曾若菡，齊 釗，張騰云，龔 瑩，張欽洲，王?；ǎ髸云?/p>

（1.海南大學(xué) 生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，?？?570228; 2.海南大學(xué) 南海海洋資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570228;3.海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，?？?571158）

抗生素種類繁雜，現(xiàn)已達(dá)到幾千種，按照其化學(xué)結(jié)構(gòu)主要分為β?內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類、氨基糖苷類和氯霉素等，并且在多種環(huán)境介質(zhì)中廣泛存在。水體中抗生素污染的來(lái)源主要有醫(yī)用、養(yǎng)殖業(yè)及制藥工業(yè)廢水排放?？股乇皇褂煤蟛⒉粫?huì)被生物體完全吸收。殘留抗生素以多種形式經(jīng)各種途徑排入水體等環(huán)境中，造成環(huán)境污染。國(guó)內(nèi)的其他水環(huán)境（如地表徑流、地下水、海洋等）中都能檢測(cè)到抗生素的殘留。不同水域間的抗生素殘留量差別很大，殘留量最高的是養(yǎng)殖廢水?；前奉?、喹諾酮類、四環(huán)素類及氯霉素類等4 類抗生素由于具有較好的防治疾病和促生長(zhǎng)等作用而被廣泛使用于水產(chǎn)養(yǎng)殖等行業(yè)，以達(dá)到治療、預(yù)防動(dòng)物傳染性疾病和促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的目的[1?3]。水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的排放是水環(huán)境中抗生素污染的重要的人為來(lái)源。陵水新村、黎安港和萬(wàn)寧小海海域是海南省重點(diǎn)海水養(yǎng)殖集中區(qū)，具有重要的生態(tài)及經(jīng)濟(jì)價(jià)值[4]。新村港位于海南省陵水縣新村鎮(zhèn)的東南部，港內(nèi)南北長(zhǎng)4 km，東西寬6 km，面積24 km2，擁有上千家魚排，養(yǎng)殖著金鼓鰻魚、珍珠龍膽等魚類。萬(wàn)寧小?，F(xiàn)面積約43 km2，周長(zhǎng)約43 km，小海物產(chǎn)豐富,著名的和樂(lè)蟹、港北對(duì)蝦和后安鯔魚均產(chǎn)于此。調(diào)查區(qū)域主要為淺海養(yǎng)殖中的網(wǎng)箱養(yǎng)殖。網(wǎng)箱的主要結(jié)構(gòu)是框架和網(wǎng)衣，框架起到支撐固定網(wǎng)衣的作用，網(wǎng)箱面積可達(dá)到數(shù)十平方米，深度約為2～4 m。網(wǎng)衣上常附著水藻、微生物等多種物質(zhì)。浮動(dòng)式網(wǎng)箱能隨著水位的變化而上下浮動(dòng)，在養(yǎng)殖中使用廣泛，常用于養(yǎng)殖魚類、螃蟹[5]。有研究表明，海南省每年每平方米的抗生素排放量處于我國(guó)相對(duì)較高水平[6]，但重要水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)域養(yǎng)殖水體中抗生素的分布特征鮮見(jiàn)系統(tǒng)報(bào)道。為此，本研究采集海南島東部陵水新村、黎安港和萬(wàn)寧小海，海域養(yǎng)殖區(qū)的海水樣品，通過(guò)LC-MS/MS 技術(shù)對(duì)樣品中4 類（磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類及氯霉素類）40 種抗生素進(jìn)行定量分析，以揭示養(yǎng)殖區(qū)海水中抗生素殘留的分布情況并進(jìn)行生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，同時(shí)為養(yǎng)殖區(qū)生態(tài)水質(zhì)監(jiān)測(cè)和環(huán)境保護(hù)提供科學(xué)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集本研究于2018 年8 月采集陵水新村、黎安港和萬(wàn)寧小海養(yǎng)殖區(qū)海域表層海水樣本，共采集樣品15 個(gè)，采樣點(diǎn)分布見(jiàn)圖1。同一采樣點(diǎn)以棕色玻璃瓶采集1 L 水樣。水樣采集時(shí)取同一截面水平面0.5 cm 以下左中右3 個(gè)點(diǎn)的混合樣，每個(gè)樣點(diǎn)采集3 個(gè)重復(fù)。水樣置于4 ℃冰盒中避光冷藏保存，并于48 h 內(nèi)進(jìn)行前處理。采樣時(shí)詳細(xì)記錄監(jiān)測(cè)點(diǎn)位的水溫、pH 值、溶解氧和鹽度等。

圖1 采樣點(diǎn)分布情況Fig.1 Sample site

1.2 抗生素檢測(cè)本研究對(duì)4 類（磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、氯霉素類）40 種抗生素進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[7]。

1.2.1 抗生素提取取1 L 已過(guò)濾水樣，用鹽酸-水溶液（V鹽酸∶V水=1∶1）調(diào)節(jié)pH 至2.5。依次用20 mL甲醇、6 mL 超純水、6 mL 鹽酸（pH2.5）對(duì)HLB 柱進(jìn)行活化。用已活化HLB 柱對(duì)水樣進(jìn)行富集，流速控制在5 mL·min?1左右。富集完成后用氮?dú)廨p柔吹干富集小柱，將氮吹干燥后的小柱用12 mL 甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。洗脫液氮吹濃縮至近干。用流動(dòng)相95%A（0.1%甲酸?1 g·L?1甲酸銨水溶液）和5%B（V甲醇∶V乙腈=1∶1）定容至1 mL，過(guò)0.22 μm 尼龍濾膜，待測(cè)。

1.2.2 抗生素檢測(cè)進(jìn)樣量10 mL，柱溫40 ℃，流速0.30 mL·min?1。流動(dòng)相A：0.1%甲酸?1 g·L?1甲酸銨水溶液；流動(dòng)相B：V甲醇∶V乙腈=1∶1。梯度洗脫程序：起始5%B 3 min，然后在18 min 內(nèi)從5%B 線性變化至88%B。質(zhì)譜離子源：ESI+/ESI?切換，MRM 數(shù)據(jù)采集模式。待檢抗生素中氯霉素類抗生素采用負(fù)離子模式，其余抗生素采用正離子模式。

1.3 生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估為研究抗生素在采樣區(qū)水體中抗生素對(duì)水生生物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，采用風(fēng)險(xiǎn)熵值（RQs）來(lái)評(píng)估。風(fēng)險(xiǎn)熵值法（RQs）來(lái)自歐盟的技術(shù)指導(dǎo)文件(European commission technical guidance document,TGD)，藥品在環(huán)境中的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)可以根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)熵值(RQs)大小來(lái)評(píng)估，此方法被廣泛應(yīng)用于分析廢水和地表水中常檢測(cè)到的藥物環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。RQs 通過(guò)污染物的環(huán)境實(shí)測(cè)濃度與預(yù)測(cè)無(wú)效應(yīng)濃度的比值獲得，公式如下：

式中：MEC 為抗生素的實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度，ng·L?1；PNEC 為預(yù)測(cè)無(wú)效應(yīng)濃度，即不會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生不良影響的最大質(zhì)量濃度，ng·L?1。

有研究[8?11]表明，多種抗生素存在于水體時(shí)，產(chǎn)生的毒性效應(yīng)會(huì)加強(qiáng)。因此，用聯(lián)合風(fēng)險(xiǎn)熵值法（RQsum）來(lái)代表多種抗生素對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，計(jì)算公式：

由于不同種類抗生素對(duì)不同物種的毒性不同，因此，選用最敏感物種的PENC 作為評(píng)估值，6 種檢出的抗生素中丹諾沙星未能找出參考的PENC 值，其余如表1 所示。

表1 抗生素對(duì)應(yīng)最敏感物種的毒理數(shù)據(jù)Tab.1 Toxicological data of antibiotics for the most sensitive species

2 結(jié)果與分析

2.1 不同采樣點(diǎn)海水中抗生素的檢出種類本研究對(duì)萬(wàn)寧和陵水養(yǎng)殖區(qū)海水中4 類40 種抗生素進(jìn)行檢測(cè)，研究區(qū)域共有6 種抗生素被檢出，喹諾酮類抗生素2 種、四環(huán)素類抗生素3 種、氯霉素類抗生素1 種，磺胺類抗生素未檢出（圖2）。對(duì)抗生素組成進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，各采樣點(diǎn)抗生素組成結(jié)構(gòu)存在差異，其中四環(huán)素類的強(qiáng)力霉素（DOX）、四環(huán)素（TC）、土霉素（OTC）在所有樣點(diǎn)中皆被檢出，氯霉素類的甲砜霉素（THI）除采樣點(diǎn)1 外，其余采樣點(diǎn)皆有檢出，喹諾酮類的環(huán)丙沙星（CIP）在采樣點(diǎn)3、7 被檢出，丹諾沙星（DAN）在采樣點(diǎn)4、11、15 被檢出。

圖2 采樣區(qū)海水中抗生素檢測(cè)種類的數(shù)量Fig.2 The number of antibiotic species detected in seawater sampled

2.2 不同采樣點(diǎn)抗生素的殘留濃度及分布特征對(duì)不同采樣點(diǎn)中抗生素殘留濃度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（圖3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)各海水樣品中總的抗生素殘留濃度為10.28～156.63 ng·L?1；其中采樣點(diǎn)10（新村漁港）抗生素殘留量最高（156.63 ng·L?1），其次是采樣點(diǎn)9 新村港（51.64 ng·L?1），采樣點(diǎn)11（黎安港）殘留量在已經(jīng)檢出樣點(diǎn)中最低（10.28 ng·L?1；）。大多數(shù)樣點(diǎn)抗生素殘留量均小于20 ng·L?1。

圖3 不同采樣點(diǎn)海水中抗生素的總濃度情況Fig.3 Total concentrations of antibiotics in seawater from different sampling sites

不同樣點(diǎn)間抗生素殘留濃度存在類別差異，其中OTC 與其他5 種抗生素具有顯著差異（P<0.05）。在6 種抗生素中，OTC 在不同采樣點(diǎn)海水中殘留量最高，均值為16.20 ng·L?1，其次是TC、DOX、THI 和CIP，均值分別為5.39、4.10、1.84、0.18 ng·L?1，最低的是DAN 均值為0.13 ng·L?1（圖4）。

圖4 采樣點(diǎn)海水中6 種抗生素殘留量均值Fig.4 The mean value of the residue of six antibiotics in the seawater sampled

2.3 不同采樣點(diǎn)海水中抗生素的相似性分析為進(jìn)一步分析抗生素在各采樣斷面的分布情況，本研究采用主成分分析(PCA)方法對(duì)不同采樣點(diǎn)海水中的抗生素相似性進(jìn)行分析。萬(wàn)寧和陵水養(yǎng)殖區(qū)海水中抗生素PCA 分析結(jié)果見(jiàn)圖5，由圖5 可見(jiàn)，主成分P1 的方差貢獻(xiàn)率為46.8%，P2 的方差貢獻(xiàn)率為21.6%，P1、P2 的累積特征值為68.4%；樣點(diǎn)1、2、7、8 距離較近，說(shuō)明萬(wàn)寧小海內(nèi)部間抗生素組成存在相似性，而樣點(diǎn)3、4、10 與其它采樣點(diǎn)距離較遠(yuǎn)，表明該采樣點(diǎn)抗生素組成與其他采樣點(diǎn)差異較大，其余采樣點(diǎn)聚集在一起，說(shuō)明陵水新村與黎安港抗生素殘留存在相似性。

從PCA 排序分布圖（圖5）也可以看出，各采樣點(diǎn)間抗生素的殘留均有一定差異，這可能是各采樣點(diǎn)環(huán)境條件不同或抗生素投放量不同導(dǎo)致。要闡明萬(wàn)寧和陵水養(yǎng)殖區(qū)海水中抗生素殘留差異的原因，還需對(duì)內(nèi)海萬(wàn)寧和陵水養(yǎng)殖區(qū)周邊抗生素使用情況和海洋環(huán)境現(xiàn)狀進(jìn)行進(jìn)一步探究。

2.4 養(yǎng)殖水體中抗生素的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估根據(jù)RQs 風(fēng)險(xiǎn)熵值的計(jì)算方法，得出5 種抗生素在不同水體中的RQs 值，最終的評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)圖6。遵循RQs 法評(píng)估采樣區(qū)水體中殘留抗生素對(duì)水生生物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)依據(jù)其大小劃分，RQs≥1 表明高風(fēng)險(xiǎn)，0.1≤RQs<1 表明中等風(fēng)險(xiǎn)，0.01≤RQs<0.1 表明低風(fēng)險(xiǎn)，0.01>RQs 代表無(wú)風(fēng)險(xiǎn)。

圖5 采樣點(diǎn)海水中抗生素的PCA 分析Fig.5 PCA analysis of antibiotics in seawater

圖6 采樣點(diǎn)生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等級(jí)Fig.6 Ecological risk assessment grade of sampling site

由圖6 可以看出，大多數(shù)采樣區(qū)的某一種抗生素的風(fēng)險(xiǎn)熵值（RQs）低于0.01，代表僅這一種抗生素在此區(qū)域無(wú)生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)；環(huán)丙沙星（CIP）只在港門嶺（采樣點(diǎn)3）和安坡海入海口（采樣點(diǎn)7）被檢測(cè)出，且對(duì)水生生物皆有低生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)；在萬(wàn)寧（采樣點(diǎn)3、6、7）和陵水新村港（采樣點(diǎn)4、9、10）的樣點(diǎn)中強(qiáng)力霉素（DOX）的殘留存在有低生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)；在陵水新村港（采樣點(diǎn)4、9、10）的樣點(diǎn)中，土霉素（OTC）的殘留存在有低或中生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。港門嶺（采樣點(diǎn)3）和新村漁港（采樣點(diǎn)10）的聯(lián)合風(fēng)險(xiǎn)熵值（RQsum）處于中風(fēng)險(xiǎn)，其余地區(qū)聯(lián)合風(fēng)險(xiǎn)熵值（RQsum）處于低風(fēng)險(xiǎn)。

3 討 論

3.1 采樣區(qū)抗生素殘留類型由于萬(wàn)寧、陵水內(nèi)海的魚排網(wǎng)箱養(yǎng)殖具有一定規(guī)模，且養(yǎng)殖人員將抗生素藥物混入飼料進(jìn)行喂食或直接投入海水中，因此，引起萬(wàn)寧、陵水內(nèi)海發(fā)生抗生素污染。在對(duì)萬(wàn)寧和陵水養(yǎng)殖區(qū)海水抗生素檢出進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素類抗生素（TC、OTC、DOX）在兩區(qū)域各個(gè)點(diǎn)皆被檢出，而磺胺類抗生素未被檢出。四環(huán)素類抗生素可能是該地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖常用的抗生素，可用于預(yù)防魚類的細(xì)菌性疾病如腸炎病、爛鰓病、赤皮病、細(xì)菌性敗血癥、豎鱗病、爛鰭病和海水魚類弧菌病等，龜鱉類和甲殼類的細(xì)菌性疾病等。氯霉素類的甲砜沙星用于治療魚類細(xì)菌性敗血癥、腸炎及赤皮病[7]，僅有一處采樣點(diǎn)未檢出，這可能與當(dāng)?shù)厮a(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)魚類發(fā)病情況有關(guān)。含有環(huán)丙沙星的水產(chǎn)用抗生素獸藥名稱為鹽酸環(huán)丙沙星、鹽酸小檗堿預(yù)混劑，可用于治療鰻魚頑固性細(xì)菌性疾病[17]。根據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部第235 號(hào)公告（動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量）[18]和NY5070—2002（中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)人行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《無(wú)公害食品 水產(chǎn)中漁藥殘留限量》）[18]，從本研究樣品中檢測(cè)出的土霉素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素和甲砜霉素皆為水產(chǎn)中可使用抗生素；獸藥典（2005 版）-獸藥使用指南（化學(xué)卷）[17]中將鹽酸環(huán)丙沙星預(yù)混劑列為水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥名錄，但在《無(wú)公害食品 水產(chǎn)中漁用藥物使用準(zhǔn)則》[17]中將環(huán)丙沙星列為禁用藥物；丹諾沙星并非水產(chǎn)使用抗生素，而是迄今治療畜禽支原體感染最有效的藥物之一，可能是由周圍畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)排入海域的。對(duì)萬(wàn)寧和陵水養(yǎng)殖區(qū)15 處采樣點(diǎn)海水中抗生素組成進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)9 處采樣點(diǎn)抗生素種類相同，這意味著各采樣點(diǎn)水產(chǎn)養(yǎng)殖的養(yǎng)殖品種、水文條件、地理?xiàng)l件存在相似性，僅個(gè)別采樣點(diǎn)使用了喹諾酮類抗生素。本研究對(duì)萬(wàn)寧、陵水內(nèi)海中4 類40 種抗生素進(jìn)行檢測(cè)，其中僅6 種被檢出（THI, CIP,DAN, DOX, TC, OTC），可見(jiàn)養(yǎng)殖區(qū)海水中使用的抗生素比較單一。

3.2 采樣區(qū)抗生素殘留濃度及分布特征本研究待測(cè)區(qū)域各海水樣品中總的抗生素殘留濃度范圍為10.28～156.63 ng·L?1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于廣西羅非魚主產(chǎn)區(qū)養(yǎng)殖池塘的檢出量（52～3 257.7 ng·L?1）[19]，同時(shí)也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于江蘇典型中華絨螯蟹養(yǎng)殖區(qū)中抗生素的檢出量（17.04～1 311.93 ng·L?1）[20]，但與廣州市南沙水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)抗生素殘留量（18.13～61.34 ng·L?1）相比處于相對(duì)較高水平[21]，與北部灣河口養(yǎng)殖區(qū)（22.4～118 ng·L?1）[22]、渤海灣近岸海域（24.3～242.7 ng·L?1）[23]、豐水期洞庭湖水體檢出量（6.35～135.40 ng·L?1）相近[24]。在四類抗生素中四環(huán)素類抗生素檢出水平最高，這與渤海灣近岸海域[23]中檢測(cè)結(jié)果相似。四環(huán)素類殘留濃度均值為25.7 ng·L?1，低于渤海灣近岸海域中四環(huán)素類抗生素的檢出量均值（200.9 ng·L?1）[23]，高于洞庭湖水體均值（3.96 ng·L?1）[24]；在四環(huán)素類抗生素中OTC 檢出濃度最高，均值為16.2 ng·L?1，與渤海灣近岸海域OTC 檢出濃度均值（69.8 ng·L?1）[23]相比處于相對(duì)較低水平。喹諾酮類抗生素檢出0～1.59 ng·L?1，低于北部灣養(yǎng)殖區(qū)養(yǎng)殖塘喹諾酮類抗生素檢出濃度（16.9～78.5 ng·L?1）[22]，與北部灣養(yǎng)殖區(qū)遠(yuǎn)海[22]相近。氯霉素類抗生素僅有1 種（THI）被檢出，檢出均值為1.84 ng·L?1，其他地區(qū)鮮有報(bào)道。

與國(guó)內(nèi)部分水域研究[23，25?29]相比，萬(wàn)寧和陵水養(yǎng)殖區(qū)海水的抗生素殘留處于相對(duì)較低水平，這可能與樣品采集區(qū)域有關(guān)，其他研究樣點(diǎn)布設(shè)主要位于北方或較為封閉小型的水域，而本研究樣點(diǎn)布設(shè)在萬(wàn)寧、陵水內(nèi)海中，其抗生素主要來(lái)自海水水產(chǎn)養(yǎng)殖；與其他水體環(huán)境研究相比，萬(wàn)寧、陵水養(yǎng)殖區(qū)海水中抗生素殘留濃度處較低水平，這意味著內(nèi)海養(yǎng)殖區(qū)抗生素使用量較低及內(nèi)海與外海海水交換量大，也可能是由于海南省南部日照充足、海水溫度較北方稍高、多處海水pH 偏堿性從不同程度上有利于抗生素的降解[30?32]。在本研究中，喹諾酮類相對(duì)于四環(huán)素類及氯霉素類型抗生素而言其檢出量較低，且喹諾酮類相較于四環(huán)素類不易水解，這意味著萬(wàn)寧及陵水內(nèi)海養(yǎng)殖區(qū)較少使用喹諾酮類。而相對(duì)其他3 類抗生素來(lái)說(shuō)，磺胺類抗生素不易水解而易發(fā)生光解，在萬(wàn)寧和陵水養(yǎng)殖區(qū)海水中磺胺類抗生素未被檢出，說(shuō)明萬(wàn)寧和陵水養(yǎng)殖區(qū)磺胺類抗生素使用量極低。

3.3 采樣區(qū)抗生素生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)水平海南島東部海水中抗生素殘留對(duì)采樣區(qū)域的影響基本處于中等以下風(fēng)險(xiǎn)水平,但有研究[33]表明，抗生素殘留可能會(huì)對(duì)水生生物產(chǎn)生急性或慢性毒性效應(yīng)，同時(shí)抗生素的長(zhǎng)期殘留還可能會(huì)刺激病原菌產(chǎn)生耐藥性，誘導(dǎo)抗性基因產(chǎn)生，這勢(shì)必會(huì)對(duì)原有穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響。因此，海南島東部海水研究區(qū)水體中抗生素整體存在一定的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，陵水新村漁港水體中土霉素對(duì)相應(yīng)敏感物種具有中風(fēng)險(xiǎn)，但從維護(hù)生態(tài)系統(tǒng)出發(fā)也應(yīng)該減少環(huán)丙沙星（CIP）、強(qiáng)力霉素（DOX）和土霉素（OTC）的使用。