徐如靜，梁 娟，俞年軍，3，吳鴻飛，吳振東，周 安

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥資源保護(hù)與開發(fā)研究所，安徽 合肥 230012；4.安徽省青陽(yáng)縣九華中藥材科技有限公司，安徽 池州 242800)

九華黃精也稱地藏黃精，主產(chǎn)于安徽省九華山周邊區(qū)域，為百合科黃精屬多花黃精，十大皖藥之一，屬于藥食兩用類中藥，具有補(bǔ)中益氣、滋陰潤(rùn)肺等功效。多糖是黃精的主要活性成分，具有抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫、降血糖、抗菌和延緩衰老等作用。相對(duì)于其他產(chǎn)地的多花黃精，九華黃精具有口感肉質(zhì)、多糖含量高、抗氧化活性強(qiáng)等特點(diǎn)。

生九華黃精因?qū)ρ屎砭哂写碳ば院臀⑿〉亩拘裕ǔＰ杞?jīng)炮制后使用，其炮制方法常用的有酒蒸和九蒸九曬法兩種，臨床用黃精飲片多為酒蒸品，主要用于配伍治療糖尿病、心血管等疾病?！侗静菥V目》記載了九蒸九曬的炮制方法，目前市場(chǎng)上暢銷的黃精類功能食品多以該方法制備，通常認(rèn)為九蒸九曬炮制工藝一方面可以改變黃精的口感，糾偏藥性及減少毒性成分，還能改善其感官品質(zhì)，增強(qiáng)黃精強(qiáng)身健體、延緩衰老等功效。多糖為九華黃精主要藥效成分，不同分子段的黃精多糖在抗氧化、抗菌、增強(qiáng)免疫等方面均具有一定活性。2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定多糖為黃精質(zhì)量控制成分，且規(guī)定多糖的含量不得少于7%。目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)九華黃精飲片均為酒蒸品，功能食品為九蒸九曬方法制備，然而兩種制備方法對(duì)九華黃精多糖含量及結(jié)構(gòu)的影響缺乏研究。多糖的生物活性與多糖分子量、單糖組成以及結(jié)構(gòu)差異密切相關(guān)。筆者以九華黃精為研究對(duì)象，考察酒制及九蒸九曬炮制前后多糖含量、分子量排布、單糖組成等結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行差異性分析，研究結(jié)果可為九華黃精及其炮制品的質(zhì)量控制和功效差異研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 ALPHA1-2LD真空冷凍干燥機(jī)：德國(guó)CHRIST公司；Agilent 1100高效液相色譜儀(配備高壓二元泵，柱溫箱)：美國(guó)安捷倫公司；TSK gel G3000PWXL色譜柱(7.8 mm×300 mm，7 μm)：日本東曹株式會(huì)社；Shimadzu GC-2010plus系統(tǒng)、UV-2550紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；Nicolet 5700紅外光譜儀：美國(guó)賽默飛公司。

1.2 藥材與試劑 九華黃精生藥材采自安徽省池州市青陽(yáng)縣酉華鎮(zhèn)，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院俞年軍教授鑒定為百合科黃精屬植物多花黃精

Polygonatum

cyrtonema

Hua.的干燥根莖。無水葡萄糖(純度98%，批號(hào) 110833-200904)、甘露糖(純度98%，批號(hào) xvwv-501H)：中國(guó)藥品生物制品檢定所；半乳糖(純度98%，批號(hào) GS04178209)：BIO BASIC INC公司；葡聚糖系列對(duì)照品(平均分子量為3，6，10，20，40，70，100，200 kDa)：Pharmacia Biotech公司；苯酚(批號(hào) C1523045)：阿拉丁公司；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 黃精炮制品的制備

2.1.1 生黃精的制備 新鮮九華黃精根莖用水清洗，去除須根和表面的泥沙，洗凈，切厚片，置60 ℃烘箱中干燥，粉碎后備用。

2.1.2 酒黃精的制備 按照文獻(xiàn)[13]的方法，取干燥后的生黃精200 g，加入20%黃酒拌勻。浸潤(rùn)5 h后，隔水蒸至黃酒被吸凈，表面色澤黑潤(rùn)時(shí)取出，晾曬，切厚片，干燥，得140 g酒制黃精。

2.1.3 九蒸九曬黃精的制備 取干燥后的生黃精200 g，用清水蒸制7 h，取出放入干燥箱(65 ℃)中烘干6 h，此步驟重復(fù)9次，得九蒸九曬黃精130 g。

2.2 黃精多糖的提取 按照文獻(xiàn)[14]的方法，分別取經(jīng)干燥處理的生黃精、酒黃精、九蒸九曬黃精，用中藥粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，得黃精粉。取一定量的3種黃精粉，分別按料液比1∶10加入蒸餾水，進(jìn)行加熱回流提取，提取次數(shù)為2次(每次2 h)，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮至一定容積。向濃縮液中加入無水乙醇至乙醇含量大于80%，沉淀多糖(4 ℃)，離心(3 500 r/min，15 min)，棄上清，得到沉淀即為黃精粗多糖。將粗多糖溶于蒸餾水中，用Sevage試劑脫蛋白，活性炭脫色，透析(透析袋分子量為3 500 Da)48 h，真空冷凍干燥，得黃精多糖凍干粉。

2.3 黃精多糖的含量測(cè)定

2.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取無水葡萄糖10 mg，加雙蒸水溶解并用100 mL容量瓶定容，得0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密移取上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL分別置于10 mL試管中，各管用雙蒸水補(bǔ)充至1 mL，隨后依次分別加入5%苯酚溶液1 mL和濃硫酸5 mL，搖勻，于80 ℃水浴反應(yīng)35 min。室溫放置冷卻，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液含量為零的試管作為空白對(duì)照，于490 nm處測(cè)定吸光度。

2.3.3 樣品的測(cè)定 精密稱取3種多糖凍干粉各10 mg，用純水溶解成0.1 mg/mL的多糖溶液，取各溶液0.3 mL，分別置于3支不同的10 mL試管中。按照“2.3.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液的測(cè)定方法，測(cè)定各樣品溶液的吸光度，計(jì)算多糖含量。計(jì)算公式為多糖含量(%)=苯酚硫酸法測(cè)定的多糖質(zhì)量/黃精藥材的質(zhì)量×100%。

2.4 分子量排布測(cè)定

2.4.1 色譜條件 TSK gel G3000PWXL凝膠色譜柱(7.8 mm×300 mm，7 μm)；DEAC901030示差折光檢測(cè)器(RID)；流動(dòng)相為超純水；樣品進(jìn)樣容積為10 μL；流速為0.5 mL/min；柱溫保持35 ℃。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取不同分子量的葡聚糖(分子量分別為3、6、10、20、40、70、100、200 kDa)，分別用雙蒸水配制成1 mg/mL葡聚糖溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾頭凈化，按分子量由小到大依次進(jìn)行高效凝膠滲透色譜(high-performance gel-permeation chromatography，HPGPC)分析，以葡聚糖的保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的相對(duì)分子量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.3 樣品的制備 精密稱取純化后的生黃精、酒黃精、九蒸九曬黃精多糖10 mg，加超純水溶解，配成1 mg/mL溶液，過0.22 μm微孔濾頭，備用。

2.5 單糖組成分析

2.5.1 氣相色譜法(gas chromatography，GC)分析條件 采用RTX-5毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣：高純氮?dú)?；分流?0∶1；氫火焰離子化檢測(cè)器；程序升溫：柱溫先于120 ℃保持2 min，之后以3 ℃/min速度升至210 ℃，并保持40 min。

2.5.2 多糖的水解 分別精密稱取生黃精、酒黃精、九蒸九曬黃精多糖凍干粉各10 mg置于3支不同的試管中，加入2.0 mol/L三氟乙酸溶液3 mL，密封后置于120 ℃充分水解4 h。將得到的3種多糖水解液分別真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入甲醇3 mL，再次蒸干，如此重復(fù)3次，以除去殘留的三氟乙酸，得各多糖樣品水解液，最后將多糖樣品置于干燥箱中，備用。

2.5.3 多糖水解液及單糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化 精密稱取各單糖標(biāo)準(zhǔn)品(葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖)及3種水解多糖樣品各10 mg于試管中，各管分別加入10 mg鹽酸羥胺和1 mL無水吡啶，混勻，于90 ℃水浴加熱30 min，取出放冷至室溫，加入無水乙酸酐1 mL，繼續(xù)于90 ℃水浴加熱30 min進(jìn)行乙?；磻?yīng)完成后，置于室溫冷卻，過0.22 μm有機(jī)濾膜，得待測(cè)樣品，用于GC分析。

2.6 紅外光譜分析 分別取九華黃精及炮制品多糖各1 mg，加澳化鉀研磨壓制成1 mm厚度，測(cè)定其在4 000～400 cm范圍內(nèi)的紅外光譜。

3 結(jié)果

3.1 黃精多糖的色澤和含量 生黃精及炮制后的黃精經(jīng)水提醇沉和透析處理后得到的黃精多糖在色澤上存在顯著差異(見圖1)，生黃精多糖為白色粉末，而經(jīng)炮制后的酒黃精和九蒸九曬黃精為棕色粉末。炮制前后的黃精多糖含量也存在顯著差異，生黃精的多糖含量為44.53%±1.21%，酒黃精的多糖含量為23.59%±0.56%，九蒸九曬黃精的多糖含量為18.02%±0.86%，生黃精經(jīng)酒制和九蒸九曬后，多糖含量分別降低了20.94%和26.51%。

圖1 黃精多糖炮制前后外觀變化

3.2 分子量排布測(cè)定 九華黃精及炮制品多糖的相對(duì)分子量見圖2，生黃精多糖只有一個(gè)分子量片段(峰2)，相對(duì)分子量為5.34 kDa。酒制和九蒸九曬黃精多糖則出現(xiàn)多個(gè)色譜峰，其中九蒸九曬黃精的分子量主要集中在兩個(gè)片段(峰1和峰2)，相對(duì)分子量分別為75.8 kDa、5.53 kDa。酒黃精的分子量主要集中在1個(gè)分子量片段(峰1)，相對(duì)分子量為76.4 kDa。

注：1、2.多糖色譜峰；3.溶劑峰；A.生黃精；B.九蒸九曬黃精；C.酒黃精；D.溶劑圖2 生黃精、酒黃精和九蒸九曬黃精多糖分子量排布色譜圖

3.3 單糖組成分析 標(biāo)準(zhǔn)單糖和炮制前后多糖樣品的GC色譜圖及單糖百分含量見圖3和表1。結(jié)果表明3種多糖均含有一定量的半乳糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖醛酸。酒蒸和九蒸九曬黃精多糖中甘露糖含量有所增加。與其他兩種多糖相比，酒黃精中含有少量阿拉伯糖，且半乳糖醛酸的相對(duì)含量由19.48%降低到8.38%，鼠李糖含量增加了5.31%。

注：A.單糖標(biāo)準(zhǔn)品；B.九蒸九曬黃精；C.酒黃精；D.生黃精；Rha為鼠李糖；Ara為阿拉伯糖；Glc為葡萄糖；Gal為半乳糖；Man為甘露糖；GalA為半乳糖醛酸圖3 標(biāo)準(zhǔn)單糖及多糖樣品衍生物的GC圖譜

表1 黃精多糖的單糖組成

圖4 生黃精(A)、酒黃精(B)和九蒸九曬黃精(C)的紅外光譜圖

表2 黃精多糖紅外光譜圖解析

4 討論

在本研究中，九華黃精多糖的含量高達(dá)44.53%。張靜等通過比較不同產(chǎn)地黃精多糖含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)安徽九華黃精多糖含量明顯高于其他產(chǎn)地黃精。九華黃精經(jīng)酒制和九蒸九曬炮制后，其多糖含量顯著降低，可能是由于在高溫蒸制過程中，部分多糖或黏液質(zhì)水解成單糖或低聚糖所致，這從經(jīng)反復(fù)蒸制的九蒸九曬黃精多糖含量低于經(jīng)一次蒸制的酒黃精也有所體現(xiàn)。采用HPGPC法對(duì)多糖分子量的測(cè)定結(jié)果表明，炮制之后多糖分子量增加。Sun等在考察滇黃精酒制前后分子量變化時(shí)，也發(fā)現(xiàn)多糖分子量增加的現(xiàn)象，并認(rèn)為多糖分子量增加可能與美拉德反應(yīng)有關(guān)。Liu等在何首烏蒸制過程中發(fā)現(xiàn)一種新的大分子化合物，并通過檢測(cè)美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物5-羥甲基糠醛和2，3-二氫-3，5-二羥基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮的動(dòng)態(tài)變化，證實(shí)了這種物質(zhì)是糖類和氨基進(jìn)行美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物。黃精中除了含有多糖、皂苷等主要成分，還含有糖蛋白(如凝集素)。因此，筆者認(rèn)為可能是黃精多糖中還原糖如葡萄糖、半乳糖等的醛基和蛋白質(zhì)中的氨基在加熱條件下發(fā)生美拉德反應(yīng)，形成含氮的棕色大分子聚合物或共聚物，從而導(dǎo)致多糖分子量增加。美拉德反應(yīng)能賦予食品獨(dú)特的風(fēng)味和色澤，更適宜作為功能食品使用。在單糖組成上，與其他黃精相比，九華黃精含有一定量的甘露糖，炮制后單糖組成的變化則可能和炮制過程中多糖類成分的糖基脫落，或者皂苷類成分水解脫糖基有關(guān)；由于阿拉伯糖主要存在于植物細(xì)胞壁中，也有可能是受酒制工藝的影響，酒黃精細(xì)胞壁破壞程度更大，在多糖提取過程中細(xì)胞壁里的多糖被更多提取出來，表現(xiàn)出阿拉伯糖相對(duì)含量增加。但具體原因有待進(jìn)一步研究。紅外光譜分析結(jié)果顯示，3種黃精均含多糖的特征吸收峰。紅外光譜分析結(jié)果還表明與生黃精多糖相比，酒黃精和九蒸九曬黃精中多糖均發(fā)生了不同程度的酯化，原因可能是高溫條件使部分羧基酯化。酒黃精的酯化度高于九蒸九曬黃精，這可能是由于醇羥基的存在更有利于酯化造成的。黃精多糖為黃精發(fā)揮功效的主要有效成分，多糖的性質(zhì)和生物學(xué)功能與其分子量和單糖組成等結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，九華黃精炮制前后其多糖組成和結(jié)構(gòu)的變化會(huì)影響性質(zhì)和功能。研究這些變化，對(duì)研究九華黃精炮制工藝、質(zhì)量控制和作用機(jī)制具有重要意義。