楊大偉，張光磊

吉林省敦化市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局畜牧站，吉林 敦化 133700

氣腫疽梭菌是黑腿病的病原體，氣腫疽是國(guó)內(nèi)反芻動(dòng)物易感的一種嚴(yán)重性疾病，該病可引發(fā)肌肉壞死和毒血癥，并伴隨高死亡率。盡管眾所周知預(yù)防該病暴發(fā)的重要性，但至今相關(guān)對(duì)黑腿病發(fā)病機(jī)制的研究卻少之又少，并且很多研究基于未經(jīng)證明的假設(shè)。其中一種假設(shè)認(rèn)為轉(zhuǎn)運(yùn)氣腫疽梭菌孢子從反芻動(dòng)物的腸道到肌肉，是巨噬細(xì)胞起到主要作用的原因。因此，現(xiàn)在的研究目的在于檢測(cè)氣腫疽梭菌或者孢子在通過(guò)牛單細(xì)胞源的巨噬細(xì)胞的吞噬作用后是否能夠保持活性，并展示出炎性反應(yīng)以及由氣腫疽活性細(xì)胞或者孢子感染牛巨噬細(xì)胞后產(chǎn)生相應(yīng)的抗炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄子。這些結(jié)果更能證實(shí)此典型的假設(shè)：在黑腿病的早期發(fā)病機(jī)制中，巨噬細(xì)胞可能起到十分重要的作用。

氣腫疽梭菌是一種革蘭氏陽(yáng)性厭氧菌，可以形成氣性壞疽，抑或在人和其它物種產(chǎn)生惡性水腫。氣性壞疽通常發(fā)生在創(chuàng)傷污染物，一般是在接種疫苗、分娩、剪毛或者抽血期間，與此同時(shí)伴隨著一種或多種梭狀菌的感染從而導(dǎo)致該病，相比于惡性水腫，在沒(méi)有任何創(chuàng)傷存在之前，氣腫疽通常被認(rèn)定為非創(chuàng)傷性或內(nèi)源性疾病，但值得確認(rèn)的是環(huán)境中的氣腫疽梭菌的孢子在吞噬作用下隨后通過(guò)巨噬細(xì)胞從腸道轉(zhuǎn)移至肌肉，從而保持一種潛伏狀態(tài)。一個(gè)小創(chuàng)口或者任何其他條件都會(huì)讓這些組織中的氧氣攝入量減少，進(jìn)而導(dǎo)致氣腫疽梭菌的激增，隨后發(fā)展成為肌肉壞死甚至病畜死亡。盡管都知道預(yù)防氣腫疽在牛的飼養(yǎng)中極其重要，但是直到現(xiàn)在仍然沒(méi)有數(shù)據(jù)可以說(shuō)明氣腫疽梭菌和吞噬細(xì)胞之間的關(guān)系，事實(shí)上在先天免疫中關(guān)于巨噬細(xì)胞的抵御作用僅限于A型產(chǎn)氣型莢膜梭菌，在巨噬細(xì)胞的內(nèi)化后，氣腫疽梭菌的細(xì)胞和孢子仍然保持活力，這種細(xì)菌可以引發(fā)動(dòng)物的氣性壞疽發(fā)生，進(jìn)而再傳染給人。因此該研究旨在檢測(cè)氣腫疽活細(xì)胞或者孢子通過(guò)牛單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞的吞噬作用后的存活性，同時(shí)分析比較在此感染后的牛巨噬細(xì)胞的炎性以及抗炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄子的屬性。此外，該研究亦能證實(shí)梭菌屬菌種感染牛單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞的感染動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞因子屬性。

1 材料與方法

1.1 準(zhǔn)備菌株和牛巨噬細(xì)胞系

從病畜體內(nèi)獲取已經(jīng)感染的細(xì)胞，進(jìn)行氣腫疽梭菌的菌株培養(yǎng)；并同時(shí)從健康的牛體內(nèi)提取巨噬細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，每隔24 h換液。

1.2 感染巨噬細(xì)胞

將已經(jīng)培養(yǎng)好的菌株感染牛正常的巨噬細(xì)胞系，然后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每12 h換液。

1.3 形態(tài)學(xué)觀察

將培養(yǎng)好的感染氣腫疽菌株的牛巨噬細(xì)胞在電子顯微鏡下進(jìn)行鏡下觀察，并記錄其形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。

1.4 單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞分離、培養(yǎng)和感染

將單核衍生的巨噬細(xì)胞用離心機(jī)3 000轉(zhuǎn)/s，4 ℃進(jìn)行離心分離，棄上清液，再次清洗，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)液在二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.5 檢測(cè)受感染牛單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞后細(xì)胞因子屬性

用檢測(cè)細(xì)胞因子的專屬ELISA試劑盒，檢測(cè)感染后的巨噬細(xì)胞的炎性因子和抗炎性因子。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)定感染牛巨噬細(xì)胞后的氣腫疽梭菌的存活性

氣腫疽梭菌的生長(zhǎng)細(xì)胞和孢子通過(guò)牛巨噬細(xì)胞的吞噬作用后都保持存活狀態(tài)。然而在繁殖體中的氣腫疽梭菌在牛巨噬細(xì)胞中表現(xiàn)為逐漸地減少。在感染24 h后，細(xì)胞外存活梭菌被完全清除，然而盡管用大量的洗滌液，也不可能將所有的細(xì)胞外梭菌孢子清除干凈，但是在受感染24 h以后，細(xì)胞外梭菌孢子數(shù)量顯著減少相比較內(nèi)化的梭菌孢子。超微結(jié)構(gòu)分析感染動(dòng)力學(xué)顯示自始至終，細(xì)菌的形成（包括活性細(xì)胞以及孢子）是在吞噬小囊泡進(jìn)行內(nèi)化作用，細(xì)胞內(nèi)孢子的完整性表明整個(gè)吞噬過(guò)程沒(méi)有起到損傷菌體的作用。

2.2 氣腫疽梭菌感染牛巨噬細(xì)胞后細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄子表現(xiàn)屬性

在感染的12 h以后，被氣腫疽梭菌活性細(xì)胞內(nèi)化后的牛巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，與之相反的是，在感染的24 h以后，內(nèi)化后的氣腫疽梭菌孢子誘導(dǎo)大量的抗炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄。

3 討論

氣腫疽梭菌感染在反芻動(dòng)物里是一種常見(jiàn)的疾病。在牛中，黑腿病在臨床上是一種眾所周知的嚴(yán)重性疾病，但是它的發(fā)病機(jī)制至今還未被完全理解透徹，已經(jīng)存在假設(shè)氣腫疽梭菌孢子是通過(guò)巨噬細(xì)胞從腸道或口腔創(chuàng)傷轉(zhuǎn)運(yùn)到肌肉當(dāng)中，一旦進(jìn)入到這些組織中氣腫疽梭菌孢子會(huì)保持休眠狀態(tài)直到引發(fā)缺氧狀態(tài)，在缺氧的條件下最終在初始期、激增期產(chǎn)生外毒素，這也是臨床病變發(fā)生的原因。在現(xiàn)代的研究中，氣腫疽梭菌的動(dòng)力學(xué)在鼠科動(dòng)物的巨噬細(xì)胞中研究的最多，在確認(rèn)氣腫疽梭菌能在傳代細(xì)胞系存活后，開(kāi)始對(duì)這種細(xì)菌在牛的單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞中的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證，并且在用氣腫疽梭菌活性細(xì)胞或者孢子感染牛巨噬細(xì)胞后的細(xì)胞因子的炎性以及抗炎性轉(zhuǎn)錄子進(jìn)行分析，同時(shí)將牛巨噬細(xì)胞中氣腫疽梭菌的活化物與鼠科動(dòng)物巨噬細(xì)胞中菌體活化物進(jìn)行比較，對(duì)比二者抗炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)路子，可以間接判斷其細(xì)胞因子轉(zhuǎn)路子的屬性，從而能夠證明這個(gè)典型的假設(shè)在黑腿病早期的發(fā)病機(jī)制中，巨噬細(xì)胞可能起到很重要的作用。傳統(tǒng)上致病的梭菌屬是細(xì)胞外微生物的轉(zhuǎn)錄子轉(zhuǎn)錄而成，產(chǎn)生強(qiáng)有力的毒素致使感染的宿主造成一系列的嚴(yán)重?fù)p傷。然而在過(guò)去的幾年里，研究表明在鼠科動(dòng)物里，產(chǎn)氣莢膜梭菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)化后仍然能夠持續(xù)存活，我們的研究顯示氣腫疽梭菌在巨噬細(xì)胞吞噬作用后也能夠保持抵抗細(xì)菌消除機(jī)制。之前的研究證明在鼠科動(dòng)物中，在巨噬細(xì)胞的氣腫疽梭菌的孢子在受到感染的72 h后仍能存活，這種結(jié)果可能是由于孢子在潛伏期的休眠性所導(dǎo)致的。