李 磊，蔣 敬，陳云霞*

(1.南京林業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210037；2.南京森林警察學(xué)院，江蘇 南京 210023)

防止野生動(dòng)植物相關(guān)犯罪是維護(hù)生態(tài)安全、保護(hù)人民健康的重要舉措，是森林公安、食藥環(huán)等執(zhí)法部門(mén)的首要任務(wù)。然而，有效打擊野生動(dòng)植物相關(guān)犯罪活動(dòng)的重要環(huán)節(jié)之一就是涉案物證的種屬來(lái)源確認(rèn)。涉案動(dòng)植物及其制品是否屬于國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)物種或《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》(CITES)附錄監(jiān)管物種是相關(guān)犯罪定性以及量刑的主要依據(jù)。通常涉案的動(dòng)植物法醫(yī)樣本有兩類(lèi)，一類(lèi)為成分單一的動(dòng)植物個(gè)體、組織、器官或制品等，此類(lèi)樣本可通過(guò)形態(tài)學(xué)方法或DNA條形碼(DNA barcoding)方法進(jìn)行種屬來(lái)源的鑒別；另一類(lèi)則為非單一物種來(lái)源的樣本，如一些肉制品、保健品、傳統(tǒng)中成藥物等，此類(lèi)檢材具多重物種來(lái)源，成分復(fù)雜。通常DNA條形碼技術(shù)，一次只能檢測(cè)出一種物種，當(dāng)分析由不同物種組成的混合樣本時(shí)，由于這些樣品通常由一種以上的成分組成，只有在多種DNA條形碼模板可以并行測(cè)序的情況下，才能有效地進(jìn)行分析，這是第2代測(cè)序技術(shù)可以有效完成的[1]。因此，對(duì)于混合生物樣本，DNA宏條形碼技術(shù)(DNA metabarcoding)可實(shí)現(xiàn)多物種的同步快速識(shí)別，具有良好的應(yīng)用前景。

筆者對(duì)DNA宏條形碼技術(shù)進(jìn)行了簡(jiǎn)要介紹，并從司法實(shí)踐應(yīng)用的角度出發(fā)，概述了DNA宏條形碼技術(shù)在食品藥品監(jiān)管、刑事案件偵查等動(dòng)植物法醫(yī)鑒定領(lǐng)域的研究與應(yīng)用現(xiàn)狀，對(duì)其在實(shí)踐應(yīng)用中所面臨的問(wèn)題與挑戰(zhàn)進(jìn)行了剖析，并對(duì)其應(yīng)用前景等進(jìn)行了探討與展望，可以為推進(jìn)DNA宏條形碼技術(shù)在動(dòng)植物法醫(yī)鑒定領(lǐng)域的常規(guī)化應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)及實(shí)踐支撐。

1 DNA宏條形碼技術(shù)概述

1.1 基于1代測(cè)序(Sanger測(cè)序)的DNA條形碼技術(shù)

DNA條形碼技術(shù)是利用生物基因組中普遍存在的一段較短的、標(biāo)準(zhǔn)的DNA 序列作為分子標(biāo)記，通過(guò)參考數(shù)據(jù)庫(kù)同源比對(duì)以及進(jìn)化樹(shù)分析來(lái)確定物種間的親緣關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)動(dòng)物、植物、真菌等物種的快速準(zhǔn)確鑒定。相較于傳統(tǒng)的物種形態(tài)鑒定方法，DNA條形碼技術(shù)不受個(gè)體形態(tài)、性別以及發(fā)育階段的影響，通用性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高，而且便于標(biāo)準(zhǔn)化操作[2-3]。

DNA條形碼的概念在2003年一經(jīng)提出，很快成為物種分子鑒別的主要方法，在生物分類(lèi)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用[2]。2004年，由45個(gè)國(guó)家組成了生命條形碼聯(lián)盟(CBOL，the Consortium for the Barcode of Life)，該聯(lián)盟成立后，相繼開(kāi)發(fā)了一套標(biāo)準(zhǔn)的生物DNA條形碼以及操作流程，并建立了較為全面的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)——生命條形碼數(shù)據(jù)系統(tǒng)(BOLD，the barcode of life database system)[4]。截至2019 年12月，BOLD 已經(jīng)收錄了30.6萬(wàn)個(gè)物種，776.3萬(wàn)條DNA條形碼序列。研究者可以登錄系統(tǒng)通過(guò)物種名稱(chēng)來(lái)搜索相關(guān)物種的DNA條形碼數(shù)據(jù)，或者提交序列來(lái)鑒定該物種的分類(lèi)信息。隨著相關(guān)技術(shù)的不斷成熟和相關(guān)研究的不斷深入，DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)將會(huì)陸續(xù)得到補(bǔ)充和擴(kuò)展，同時(shí)結(jié)合計(jì)算機(jī)智能化，可實(shí)現(xiàn)物種的標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化鑒別，這將會(huì)推動(dòng)生物分類(lèi)學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展。

大量研究已表明，線(xiàn)粒體細(xì)胞色素氧化酶I基因(mitochondrialcytochromeCoxidaseI,COI)、細(xì)胞色素b基因(mitochondrialcytochromeb,Cytb)具有較高的突變率以及引物通用性，被認(rèn)為是標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物DNA 條形碼序列[2,5]。植物中，由于線(xiàn)粒體基因組進(jìn)化太慢，COI基因和其他線(xiàn)粒體基因并不是物種鑒定的理想選擇[6-7]。在植物DNA條形碼研究中，葉綠體成熟酶K蛋白編碼基因(matK)以及核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基基因(ribulose-1,5-bisphosphatecarhoxylase,rbcL)被認(rèn)為是植物的“核心”DNA條形碼[8-10]。

雖然DNA 條形碼技術(shù)已日趨成熟，也逐步發(fā)展成為分子鑒定及物種分類(lèi)的常規(guī)手段，但隨著新的應(yīng)用需求以及相關(guān)研究工作的深入，其局限性也非常明顯，比如一代測(cè)序技術(shù)無(wú)法完成對(duì)多物種混合樣品中的物種信息進(jìn)行快速同步分析與鑒定。所以DNA條形碼技術(shù)與一些新興技術(shù)的結(jié)合，如高通量測(cè)序技術(shù)，向著多技術(shù)融合以及多樣化的方向發(fā)展，將會(huì)具有更廣闊的應(yīng)用前景。

1.2 基于2代測(cè)序的DNA宏條形碼技術(shù)

第2代測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)是相對(duì)于1代測(cè)序技術(shù)而言，單次測(cè)序能獲得大量的序列數(shù)據(jù)，這是2代測(cè)序的突出特點(diǎn)，所以又被稱(chēng)為高通量測(cè)序技術(shù)[11-13]。第2代測(cè)序的主流測(cè)序技術(shù)主要有3種，分別為Roche/454 焦磷酸測(cè)序技術(shù)、Illumina/Solexa 聚合酶合成測(cè)序技術(shù)和ABI/SOLiD 連接酶測(cè)序技術(shù)。Illumina公司目前擁有MiSeq、NextSeq、HiSeq系列等多樣的高通量測(cè)序平臺(tái)，優(yōu)勢(shì)在于其產(chǎn)生的測(cè)序數(shù)據(jù)錯(cuò)誤率極低[14]，但其最大讀長(zhǎng)較短，一般不超過(guò)300 bp；Roche公司的454測(cè)序平臺(tái)的測(cè)序讀長(zhǎng)可達(dá)400 bp，在讀長(zhǎng)方面具有突出優(yōu)勢(shì)，但會(huì)出現(xiàn)插入和缺失的錯(cuò)誤類(lèi)型，而且整體錯(cuò)誤率高達(dá)約1.5%[14-15]；ABI/SOLiD 測(cè)序平臺(tái)讀長(zhǎng)最短，僅有50 bp，但其優(yōu)勢(shì)在于應(yīng)用了雙堿基編碼，降低了測(cè)序的錯(cuò)誤率，而且具有與重測(cè)序相似的原理，所以SOLiD測(cè)序平臺(tái)特別適合具有高質(zhì)量參考基因組的物種重測(cè)序[10,14]。

DNA測(cè)序技術(shù)在生命科學(xué)的發(fā)展中起著重要的作用。高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，使得DNA 測(cè)序技術(shù)發(fā)生了重要轉(zhuǎn)變，同時(shí)給生命科學(xué)研究帶來(lái)了更多新的方法和途徑?，F(xiàn)階段，高通量測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組、基因組、微生物組測(cè)序等方面[12,16-17]。DNA宏條形碼技術(shù)就是隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展而新興的一種物種分類(lèi)鑒別以及生物多樣性分析的技術(shù)。該技術(shù)結(jié)合了高通量測(cè)序技術(shù)和DNA條形碼的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)單次測(cè)序可以同時(shí)獲得樣本中所有物種的目的基因擴(kuò)增子序列，然后通過(guò)生物信息學(xué)手段對(duì)這些序列進(jìn)行除錯(cuò)、去冗、聚類(lèi)等分析，從而確定混合樣本中的物種組成?，F(xiàn)階段，DNA宏條形碼技術(shù)以高效率與低價(jià)格的優(yōu)勢(shì)極大地拓展了DNA條形碼的應(yīng)用范疇。

2 DNA宏條形碼技術(shù)在動(dòng)植物法醫(yī)鑒定中的應(yīng)用

DNA宏條形碼技術(shù)的早期應(yīng)用多集中于生物多樣性研究，主要是微生物群落的多樣性?，F(xiàn)在該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物食性分析、食品源性成分分析、藥品基源組成分析、生態(tài)評(píng)估等多個(gè)研究領(lǐng)域。DNA宏條形碼技術(shù)在動(dòng)植物法醫(yī)鑒定領(lǐng)域的應(yīng)用目前也開(kāi)展了初步研究，比如食品摻假、藥品摻偽、瀕危動(dòng)物非法添加的監(jiān)管、死者原生地推斷等方面的應(yīng)用。

2.1 食品監(jiān)管

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外食品摻假以及食品安全事件頻有發(fā)生。以“國(guó)家林業(yè)局森林公安司法鑒定中心”(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“中心”)受理的案件為例， 2013年，“中心”對(duì)江陰市檢疫局送檢的標(biāo)稱(chēng)羊肉凍制品進(jìn)行源性成分鑒別，其中除了檢出綿羊 (Ovisaries)成分，還檢出了北極狐(Vulpeslagopus)、赤狐(V.vulpes)、貉(Nyctereutesprocyonoides)的成分；2014年，對(duì)南昌市工商行政管理局送檢的100余份在售牛肉干進(jìn)行源性成分鑒定，其中40%的牛肉干存在摻假行為，檢出了豬(Susscrofadomesticus)、雞(Gallusgallusdomesticus)以及鴨(Anasplatyrhynchos)的成分。這些食品的摻假、標(biāo)簽誤標(biāo)、“瞞標(biāo)”等是關(guān)系人類(lèi)健康和社會(huì)發(fā)展的重要問(wèn)題。在此類(lèi)問(wèn)題中，源性成分組成的準(zhǔn)確鑒定是解決該問(wèn)題的關(guān)鍵，也是對(duì)食品真?zhèn)渭捌滟|(zhì)量監(jiān)控的有效手段。

DNA宏條形碼技術(shù)作為一種基于高通量測(cè)序的新型物種鑒別技術(shù)，相比傳統(tǒng)的食品真?zhèn)舞b別方法具有準(zhǔn)確、高效等優(yōu)勢(shì)，目前在食品源性成分鑒定中的應(yīng)用已有一些學(xué)者開(kāi)展了相關(guān)研究。如Prosser等[18]、邢冉冉等[19]應(yīng)用Ion Torrent PGM測(cè)序平臺(tái)，以COI(120 bp)、rbcLa(162 bp)和[nuclear ribosomal DNA internal transcrsbed spacer 2, (ITS2)](～350 bp)為條形碼標(biāo)記，對(duì)不同產(chǎn)地和加工方式的7種蜂蜜進(jìn)行了真?zhèn)舞b別。其中，蜂蜜中花粉的物種來(lái)源用ITS2作為分子標(biāo)記；蜂蜜中微量或者降解的植物DNA種屬來(lái)源的鑒定用rbcLa作為分子標(biāo)記；其蜜蜂的來(lái)源鑒定用COI基因作為分子標(biāo)記。該研究利用DNA宏條形碼技術(shù)基本實(shí)現(xiàn)了蜂蜜中蜜源植物與采蜜蜂源的準(zhǔn)確鑒定，為蜂蜜的真?zhèn)舞b別以及產(chǎn)地溯源提供了一個(gè)新的途徑，也為其他食品的真?zhèn)舞b別提供了新思路。Stefanie等[20]選擇歐洲食品中常見(jiàn)的15種哺乳動(dòng)物和6種家禽動(dòng)物為研究對(duì)象，分別構(gòu)建了不同物種組合的DNA提取液，并制備了4種模式香腸，利用MiSeq(Illumina)測(cè)序平臺(tái)，線(xiàn)粒體16S ribosomal RNA(16S rRNA)基因的一個(gè)區(qū)域作為條形碼片段，對(duì)其物種組成進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，21種目標(biāo)物種均可被識(shí)別，而且靈敏度高，可檢測(cè)含量低至0.1%的物種。該研究還通過(guò)對(duì)個(gè)體DNA提取液、混合DNA提取液和模型香腸提取液的分析，探討了該方法的適用性，因此該方法在常規(guī)分析中具有很高的應(yīng)用潛力。蔡一村等[21]選擇24個(gè)哺乳動(dòng)物、禽類(lèi)和魚(yú)類(lèi)為研究樣本(包括東北虎(Pantheratigrisaltaica)、梅花鹿(Cervusnippon)等珍稀瀕危物種)，以354 bp的16S rRNA基因區(qū)域片段作為分子標(biāo)記，利用基于高通量測(cè)序的(Illumina公司MiSeq測(cè)序平臺(tái))DNA宏條形碼技術(shù)分別對(duì)混合DNA 樣品、模擬動(dòng)物源性樣品(煮熟的肉丸)、已知濃度占比動(dòng)物源性樣品以及商業(yè)化樣本中的動(dòng)物源性成分進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，混合樣品中所有動(dòng)物源性成分均能正確鑒定，而且最低檢測(cè)下限達(dá)0.5 ng/μL。特別是在針對(duì)市售的10個(gè)商業(yè)化動(dòng)物源性制品樣本進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)了2例標(biāo)簽不符的問(wèn)題。該檢測(cè)方法有效實(shí)現(xiàn)了混合動(dòng)物源性制品中物種來(lái)源的同步識(shí)別，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，適用范圍廣，有望為食品監(jiān)管、打擊走私等相關(guān)執(zhí)法提供技術(shù)支持。

2.2 藥品監(jiān)管

傳統(tǒng)中成藥(traditional Chinese medicine, TCM)已經(jīng)有幾千年的歷史，是我國(guó)大部分人口的主要藥物治療手段，近幾十年來(lái)，中藥與傳統(tǒng)的西醫(yī)結(jié)合作為替代療法，在亞洲以外地區(qū)的使用越來(lái)越多。中成藥的一個(gè)基本特點(diǎn)就是使用植物、動(dòng)物、礦物等自然資源入藥。比如我國(guó)藥用動(dòng)物有1581種，其中一部分動(dòng)物就屬于珍惜瀕危野生動(dòng)物。據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》(2000年版)所載的62種藥用動(dòng)物中，被列入國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物名錄的有9種，被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》附錄監(jiān)管的有15種，共占39%[22]。

隨著中藥產(chǎn)品的日益普及，對(duì)中藥的種類(lèi)及數(shù)量的需求也隨之增長(zhǎng)，而這種需求已經(jīng)成為一系列瀕危物種生存的主要威脅之一，如高鼻羚羊(Saigatatarica)、印度犀牛(Rhinocerosunicornis)、東北虎、黑熊(Ursusthibetanus)等。CITES公約于1973年6月21日在華盛頓簽署，于1975年7月1日正式生效，所又稱(chēng)華盛頓公約。該公約禁止或限制了3.5萬(wàn)多種瀕危野生動(dòng)植物及其制品的貿(mào)易。我國(guó)于1981年4月8日正式加入該公約，成為履約國(guó)之一，根據(jù)CITES公約及附錄的有關(guān)規(guī)定，凡含有附錄Ⅰ、附錄Ⅱ或附錄Ⅲ所列物種成分的中藥材或中成藥進(jìn)行國(guó)際貿(mào)易，必須要遵循CITES公約的要求和我國(guó)相關(guān)機(jī)構(gòu)的有關(guān)規(guī)定，否則，均屬于非法走私[23]。所以，中成藥中動(dòng)植物成分的分析鑒定，可以有效監(jiān)管藥物摻偽、瀕危動(dòng)植物非法添加等違法行為，保障藥品的安全性與合法性。

近年來(lái)，不少學(xué)者將DNA宏條形碼技術(shù)應(yīng)用到中成藥物成分鑒定的研究中。如Coghlan等[24]利用高通量測(cè)序技術(shù)，以tRNAnucleoticlyltransferasel(trnL)和16S rRNA為分子標(biāo)記，對(duì)15種海關(guān)進(jìn)口的以粉末、晶體、膠囊、片劑和草藥茶等形式呈現(xiàn)的中藥制劑成分進(jìn)行了鑒定，共鑒定出68種動(dòng)植物物種，其中一些重要樣本中甚至檢測(cè)出了黑熊、高鼻羚羊等瀕危物種，一些樣品中檢出麻黃屬(Ephedra)、細(xì)辛屬(Asarum)等未列出的可能有毒或致敏的植物成分。Cheng等[25]基于高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)3個(gè)廠(chǎng)家生產(chǎn)的不同批號(hào)共9份六味地黃丸的六味配方進(jìn)行宏條形碼分析，結(jié)果顯示，不同商家的產(chǎn)品在質(zhì)量和安全性方面存在顯著差異，因?yàn)樵谝恍┝兜攸S丸中發(fā)現(xiàn)了未上市的刺五加(Acanthopanaxsenticosus)，可能會(huì)給消費(fèi)者帶來(lái)安全風(fēng)險(xiǎn)。Raclariu等[26]利用DNA宏條形碼技術(shù)結(jié)合高效液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜法(High Performemce Liquid Chromatoqraphy-Mass Spectrometry, HPLC-MS)對(duì)16份市售含有藥用婆婆納(Veronicaofficinalis)的中藥產(chǎn)品進(jìn)行成分分析。結(jié)果顯示，只有15%的產(chǎn)品可檢測(cè)到藥用婆婆納，62%的產(chǎn)品檢測(cè)到混偽品石蠶葉婆婆納(V.chamaedrys)。石林春[27]等使用Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)，以ITS2為條形碼，對(duì)3份不同批次的如意金黃散進(jìn)行物種基原識(shí)別。結(jié)果表明，基于DNA宏條形碼技術(shù)可檢測(cè)到除厚樸(Magnoliaofficinalis)外的全部處方成分，而且檢測(cè)到藥材蒼術(shù)(Atractylodeslancea)的混偽品朝鮮蒼術(shù)(Atractylodescoreana)以及天南星(Arisaemaheterophyllum)的混偽品虎掌(Pinelliapedatisecta), 說(shuō)明如意金黃散臨床使用的有效性和安全性存在一定的潛在風(fēng)險(xiǎn)。這些研究表明，DNA宏條形碼技術(shù)不僅為中藥質(zhì)量控制提供了新技術(shù)，也為藥品監(jiān)管、非法貿(mào)易的查處、野生動(dòng)植物保護(hù)提供了技術(shù)支持。

2.3 刑事案件偵查

在一些刑事案件偵查中，往往嫌疑人或死者身上攜帶的植物信息能幫助警方縮小偵查范圍，為案件偵破提供線(xiàn)索。如劉萌妍等[28]采用Ion S5TM(Thermo Fisher Scientific)高通量測(cè)序平臺(tái)，以rbcL(402 bp)與matK(349 bp)基因片段為條形碼，對(duì)一具無(wú)身份信息男性尸體10份肺部組織中的孢粉組成進(jìn)行分析，共取得27科31屬32種植物，雖然其中超過(guò)15個(gè)屬都難以鑒定到種，但是并不影響死者原居住地的推斷。研究結(jié)果顯示，在31個(gè)屬中有9個(gè)屬的物種有一定程度的地域指示作用，比如龍眼屬(Dimocarpus)、黃連屬(Coptis)、波羅蜜屬(Artocarpus)、買(mǎi)麻藤屬(Gnetum)、鐵力木屬(Mesua)、銀葉樹(shù)屬(Heritiera)、同鐘花屬(Homocodon)、刺葵屬(Phoenix)和青梅屬(Vatica)，這些植物種屬與廣西、廣東、云南、海南等地具有較高的地域相關(guān)度。實(shí)地調(diào)查結(jié)果也印證了該研究的分析結(jié)果，死者生前確實(shí)在廣西南部某縣長(zhǎng)期生活過(guò)。該研究表明利用DNA宏條形碼技術(shù)可以分析死者肺組織內(nèi)所攜帶的植物孢粉信息，結(jié)合植物地理分布輔助推斷死者生前的居住地，為無(wú)名尸案件的尸源查找提供新的思路與方法。

3 存在的問(wèn)題

雖然DNA宏條形碼技術(shù)作為成熟的物種鑒定方法，被廣泛應(yīng)用于生物多樣性、動(dòng)物食性、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品藥品監(jiān)管等生命科學(xué)與生態(tài)學(xué)領(lǐng)域，但是在法庭科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用還有一些問(wèn)題需要克服與解決。

3.1 DNA的提取

混合成分生物樣本的物種鑒定，樣品的初始制備以及DNA的提取是最關(guān)鍵的一步。由于涉案樣品的復(fù)雜性和多樣性，每個(gè)提取步驟都很難標(biāo)準(zhǔn)化和優(yōu)化，而且每個(gè)樣品存在的問(wèn)題都不相同。例如，難以確保從由許多異質(zhì)成分組成的混合樣品中獲得所有物種的基因組DNA，所以在這種情況下，充分的均質(zhì)化在DNA提取之前特別關(guān)鍵。還有一些法醫(yī)樣品，比如中成藥物，可能含有非常少量的DNA，或者在生產(chǎn)過(guò)程中經(jīng)過(guò)高溫、高壓、pH調(diào)節(jié)、研磨或干燥等各種處理的成分，可能會(huì)導(dǎo)致DNA高度降解[29-31]。此外，無(wú)法從待檢樣本中消除潛在的抑制成分和干擾物質(zhì)，例如多酚、多糖、脂質(zhì)等，這些可能會(huì)嚴(yán)重影響PCR擴(kuò)增。所以，任何可能導(dǎo)致下游偏差的因素都需要最小化。在許多情況下，法醫(yī)樣本中DNA提取和PCR擴(kuò)增的不成功直接阻礙了物種的有效鑒定。因此，需要系統(tǒng)的研究來(lái)優(yōu)化DNA的分離方法和效率，獲得一個(gè)穩(wěn)定快速的可廣泛應(yīng)用于野生動(dòng)植物法醫(yī)樣本的DNA分離方法，達(dá)到DNA純度和產(chǎn)量的最大化。

3.2 DNA條形碼的選擇

在條形碼的選擇方面，宏條形碼技術(shù)與傳統(tǒng)的DNA條形碼技術(shù)并不完全相同。首先條形碼的選擇既要保證不同物種間的通用性，又要具有足夠的分類(lèi)變異。

首先，對(duì)于動(dòng)物源性成分的檢測(cè)，條形碼的通用性相對(duì)比較強(qiáng)，但是對(duì)于植物，并沒(méi)有通用性較好的條形碼，雖然已經(jīng)針對(duì)不同的應(yīng)用領(lǐng)域(如陸地植物的分類(lèi)學(xué)鑒定、藥用植物的鑒定等)提出了不同組的DNA條形碼，并且它們都不符合通用條形碼的真實(shí)要求，理想情況下，充分的植物物種鑒別需要結(jié)合使用多種DNA條碼標(biāo)記。通常由于PCR引物序列的通用性不足，可能會(huì)導(dǎo)致復(fù)雜樣本中PCR擴(kuò)增發(fā)生偏倚而使得某些物種漏檢。

其次，由于動(dòng)植物混合法醫(yī)樣本通常可能是高度加工的，如中藥、保健品、肉制品等，其DNA發(fā)生嚴(yán)重降解，在此類(lèi)樣品中，DNA的降解通常會(huì)阻礙PCR的片段擴(kuò)增，一般不超過(guò)300 bp[32-34]，因此DNA宏條形碼在動(dòng)植物法醫(yī)鑒定中的應(yīng)用需要能夠基于短DNA序列進(jìn)行物種鑒定的條形碼[5]。使用較短的條形碼，即所謂的迷你條形碼，由于片段較小，因此在降解樣品中通常比標(biāo)準(zhǔn)的全長(zhǎng)條形碼擴(kuò)增效率更高[32-33]。但另一方面，通常迷你條形碼的長(zhǎng)度與分類(lèi)學(xué)辨別率呈正相關(guān)。所以，盡管可以設(shè)計(jì)微型PCR引物以適應(yīng)DNA降解樣品中較短DNA條形碼區(qū)域的擴(kuò)增，但是這種微型條形碼包含的信息較少，其引物限制性較大，分辨率低。

3.3 參考序列數(shù)據(jù)庫(kù)

DNA宏條形碼技術(shù)要實(shí)現(xiàn)物種分類(lèi)學(xué)地位的確認(rèn)，必須通過(guò)與某個(gè)參考數(shù)據(jù)庫(kù)的序列進(jìn)行比對(duì)與匹配。然而參考序列數(shù)據(jù)庫(kù)的質(zhì)量和完整性，對(duì)執(zhí)法問(wèn)題尤為重要，因?yàn)樵谒痉ㄨb定中高質(zhì)量和可靠性至關(guān)重要。但是目前一些珍稀瀕危物種及其近緣物種的DNA條形碼參考數(shù)據(jù)不足嚴(yán)重阻礙了其物種的鑒定。

4 展 望

伴隨著DNA高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展以及DNA條形碼應(yīng)用需求的擴(kuò)增，共同孕育了DNA宏條形碼技術(shù)的誕生，兩種技術(shù)的結(jié)合可以準(zhǔn)確、快速鑒定混合樣品中的物種組成。該技術(shù)雖然已應(yīng)用于生命科學(xué)的不同領(lǐng)域，目前仍處于起步階段，尚存在一些技術(shù)上的問(wèn)題和挑戰(zhàn)，比如條形碼的通用性、條形碼的分辨率、PCR偏向性以及數(shù)據(jù)庫(kù)的覆蓋度等，但這些問(wèn)題隨著研究的不斷深入以及技術(shù)的進(jìn)步，都是有可能解決的。如Coissac等[35]對(duì)DNA宏條形碼技術(shù)在動(dòng)植物生物多樣性分析中存在一些問(wèn)題提出了相應(yīng)的解決策略，如引物設(shè)計(jì)問(wèn)題、PCR擴(kuò)增偏向性問(wèn)題、數(shù)據(jù)處理等問(wèn)題開(kāi)展了探討，為進(jìn)一步推進(jìn)DNA宏條形碼技術(shù)的廣泛應(yīng)用提供了一定參考。

雖然很難設(shè)計(jì)分辨率高、通用性強(qiáng)的迷你條形碼，但是在某些情況下，在屬或更高分類(lèi)級(jí)別上具有相對(duì)適度區(qū)分能力的迷你條形碼也是可用的。例如，我國(guó)重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)植物名錄里的瀕危物種以及CITES公約列出的監(jiān)管物種有時(shí)是整個(gè)目、科或?qū)伲皇菃蝹€(gè)植物物種。因此，對(duì)于我國(guó)重點(diǎn)保護(hù)名錄里的一些科屬，如隼科(Falconidae)、鸚鵡科(Psittacidae)、綠鳩屬(Treron)、蘇鐵屬(Cycas)、紅豆杉屬(Taxus)所有種；CITES公約列出的許多動(dòng)植物科屬，如鯨目(Cetacea)、貓科(Felidae)、熊科(Ursidae)、麝屬(Moschus)、穿山甲屬(Manis)、蘭科(Orchidaceae)、仙人掌科(Cactaceae)、黃檀屬(Dalbergia)、沉香屬(Aquilaria)所有種等，只需鑒定科或?qū)龠@一級(jí)的分類(lèi)單元即可。但是，這并不適用于所有非法交易的植物種屬，在這種情況下，另一種方法就是設(shè)計(jì)特定于該物種的迷你條形碼。

另外，隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，測(cè)序準(zhǔn)確度的提高以及測(cè)序長(zhǎng)度的增加，DNA條形碼局限性的問(wèn)題將會(huì)得到解決。比如第3代測(cè)序技術(shù)(又稱(chēng)為單分子測(cè)序)，其優(yōu)勢(shì)就在于整個(gè)測(cè)序不再依賴(lài)PCR擴(kuò)增，可以避免擴(kuò)增過(guò)程中出現(xiàn)的錯(cuò)誤，比如2代測(cè)序中PCR擴(kuò)增偏向性的問(wèn)題[12-13,17]；新一代測(cè)序技術(shù)即第4代測(cè)序技術(shù)，如納米孔測(cè)序，它采用物理方法直接讀取堿基序列，而不需要對(duì)DNA樣品進(jìn)行任何生物或化學(xué)方面的處理。未來(lái)基于納米孔的DNA測(cè)序技術(shù)可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)高通量和長(zhǎng)讀長(zhǎng)。因此，預(yù)計(jì)新一代的測(cè)序技術(shù)將同時(shí)具有2代測(cè)序的高通量以及一代測(cè)序的長(zhǎng)讀長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)，而且成本低于2代與3代測(cè)序[36]。

DNA宏條形碼技術(shù)在法庭科學(xué)中應(yīng)用不同于其他領(lǐng)域，在常規(guī)應(yīng)用之前，必須對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。只有當(dāng)DNA宏條形碼被證明是穩(wěn)定的、可跨實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)移的，該方法才能真正實(shí)現(xiàn)在法醫(yī)檢測(cè)中的常規(guī)化應(yīng)用。如Arulandhu等[37]開(kāi)展了多位點(diǎn)DNA宏條形碼方法在復(fù)雜樣本中鑒別瀕危物種的研究與驗(yàn)證，該方法是基于MiSeq測(cè)序平臺(tái)，利用12種DNA條形碼標(biāo)記，結(jié)合明確定義的實(shí)驗(yàn)混合物樣本進(jìn)行開(kāi)發(fā)的，同時(shí)開(kāi)發(fā)了一種具有友好界面的網(wǎng)絡(luò)生物信息學(xué)分析軟件，并在16個(gè)實(shí)驗(yàn)室的國(guó)際驗(yàn)證試驗(yàn)中，對(duì)該方法的性能進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法具有很高的重復(fù)性和靈敏度，足以鑒定混合物中干重含量為1%的物種。該研究為DNA宏條形碼技術(shù)在動(dòng)植物法醫(yī)鑒定中的常規(guī)化應(yīng)用奠定了很好的前期基礎(chǔ)。

雖然DNA宏條形碼在動(dòng)植物法醫(yī)鑒定中的應(yīng)用才剛剛開(kāi)始，仍屬于起步階段，但相信隨著各國(guó)學(xué)者的努力，測(cè)序技術(shù)與生物技術(shù)的發(fā)展，DNA宏條形碼技術(shù)一定會(huì)在動(dòng)植物法醫(yī)鑒定領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)常規(guī)化應(yīng)用，為野生動(dòng)植物相關(guān)犯罪活動(dòng)的打擊、食品藥品安全性與合法性的監(jiān)管提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。