楊帆 綜述 孫曉東 審校

上海市第一人民醫(yī)院眼科 國(guó)家眼部疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 上海市眼底病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海眼視覺與光醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究中心 上海市眼科疾病精準(zhǔn)診療工程技術(shù)研究中心 200080

1 概述

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是造成全世界老年人群發(fā)生不可逆性盲的主要原因[1-2]。美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心調(diào)查顯示，目前有超過175萬40歲及以上的美國(guó)人受到AMD的影響，預(yù)計(jì)這一數(shù)字到2020年將升至295萬[3]。在亞洲，由于人口老齡化的影響，AMD的患病率將會(huì)在接下來的幾十年中急劇增加[3]。早期AMD通常不伴隨明顯的臨床表現(xiàn)，但眼底檢查可以發(fā)現(xiàn)玻璃膜疣(drusen)的沉積和色素的改變，終末期表現(xiàn)為地圖樣萎縮和/或脈絡(luò)膜新生血管的生成。新生血管性AMD(neovascular AMD，nAMD)，僅占AMD總數(shù)的10%，但其致盲患者數(shù)占AMD致盲總?cè)藬?shù)的90%[1]。AMD最大的風(fēng)險(xiǎn)因素是年齡的增長(zhǎng)，除此之外，遺傳變異和環(huán)境因素(特別是吸煙)也被證明為AMD的重要致病因素[4-9]，同時(shí)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的病理性表達(dá)已經(jīng)被證實(shí)為nAMD的重要致病機(jī)制之一[10]?？筕EGF治療是nAMD的一線治療方案，能夠有效改善視網(wǎng)膜水腫并提高患者的視力；但隨著治療的延長(zhǎng)，越來越多的患者表現(xiàn)出對(duì)藥物的不敏感，甚至出現(xiàn)了病情的反復(fù)或加重[11-12]。因此，尋找到全新的治療靶點(diǎn)顯得更加必要和緊迫。

“蛋白質(zhì)組學(xué)”一詞是1995年從基因組學(xué)和蛋白質(zhì)學(xué)的結(jié)合中創(chuàng)造出來的[13]。蛋白質(zhì)組學(xué)包括對(duì)所有蛋白質(zhì)的鑒定及其功能和結(jié)構(gòu)的研究。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一般工作流程包括樣品選擇、蛋白質(zhì)提取、蛋白質(zhì)或肽段的制備、蛋白質(zhì)/肽段的分離、蛋白質(zhì)/肽段的鑒定和定量，以及對(duì)所獲得的定量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理和使用生物信息學(xué)對(duì)結(jié)果的解釋[14-15]。為了降低蛋白質(zhì)組學(xué)研究的復(fù)雜性，一些細(xì)胞分區(qū)如“分泌組”(研究體液或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的分泌蛋白)、“細(xì)胞表面蛋白質(zhì)組”、“磷酸化蛋白質(zhì)組”和“相互作用組”(研究在細(xì)胞中發(fā)生的一系列蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用)等概念相繼被提出[16]。臨床蛋白質(zhì)組學(xué)常用的定量方法為凝膠基聚丙烯酰胺凝膠電泳和二維差異凝膠電泳以及無凝膠同位素標(biāo)記技術(shù)。無凝膠方法包括用于相對(duì)和絕對(duì)定量的同量異位標(biāo)簽，利用細(xì)胞培養(yǎng)物中的氨基酸進(jìn)行穩(wěn)定同位素標(biāo)記以及無標(biāo)記定量，其可以克服凝膠方法在分析低豐度、不溶性或大分子量蛋白質(zhì)時(shí)繁瑣且低效率等諸多缺點(diǎn)[17-18]。

近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)逐漸成為視覺科學(xué)研究工作的一部分，旨在提高對(duì)健康和疾病中眼功能的理解[19]。早期眼蛋白質(zhì)組學(xué)研究重點(diǎn)是對(duì)眼特定成分中存在的離子和蛋白進(jìn)行描述，隨著技術(shù)的進(jìn)步，研究方向開始轉(zhuǎn)向帶有生物功能的翻譯后修飾[20]。2012年，人眼蛋白質(zhì)組計(jì)劃作為人類蛋白質(zhì)組計(jì)劃的一部分正式啟動(dòng)[21]。到目前為止，包括來自AMD患者或健康人的血漿、玻璃體、房水、視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞等多種組織和細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)已經(jīng)得到較為全面的展示[22-25]。本文對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在AMD中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)在AMD中的應(yīng)用

2.1 血液蛋白質(zhì)組學(xué)分析

由于特殊的免疫背景及血-視網(wǎng)膜屏障的存在，眼部病變中蛋白種類和含量的變化很難通過血液體現(xiàn)出來，但由于血液標(biāo)本更易獲得且操作更加安全穩(wěn)定，目前仍然存在基于血液標(biāo)本的眼蛋白質(zhì)組學(xué)研究。高豐度蛋白質(zhì)一直是血液蛋白質(zhì)組學(xué)分析的一個(gè)難點(diǎn)。

Xu等[26]利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)從26例AMD患者以及6位健康志愿者的血漿標(biāo)本鑒定出28個(gè)有顯著改變的蛋白，這些蛋白的生物功能包括免疫應(yīng)答、細(xì)胞生長(zhǎng)、決定細(xì)胞命運(yùn)、傷口愈合和代謝等多個(gè)方面。Kim等[27]研究發(fā)現(xiàn)，膜相關(guān)蛋白紐蛋白為nAMD的潛在血漿生物標(biāo)志物，且通過紐蛋白與AMD風(fēng)險(xiǎn)基因年齡相關(guān)性黃斑疾病易感性2(age-related maculopathy susceptibility 2，ARMS2)基因和補(bǔ)體因子H(complement factor H，CFH)基因的受試者工作特征曲線(Receiver operating characteristic，ROC)曲線分析顯示，紐蛋白結(jié)合基因建模能夠?qū)MD進(jìn)行更加精確地區(qū)分和診斷。Kim等[28]在后續(xù)的研究中還發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，AMD患者血漿中磷脂轉(zhuǎn)移蛋白和甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶-1的表達(dá)量均有增加，且在晚期nAMD患者中增加更為明顯，該2種蛋白與ARSM2和CFH基因類型組合建模同樣增強(qiáng)對(duì)AMD的鑒別能力。Arya等[29]研究通過將具有CFH變體(T1277C)基因并同時(shí)視網(wǎng)膜下沉淀物中結(jié)合有球狀羥基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)的個(gè)體與野生型以及單純CFH基因突變個(gè)體的血漿進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)血液中6種蛋白的濃度受到CFH基因突變的影響，明確了遺傳差異在視網(wǎng)膜下沉積物形成中的相關(guān)定性和定量信息。由于drusen等視網(wǎng)膜下沉積物的形成發(fā)生在AMD疾病過程的極早期，這個(gè)發(fā)現(xiàn)提示我們與HAP結(jié)合的關(guān)鍵蛋白可以減緩甚至防止drusen的形成，進(jìn)而提供一種在疾病早期強(qiáng)有力的預(yù)防和治療策略。以上這些研究結(jié)果證明對(duì)AMD患者的血漿進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析不僅能夠找到疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物，還能將這些結(jié)果與基因型相結(jié)合提高對(duì)疾病的鑒別和診斷；另外對(duì)于疾病早期血液蛋白生物標(biāo)志物的篩選，不僅能夠加深我們對(duì)疾病相關(guān)機(jī)制的認(rèn)識(shí)，甚至?xí)赡芨淖傾MD患者的診斷和治療。

2.2 淚液蛋白質(zhì)組學(xué)分析

淚液由淚腺、瞼板腺、附屬腺體和杯狀細(xì)胞產(chǎn)生，覆蓋在眼表面，起到保護(hù)、潤(rùn)滑和營(yíng)養(yǎng)的作用[30]。由于淚液樣本的獲取容易且無創(chuàng)，淚液一直作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究各種眼部和全身疾病，如干眼癥[31-32]，糖尿病[33]等的樣本。

Winiarczyk等[34]對(duì)14例AMD患者和6例對(duì)照組患者的淚液進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，共鑒定出了110種nAMD特異性表達(dá)蛋白以及97種干性AMD特異性表達(dá)蛋白。nAMD中的特異性表達(dá)蛋白主要參與吞噬作用、炎癥、蛋白質(zhì)水解的調(diào)節(jié)或者在細(xì)胞骨架功能中起關(guān)鍵作用，而在干性AMD特異性表達(dá)蛋白則主要參與氧化應(yīng)激、炎癥和蛋白水解等生物功能過程；該研究還發(fā)現(xiàn)10種熱休克蛋白(heat shock protein，Hsp)90相關(guān)蛋白在2種類型AMD淚液中高表達(dá)，其可能成為未來藥物靶標(biāo)的方向。另外，Winiarczyk等[34]在淚液中首次鑒定了8種與AMD疾病相關(guān)的新的蛋白，如SRC激酶信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑，Graves病載體蛋白和蛋白S100-A7A等。這些蛋白補(bǔ)充了對(duì)AMD發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，也提供了該特定蛋白在AMD患者淚液中表達(dá)的證據(jù)。

2.3 房水蛋白質(zhì)組學(xué)分析

房水是一種重要的眼內(nèi)液體，負(fù)責(zé)向眼內(nèi)無血管組織提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并帶走代謝廢物。房水蛋白水平在眼前后節(jié)疾病中均發(fā)生改變，表明房水蛋白可能在其發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用[35-36]。與血清相比，房水中蛋白質(zhì)濃度較低，為0.20～0.5 mg/ml，且存在一些高豐度蛋白如白蛋白、球蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白等，這為房水蛋白質(zhì)組學(xué)研究帶來了新的挑戰(zhàn)[37]。

Kim等[38]對(duì)nAMD患者房水進(jìn)行全蛋白質(zhì)組成分分析，鑒定出10種新的房水蛋白質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)nAMD患者房水蛋白主要參與急性期反應(yīng)、補(bǔ)體系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)等信號(hào)通路；通過篩選潛在的生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，nAMD患者房水中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β誘導(dǎo)蛋白ig-h3、血漿蛋白酶C1抑制劑和血漿銅藍(lán)蛋白有著更高的相對(duì)豐度且可以作為疾病的生物標(biāo)志物和治療的靶點(diǎn)。Yao等[39]檢測(cè)并對(duì)比了6例nAMD和6例白內(nèi)障患者房水中蛋白的組成，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的蛋白主要與炎癥、細(xì)胞凋亡、血管生成和氧化應(yīng)激有關(guān)，其中nAMD患者房水中載脂蛋白-1的表達(dá)量顯著增加，該蛋白是潛在的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的清除劑，其可能在nAMD中起到保護(hù)作用。

除了對(duì)房水中所有蛋白質(zhì)成分及表達(dá)水平變化的研究外，還有一些研究重點(diǎn)關(guān)注了房水中某些特定的蛋白群體。有證據(jù)表明泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system，UPS)的抑制會(huì)導(dǎo)致RPE細(xì)胞中毒性蛋白和炎性成分的積累，Lee等[40]對(duì)nAMD患者和對(duì)照者的房水進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)的分析后，鑒定出了6種UPS相關(guān)蛋白，包括26S蛋白酶體非三磷酸腺苷酶調(diào)節(jié)亞基1(26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 1 r，Rpn2)在內(nèi)的4種蛋白在AMD患者房水中含量較高，其中Rpn2的表達(dá)量在治療前、后均高于對(duì)照組，提示該蛋白可能為nAMD的生物標(biāo)志物。Kang等[41]收集nAMD患者抗VEGF治療前及治療后房水，對(duì)其中外泌體蛋白的分析結(jié)果顯示，在nAMD患者的房水中有6種蛋白表達(dá)增加，其中細(xì)胞角蛋白8在ROC曲線分析中表現(xiàn)最好，但其是否為生物標(biāo)志物還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。隨后Park等[42]研究證明了nAMD患者房水中Wnt抑制因子-1(Wnt inhibitory factor 1，WIF-1)和Dickkopf相關(guān)蛋白3表達(dá)上調(diào)，且WIF-1與視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)損傷的情況相關(guān)，首次將蛋白與疾病的解剖學(xué)和表型進(jìn)行聯(lián)系，使得被鑒定到的蛋白不僅可以作為疾病診斷的生物標(biāo)志物，還能作為疾病進(jìn)展程度及預(yù)后情況的預(yù)測(cè)分子。

Baek等[43]對(duì)干性AMD患者的房水標(biāo)本進(jìn)行了去除高豐度蛋白后的全蛋白質(zhì)組學(xué)分析，共定量到119個(gè)房水蛋白，有3個(gè)蛋白之前并未發(fā)現(xiàn)在drusen中存在或與干性AMD有聯(lián)系，其中上調(diào)的Lumican蛋白和角膜蛋白多糖(Keratocan)均與細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)相關(guān)。

以上對(duì)于AMD患者房水樣本的蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明房水中某種或某類特定蛋白的表達(dá)能夠受到疾病的影響，這些變化不僅僅局限于對(duì)新生血管的調(diào)節(jié)，還與氧化應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)等方面有很大的相關(guān)性。房水生物標(biāo)志物的篩選除了應(yīng)用于疾病診斷外，還在疾病分級(jí)和預(yù)后判斷上起到重要作用。

2.4 玻璃體液蛋白質(zhì)組學(xué)分析

眼內(nèi)液體包括房水和玻璃體液。從解剖學(xué)角度來講，玻璃體液與視網(wǎng)膜、RPE細(xì)胞等眼底組織和細(xì)胞的距離較房水更近，理論上更能直接地體現(xiàn)出眼底病變時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)的影響。

Koss等[44]應(yīng)用毛細(xì)管電泳結(jié)合質(zhì)譜分析73例初次接受治療的nAMD患者及15例特發(fā)性玻璃體混濁患者的玻璃體液樣本并鑒定AMD的潛在蛋白標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)nAMD患者的玻璃體液中19種蛋白質(zhì)上調(diào)，這些蛋白多由血漿衍生，參與生物(離子)轉(zhuǎn)運(yùn)、急性期炎癥反應(yīng)和血液凝固過程；對(duì)隨機(jī)選擇的5種蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證顯示α-1-抗胰蛋白酶為AMD的潛在蛋白標(biāo)記物。Nobl等[45]在132例nAMD患者玻璃體液標(biāo)本中鑒定出101種差異表達(dá)蛋白質(zhì)，使用嚴(yán)格的統(tǒng)計(jì)分析并實(shí)施封閉測(cè)試程序后篩選出候選生物標(biāo)志物后，后續(xù)ELISA驗(yàn)證結(jié)果顯示叢集素蛋白和色素上皮衍生因子在nAMD患者玻璃體液中顯著增加。

除了橫向探究AMD患者璃體液標(biāo)本中的生物標(biāo)志物外，Ecker等[46]首次完成了連續(xù)監(jiān)測(cè)nAMD患者玻璃體液蛋白質(zhì)組變化的前瞻性研究；該研究利用反相蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)測(cè)量了標(biāo)本中37種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，并將其變化與視網(wǎng)膜下水腫(subretinal fluid，SRF)厚度進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶9水平隨SRF厚度的變化而發(fā)生改變，這為繼續(xù)探究nAMD病情變化的相關(guān)分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

由于樣本采集的特殊性，目前對(duì)于AMD患者玻璃體樣本的研究數(shù)量較少且主要集中于nAMD人群。在以上3個(gè)研究中，研究者們通過對(duì)比找到了nAMD的生物標(biāo)志物，并完成了對(duì)玻璃體內(nèi)蛋白質(zhì)變化情況的監(jiān)測(cè)，這使得疾病中的某一病理特征與特定蛋白表達(dá)水平相聯(lián)系，有助于實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療。

2.5 視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜蛋白質(zhì)組學(xué)分析

視網(wǎng)膜的不同區(qū)域在分子構(gòu)成上是有差異的，分別發(fā)揮著獨(dú)特的功能并體現(xiàn)出對(duì)疾病的不同易感性。對(duì)這些區(qū)域和層次中每一個(gè)部分進(jìn)行單獨(dú)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析可以提供對(duì)疾病機(jī)制的多角度見解，包括AMD、糖尿病和青光眼等。因此在進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析之前，對(duì)視網(wǎng)膜進(jìn)行區(qū)域和層次的分離是必要的[47-48]。而作為受AMD疾病影響最大的眼底組織，脈絡(luò)膜的蛋白質(zhì)組學(xué)分析更能精準(zhǔn)地體現(xiàn)不同階段及不同類型AMD的分子機(jī)制。

Ethen等[49]將從人AMD供體上獲得的視網(wǎng)膜樣本按照黃斑視網(wǎng)膜和周邊視網(wǎng)膜分別進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析并按照疾病進(jìn)展分為4期，研究發(fā)現(xiàn)共有26種蛋白的表達(dá)水平隨著疾病嚴(yán)重程度的改變發(fā)生變化，其中參與微管調(diào)節(jié)的蛋白在AMD發(fā)病的早期發(fā)揮作用，包括微管蛋白、prefoldin-1、T-復(fù)合多肽1、共因子a和微管不穩(wěn)定蛋白；同時(shí)該研究還發(fā)現(xiàn)雖然黃斑區(qū)與周邊區(qū)視網(wǎng)膜有超過一半的蛋白表達(dá)存在差異，但是兩個(gè)區(qū)域仍有40%的蛋白變化一致，表明AMD引起的病理變化涉及到全視網(wǎng)膜而不僅僅局限于黃斑部位。同樣的，Yuan等[50]將獲得的AMD患者及健康對(duì)照者去世后捐獻(xiàn)Bruch膜/脈絡(luò)膜復(fù)合體的樣本按照疾病的不同階段進(jìn)行分類，在鑒定出的901種蛋白質(zhì)中，大多數(shù)蛋白在AMD和對(duì)照樣品之間的差異很小，而根據(jù)疾病進(jìn)展的不同進(jìn)行分析顯示升高的蛋白中大約60%參與免疫反應(yīng)和宿主防御過程；同時(shí)該研究結(jié)果顯示，RPE65、細(xì)胞視黃酸結(jié)合蛋白1(cellular retinoic acid-binding protein 1，CRABP1)、細(xì)胞視黃醛結(jié)合蛋白以及視黃酸受體間結(jié)合蛋白這4種視黃酸加工蛋白表達(dá)僅在早/中期AMD患者Bruch膜/脈絡(luò)膜復(fù)合體中升高，表明這些蛋白在AMD發(fā)病起始中發(fā)揮作用；而晚期糖基化終產(chǎn)物受體半乳糖凝集素3表達(dá)在晚期干性AMD患者Bruch膜/脈絡(luò)膜復(fù)合體中升高明顯，提示晚期糖基化終產(chǎn)物在干性AMD進(jìn)展中發(fā)揮作用。以上這些結(jié)果均證實(shí)了不同階段和不同類型的AMD涉及的蛋白及分子途徑不同。

Sohn等[51]使用雙向電泳和/或質(zhì)譜法來評(píng)估114只人眼脈絡(luò)膜-RPE復(fù)合體薄、厚脈絡(luò)膜間的蛋白差異，在較厚的脈絡(luò)膜中絲氨酸蛋白酶SERPINA3水平較高，而在薄的脈絡(luò)膜中金屬蛋白酶組織抑制劑-3表達(dá)水平較高。這種蛋白酶和蛋白酶抑制劑之間的失衡不僅有利于我們更好理解脈絡(luò)膜變薄的相關(guān)機(jī)制，同時(shí)還能指導(dǎo)開發(fā)AMD新療法。

綜上，就目前的研究而言，對(duì)于AMD患者視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜組織的蛋白質(zhì)組學(xué)分析大多根據(jù)解剖結(jié)構(gòu)和疾病分期來分類，盡管這可能損失掉部分對(duì)某一特定類型AMD的分析結(jié)果，但這樣的分析方法與很多臨床上對(duì)于疾病的研究相一致，這使得蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)能與臨床數(shù)據(jù)相匹配并在一定程度上支撐和解釋臨床相關(guān)結(jié)果。

2.6 Drusen蛋白質(zhì)組學(xué)分析

無論遺傳和環(huán)境因素如何，AMD患者早期的一個(gè)關(guān)鍵的表現(xiàn)是drusen的形成，這種包含脂質(zhì)和炎性廢物的細(xì)胞外沉積物隨著年齡的增長(zhǎng)積聚在RPE下方Bruch膜上，但drusen形成的具體分子機(jī)制尚未明確[19]。

Crabb等[52]開發(fā)了一種分離微克量級(jí)drusen和Bruch膜的方法用于蛋白質(zhì)組分析，結(jié)果顯示在AMD患者的drusen中晶狀體蛋白更常見，此外還發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的氧化修飾在AMD的發(fā)病機(jī)制中起到了關(guān)鍵作用。這些結(jié)果與在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的發(fā)現(xiàn)保持一致[53]。

2.7 RPE細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析

RPE細(xì)胞是血-視網(wǎng)膜屏障的關(guān)鍵組成部分，且是人體中具有最高吞噬活性的細(xì)胞，能通過吞噬并回收光感受器外節(jié)來維持視網(wǎng)膜的健康，因此RPE細(xì)胞發(fā)生功能障礙或死亡可導(dǎo)致光感受器細(xì)胞的減少，對(duì)AMD的發(fā)生及發(fā)展起到了十分關(guān)鍵的影響[19]。早期一系列重要的圍繞RPE細(xì)胞展開的蛋白質(zhì)組學(xué)研究大多以脂褐素為中心，脂褐素是一種由不同類別生物分子混合在一起的復(fù)雜混合物，且其中許多成分都存在氧化修飾[19]。由于脂褐素與AMD密切相關(guān)，闡明其詳細(xì)分子組成對(duì)于理解AMD具有十分重要的意義。

有研究檢測(cè)并對(duì)比了視網(wǎng)膜脂褐素和黑色素脂褐素的蛋白組成，證實(shí)了人脂褐素蛋白中氧化修飾的存在，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了2者存在來源的差異[54-55]。然而在Ng等[56]研究卻發(fā)現(xiàn)，從RPE中分離出的脂褐素顆粒雖然存在蛋白質(zhì)氧化修飾，但所占比例很小，這暗示著脂褐素致病機(jī)制可能并不依賴于相關(guān)蛋白質(zhì)氧化修飾來發(fā)揮作用。

Nordgaard等[57]對(duì)來自AMD患者供體的原代RPE細(xì)胞進(jìn)行了全蛋白質(zhì)組學(xué)分析，通過比較四個(gè)階段AMD的RPE蛋白質(zhì)組成，鑒定出早期疾病階段的蛋白標(biāo)志物，包括Hsp(如Hsp70等)和凋亡信號(hào)通路(如αA晶狀體蛋白等)的成分，其中一些蛋白與線粒體功能相關(guān)，晚期AMD衍生的RPE細(xì)胞顯示蛋白質(zhì)的變化與類視黃醇相關(guān)功能的擾動(dòng)有關(guān)，如CRABP1表達(dá)水平的改變?；诖搜芯拷Y(jié)果，該團(tuán)隊(duì)使用相同的方法學(xué)策略專注于探究RPE細(xì)胞中的線粒體蛋白質(zhì)組，結(jié)果顯示，線粒體翻譯和延伸所必需的線粒體延伸因子Tu在早期AMD階段RPE細(xì)胞中過表達(dá)，ATP合酶復(fù)合物的幾個(gè)亞基在3期和4期AMD的RPE細(xì)胞中的表達(dá)水平降低，參與核編碼蛋白質(zhì)向線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)的線粒體熱休克蛋白70在晚期AMD階段RPE細(xì)胞中表達(dá)降低，這些均表明在AMD的整個(gè)階段中均存在線粒體功能障礙，具體機(jī)制可能與線粒體翻譯，核編碼蛋白導(dǎo)入和ATP合成酶活性的改變有關(guān)[58]。

除了探討RPE細(xì)胞本身及其內(nèi)部成分，An等[59]對(duì)來自于AMD供體和原代RPE細(xì)胞的分泌蛋白組進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)RPE細(xì)胞分泌多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，補(bǔ)體因子和蛋白酶抑制劑，2個(gè)組間差異蛋白主要參與組織發(fā)育、血管生成以及補(bǔ)體調(diào)節(jié)和蛋白質(zhì)聚集。在后續(xù)的研究中，該團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)在AMD的發(fā)病機(jī)制中，高溫必需蛋白A1(high temperature requirement A1，HTRA1)與補(bǔ)體調(diào)節(jié)和淀粉樣蛋白沉積之間存在關(guān)聯(lián)[60]。

這些研究的結(jié)論與前文所述其他樣本來源研究在整體上并無明顯差異，對(duì)于AMD疾病的蛋白質(zhì)組學(xué)研究從人體組織或液體過渡到細(xì)胞層面使得我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室開展相關(guān)蛋白驗(yàn)證和疾病機(jī)制的探索變得更加直接。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)在AMD應(yīng)用中面臨的挑戰(zhàn)和前景展望

作為nAMD的一線治療方案，盡管抗VEGF療法已經(jīng)取得了突出的成績(jī)，但仍有約10%的患者并不能從中受益，且大量研究顯示這可能與特定的遺傳學(xué)因素相關(guān)，主要包括VEGF相關(guān)基因、補(bǔ)體相關(guān)基因、白細(xì)胞介素相關(guān)基因、ARMS2和HTRA1等[61]。在過去的十年中，遺傳學(xué)被認(rèn)為是AMD發(fā)展的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。然而，最近的一項(xiàng)有史以來最大樣本量隊(duì)列研究表明，即使納入19個(gè)基因位點(diǎn)對(duì)AMD進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果依然顯示遺傳因素對(duì)AMD進(jìn)行預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性較低[62]。因此，使用蛋白作為生物標(biāo)志物或許可以對(duì)疾病的發(fā)生和發(fā)展起到更好的預(yù)測(cè)作用，且目前研究顯示將蛋白質(zhì)組學(xué)與基因結(jié)果相結(jié)合的分析方法能夠在疾病的診斷中表現(xiàn)得更為突出。目前利用蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)AMD進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，差異蛋白主要集中于患者可能存在的氧化應(yīng)激、炎癥、補(bǔ)體、細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)等過程的紊亂，這提示我們可以將疾病治療的方向轉(zhuǎn)向這些方面來應(yīng)對(duì)部分患者出現(xiàn)的抗VEGF治療無應(yīng)答的情況。然而目前對(duì)出現(xiàn)抗VEGF治療無應(yīng)答患者生物標(biāo)志物的鑒定和相關(guān)機(jī)制的研究仍處于起步階段，我們課題組正在對(duì)有療效差異的兩組患者房水標(biāo)本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)，盡管現(xiàn)在尚未得到確切的結(jié)論，但我相信通過我們的研究能夠幫助大家加深對(duì)疾病以及治療抵抗相關(guān)機(jī)制的理解和認(rèn)識(shí)，同時(shí)提供在AMD疾病的預(yù)防、診斷和治療過程中的新思路。值得注意的是，蛋白質(zhì)組學(xué)在眼部疾病的應(yīng)用中也具有局限性，如，眼部組織獲取的風(fēng)險(xiǎn)高，獲取樣本的量也相對(duì)較少等。另外，膜蛋白和低豐度蛋白質(zhì)的分析也是眼部蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要限制。與其他學(xué)科的研究一樣，眼科蛋白質(zhì)組學(xué)不僅僅局限于疾病中差異表達(dá)蛋白的篩選，接下來的一項(xiàng)主要任務(wù)是嘗試對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行功能學(xué)鑒定，這包括對(duì)蛋白質(zhì)相互作用和反應(yīng)以后修飾的研究。未來應(yīng)用于AMD的蛋白質(zhì)組學(xué)研究不僅要克服以上困難，還應(yīng)注重治療前后發(fā)生的蛋白分子變化[63]以及擴(kuò)大樣本量，總結(jié)現(xiàn)有研究并開辟新的研究方向。

總之，盡管蛋白質(zhì)組學(xué)在AMD中的應(yīng)用面臨著不小的挑戰(zhàn)，但是由于其對(duì)疾病宏觀認(rèn)識(shí)的支持以及深入探索疾病相關(guān)機(jī)制的巨大潛力，該項(xiàng)技術(shù)在AMD和其他眼部疾病中具有廣闊的應(yīng)用空間。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突