fù)次數(shù)6 次；三、四、五、六核苷酸最少重復(fù)次數(shù)5 次。利用Primer 3.0 設(shè)計SSR 引物，每條SSR 產(chǎn)生3 組引物。

1.4 PCR 擴增與檢測

利用本研究前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，篩選出7 對SSR 引物對40 份冬瓜資源進行擴增。PCR 反應(yīng)總體系25 μL，其中0.5 μL dNTP，0.3 μL Taq 酶，1.5 μL DNA，1 μL 引物，2.5 μL 10×Buffer(含Mg2＋)，18.2 μL ddH2O。擴增程序:94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，57℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72℃延伸10 min。最終產(chǎn)物置于4℃冰箱保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)DYY-6D 瓊脂糖凝膠電泳檢測(北京六一生物科技有限公司)，適合的擴增產(chǎn)物進一步在全自動核酸蛋白分析儀(LabChip GX Touch 24，美國PerkinElmer 公司)上檢測。

表1 試驗所用材料Table 1 Wax gourd cultivars used in the study

1.5 冬瓜MCID 法的建立

根據(jù)核酸蛋白分析儀的檢測結(jié)果，篩選出PCR 擴增條帶清晰的引物對40 份冬瓜資源進行鑒定。首先統(tǒng)計某一引物擴增的電泳圖中，在相同的電泳遷移率處有無特征性譜帶。該處具有相同擴增譜帶的資源分為一組，無此譜帶的歸為一組。之后繼續(xù)加入引物依據(jù)相同的統(tǒng)計方法以此逐步再進行分類，直至所有參試材料均清晰地區(qū)分開。最后，按照鑒定結(jié)果繪制CID 圖譜，將所用引物和多態(tài)性譜帶大小(bp)標(biāo)記到CID 圖譜對應(yīng)位置。

1.6 冬瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

根據(jù)所獲得的電泳圖譜進行分析。電泳圖中的條帶分別代表模板和引物之間的結(jié)合位點，根據(jù)SSR 的擴增產(chǎn)物計算電泳圖譜上清晰可靠的條帶，在同一位置出現(xiàn)條帶的標(biāo)記為“1”，沒有條帶的標(biāo)記為“0”，根據(jù)計算出的“0”和“1”輸入Excel 組成二維數(shù)據(jù)矩陣。應(yīng)用Ntsys2.10e 軟件進行數(shù)據(jù)處理按系統(tǒng)聚類進行聚類繪圖[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬瓜轉(zhuǎn)錄組的SSR 位點分析

冬瓜轉(zhuǎn)錄組測序后，進行組裝，獲得40 604 條Unigene，對其進行SSR 位點搜索。在所有Unigene中，含1 條以上SSR 基序的Unigene 有804 條，復(fù)合型SSR 序列的Unigene 有388 條。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中主要有5 種SSR 類型，分別是二核苷酸重復(fù)到六核苷酸重復(fù)。不同SSR 序列數(shù)量相差較大，二核苷酸重復(fù)類型中，AG/CT 重復(fù)基序最多，占26.21%；其次是三核苷酸重復(fù)類型，而五核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)類型數(shù)量較少。

冬瓜轉(zhuǎn)錄組SSR 重復(fù)單元次數(shù)在4～30 次，多集中于4～15 次，共有SSR 5 474 條，其中重復(fù)次數(shù)最多的是5 次(1 462 條)，占26.71%，其次是6 次(1 398，25.54%)、7 次(819，14.96%)、4 次(602，11%)，14 次重復(fù)次數(shù)最少，僅24 條。冬瓜轉(zhuǎn)錄組SSR 長度在12～239 bp 之間，SSR 長度是影響多態(tài)性的一個指標(biāo)，具體為SSR 長度≤12 bp，多態(tài)性低；12 bp＜SSR 長度＜20 bp，多態(tài)性中等；SSR 長度≥20 bp，多態(tài)性高。在篩選引物過程中，將多態(tài)性低的SSR 排除，共得到4 471 條冬瓜SSR，SSR 長度介于12～20 bp 之間和長度大于20 bp 的數(shù)量分別為2 742 條和1 729 條。

2.2 冬瓜SSR 擴增及多態(tài)性檢測

根據(jù)冬瓜轉(zhuǎn)錄組SSR 序列，隨機合成100 對引物對40 份冬瓜資源進行PCR 擴增，最終篩選出7 對特異性較好的引物(表2)。結(jié)果表明，7 對引物擴增的條帶清晰、可辨。進一步利用核酸蛋白分析儀檢測，篩選出的引物可以檢測出多態(tài)性核酸峰值圖。圖1為引物2(Y2)的檢測結(jié)果，可以看出引物2 在1 號資源、2號資源、3 號資源和10 號資源中檢測出的多態(tài)性片段長度分別為216 bp＋304 bp＋333 bp、216 bp＋317 bp＋346 bp、218 bp＋322 bp＋351 bp 和213 bp＋300 bp＋329 bp，多態(tài)性核酸峰值圖結(jié)果清晰明確，可以將4 份資源區(qū)分開。多態(tài)性片段長度能由多態(tài)性核酸峰值圖確定，應(yīng)用于品種的鑒別。

2.3 冬瓜資源鑒定

根據(jù)篩選出的7 對SSR 引物，利用MCID 法對冬瓜資源進行鑒定，最終利用3 對引物可將40 份冬瓜資源逐一區(qū)分(圖2)。首先根據(jù)引物16 擴增出特征性譜帶將40 份冬瓜資源分為19 組，有特征性譜帶的用(＋)表示，無特征性譜帶的用(-)表示。第一組為281 bp(＋)和316 bp(-)，包含33 號和34 號2 份資源；含281 bp、316 bp 特征性譜帶的資源被單獨鑒定出來，38號為第二組；第三組為260 bp(＋)和268 bp(-)，包含4 號資源；第四組共包含6 份資源，均無206 bp 特征性譜帶，含304 bp 特征譜帶；第五組資源同時包含260 bp、268 bp 和304 bp 譜帶，包括1、7、8、12 號4 份資源；第六組為260 bp(＋)、268 bp(＋)、304 bp(-)，包括2、3、5、6、9、10、11 號7 份資源；第七組為208 bp(＋)、275 bp(-)，含37 號資源；第八組和第九組分別為204 bp(-)、208 bp(-)、281 bp(＋)和200 bp(＋)、204 bp(＋)、275 bp(-)，39 號和40 號資源單獨被鑒定出來；第十組為198 bp(-)、260 bp(-)、268 bp(＋)、304 bp(-)，包含15、19、22、27 號4 份資源；第十一組為198 bp(-)、204 bp(＋)和281 bp(＋)，31 號資源被單獨鑒定出來；在198 bp 和275 bp 處含特征性譜帶，281 bp處無特征性譜帶的3 份資源被單獨鑒定出來為第十二組；36、21 號資源分別鑒定成第十三、第十四組；第十五組在194 bp、275 bp 處有特征性譜帶，而在316 bp處無特征性譜帶，共包括26、29 號2 份資源；25、28、13、32 號資源分別依次單獨被鑒定出來，成為第十六、第十七、第十八和第十九組。

將資源分為19 組后，進一步利用更多的引物將所有資源鑒定區(qū)分。其中第四組的6 份資源利用引物2擴增出來的5 條特征性譜帶(256 bp、309 bp、317 bp、322 bp、343 bp)繼續(xù)進行鑒定。5 條特征性條帶將6份資源分為5 個亞組，第一亞組:256 bp(＋)把17 號資源區(qū)分出來為一個小組；第二亞組:390 bp(＋)把20 號資源單獨鑒定出來；第三亞組:18 號和23 號資源都有317 bp 條帶被分為一組；第四亞組:同時包含322 bp和343 bp 特征性譜帶的14 號資源被單獨出定出；第五亞組:16 號資源為322 bp(＋)和343 bp(-)被鑒別出來。最后，利用引物62 擴增的特征性譜帶250 bp，將18 號和23 號資源鑒定出來。另外5 組按照相同方法依次鑒定，直至所有資源區(qū)分開。CID 圖譜是通過特征性譜帶篩選比較，構(gòu)建一個直觀的鑒別圖譜，1 個引物如果無法單獨區(qū)分出資源，可用另一引物繼續(xù)區(qū)分，直至所有資源被單獨鑒定出，得到的圖譜隨時可以查閱。

表2 SSR 引物及退火溫度Table 2 SSR primers and their annealing temperature

2.4 冬瓜資源鑒定結(jié)果的驗證

根據(jù)構(gòu)建的冬瓜CID 圖譜關(guān)系，從組間或組內(nèi)隨機選取幾份冬瓜資源，用相應(yīng)引物對其可靠性和可利用性進行驗證。如3 和12 號、10 和11 號、33 和34 號資源，分別進行驗證。根據(jù)CID 示意圖的結(jié)果，3 和12號利用引物16 和引物2 可以完全鑒定出來，依據(jù)有無304 bp 擴增條帶可將3 和12 號資源分成兩組(圖3-A)；再由引物2 的特征性譜帶309 bp 可把它們分別鑒定出(圖3-B)。根據(jù)圖3-C 和圖3-D 所示，10 和11號資源、33 和34 號資源均可用引物2 區(qū)分開，差異條帶分別為256 bp、300 bp 和300 bp、314 bp。

2.5 聚類分析

利用Ntsys2.10e 軟件對40 份冬瓜資源的遺傳多樣性進行分析。由聚類圖可知(圖4)，遺傳相似系數(shù)的變化范圍為0.73～0.95，平均相似系數(shù)0.76，標(biāo)記可將所有冬瓜資源區(qū)分開。以相似系數(shù)在0.77 處為閾值，可將40 份冬瓜分為3 個類群。第Ⅰ類中包括23 份資源，該類群主要以長圓筒形黑皮色冬瓜資源為主，種型大部分為有棱扁籽；第Ⅱ類中包括4 份資源，主要為長圓筒形冬瓜資源；第Ⅲ類中包括13 份資源，主要以果形短圓筒形、種子有棱扁籽粒為主。40 份冬瓜份資源間存在遺傳差異，其中，7 和8 號資源相似系數(shù)為0.95，親緣關(guān)系近難以區(qū)分，有可能是同物異名或標(biāo)記數(shù)目少導(dǎo)致的。

3 討論

形態(tài)學(xué)標(biāo)記是一種直接利用表型性狀對遺傳多樣性進行分析的標(biāo)記方式，廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性分析，但其結(jié)果往往依賴性狀調(diào)查，當(dāng)某一品種數(shù)量較多或形態(tài)上相似性較高時，用形態(tài)學(xué)標(biāo)記的方法難以將它們區(qū)分開，而且有時易出現(xiàn)結(jié)果誤差。DNA 分子標(biāo)記技術(shù)操作簡單，穩(wěn)定性高，同時不受環(huán)境的影響。EST-SSR 是研究應(yīng)用較多的一類標(biāo)記方式。它以EST大量測序結(jié)果為基礎(chǔ)，依據(jù)EST 序列進行SSR 標(biāo)記挖掘，基于EST 序列所開發(fā)的SSR 標(biāo)記在不同物種間通用性較高，使得EST-SSR 分子標(biāo)記在分子標(biāo)記輔助育種、多樣性分析等方面具有應(yīng)用價值[28-29]。張慶瀅等[30]以22 份中國野生大麻(Cannabis sativaL.)和8份栽培品種為材料，利用EST-SSR 分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建指紋圖譜。DNA 指紋圖譜鑒定品種準確性高，但這種方法只適用少數(shù)品種的鑒定區(qū)分。高源等[31]利用TP-M13-SSR 標(biāo)記技術(shù)建立指紋圖譜，并構(gòu)建蘋果(Malus pumilaMill.)栽培品種分子身份證。分子身份證是在指紋圖譜基礎(chǔ)上，將品種指紋數(shù)字化，能夠更加簡明的區(qū)分品種差異，然而此方法對種子純度和遺傳純度有嚴格要求，對于可預(yù)見的變異沒有統(tǒng)一的標(biāo)準進行評定。隨著品種數(shù)量增加，品種鑒定需要的標(biāo)記組合越來越多，現(xiàn)有的標(biāo)記組合已無法滿足需求，造成了DNA 指紋圖譜身份證數(shù)據(jù)庫的局限性[32]。石艷等[33]以轉(zhuǎn)錄組序列為基礎(chǔ)對換錦花(Lycoris sprengeri)SSR 分子標(biāo)記大規(guī)模發(fā)掘，利用Ntsys2.10e 軟件采用聚類分析法繪制聚類圖，但聚類圖存在無法直觀的將各品種區(qū)分開的問題，它只能計算品種間的遺傳距離和相似系數(shù)。

本研究采用Ntsys2.10e 進行聚類分析，在遺傳距離0.77 處，40 份冬瓜資源被分成3 個類群，大致可以依據(jù)果形進行劃分，這與焦賢賢等[3]的研究結(jié)果類似。然而，UPGMA 圖只能簡單區(qū)分品種間遺傳關(guān)系，無法將品種單一地鑒定出來，且對遺傳關(guān)系相近的品種也無法劃分，表明該方法仍存在一定的不足。近年來，隨著育種水平的提高和科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，學(xué)者提出多種鑒定方法，如Wang 等[34]利用MCID 法鑒定了54份梅花種質(zhì)資源親緣關(guān)系。本研究基于EST-SSR 標(biāo)記的MCID 法，將分子標(biāo)記信息轉(zhuǎn)化為有效信息并與品種鑒定相連接。試驗利用全自動核酸蛋白分析儀對SSR 擴增產(chǎn)物進行檢測，與傳統(tǒng)的聚丙烯酰氨凝膠電泳法相比，該技術(shù)能準確獲得譜帶大小，且靈敏度高、用量小。

本研究共篩選出7 對引物，僅用3 對引物就成功將40 份冬瓜資源鑒定區(qū)分開；之后通過特征性譜帶進行篩選，如果某一資源含有其他資源不具有的特征性譜帶，則很容易將其與其他資源區(qū)分開，當(dāng)某一引物無法區(qū)分時，則繼續(xù)添加新的引物，最后根據(jù)分組結(jié)果建立冬瓜CID 圖譜。當(dāng)出現(xiàn)新的冬瓜資源需要與本研究的40 份資源進行區(qū)別時，可利用本研究篩選出的引物對新資源進行PCR 擴增分析，如果分析結(jié)果能夠?qū)⑿沦Y源單獨區(qū)分開，就可以將新資源和譜帶添加到CID 圖譜上，但當(dāng)新的資源無法區(qū)分時，可使用新的引物對這些資源進行鑒別。MCID 法直觀、簡單、實用性和目的性強，能夠用最少的引物快速區(qū)分40 份冬瓜資源，可有效地鑒定各種資源，為今后冬瓜種質(zhì)資源鑒定提供參考。

4 結(jié)論

本研究利用DNA 分子標(biāo)記技術(shù)對40 份冬瓜資源進行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，在遺傳距離0.77 處，可將其分為3 個類群。結(jié)合MCID 法利用3 對ESTSSR 標(biāo)記快速鑒定出40 份冬瓜資源，并構(gòu)建了CID 圖譜。從構(gòu)建的CID 圖譜能夠有效地鑒定出40 份冬瓜資源之間親緣關(guān)系，為資源的進一步利用提供了科學(xué)依據(jù)。同時，本研究采用的MCID 法還可用于冬瓜品種鑒定，解決品種中同物異名、同名異物、親緣關(guān)系不清等問題，對今后冬瓜品種苗期鑒定、品種權(quán)鑒定及保護、種質(zhì)資源管理等方面具均有參考價值。