莫佳妮 顏學兵

徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院感染性疾病科，江蘇徐州221002

HBV 感染及其相關(guān)肝臟疾病的治療一直是熱點研究領域， 現(xiàn)有的抗HBV 治療藥物主要有核苷類似物 （NAs）和IFN。 恩替卡韋和替諾福韋等NAs 以HBV DNA 聚合酶為靶點抑制病毒復制， 但其不能減少共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）的形成，而cccDNA 正是病毒持久存在的原因[1-2]。IFN 治療也僅對一小部分患者有效， 而且存在一定的不良反應[3-5]。 目前有許多在研的抗HBV 藥物，其中核衣殼組裝調(diào)節(jié)劑（CAMs）能破壞前基因組RNA（pgRNA）的封裝，導致核衣殼解體，從而影響HBV 復制的多個步驟，同時減少cccDNA庫[6]。 本文對各類CAMs 的發(fā)展及其與HBV 核心蛋白之間相互作用的研究進展進行綜述。

一、核衣殼組裝作為藥物靶點的可行性

目前在研的抗HBV 藥物主要有以宿主蛋白為靶點的宿主靶向藥物（HTA）和針對HBV 復制靶點的直接抗病毒藥物（DAAs）。 HTA 可直接作用于病毒因子和/或宿主免疫系統(tǒng)，如熱休克蛋白90（Hsp90）對HBV 衣殼的形成和穩(wěn)定有重要影響，抑制或下調(diào)Hsp90 可降低HBV 在HepG2.2.15 細胞中的復制[7]。 在研的DAAs 主要包括HBV 入侵抑制劑、HBsAg釋放抑制劑、靶向作用于cccDNA 抑制劑、HBV 轉(zhuǎn)錄抑制劑、聚合酶抑制劑、核衣殼組裝和pgRNA 包裝抑制劑。

核衣殼蛋白在HBV 基因組包裝、逆轉(zhuǎn)錄、胞內(nèi)運輸和維持HBV 復制循環(huán)等方面發(fā)揮作用[8]。 在HBV 組裝過程中，核心蛋白同源二聚體將HBV pgRNA 和聚合酶包裹， 形成具有生物活性HBV 的核衣殼。 有研究使用電荷檢測質(zhì)譜法發(fā)現(xiàn)，在HBV 組裝過程中早期產(chǎn)生的衣殼顆粒是有缺陷和過度生長的，但是經(jīng)過一段時間后HBV 會進行自我校正，表明結(jié)束裝配只是HBV 復制過程中特有階段，這與先前認為HBV 復制組裝過程會產(chǎn)生完美二十面體核衣殼的假設相反[9]。 值得注意的是，該研究是體外研究，并且是在沒有包裝材料的截短體核衣殼情況下進行的，因此，還需要更多的實驗去證實。盡管如此， 核衣殼組裝和校正過程為HBV 感染治療提供了一個有吸引力的方向。 小分子療法能使HBV 的核心蛋白不穩(wěn)定，增加核衣殼組裝率，形成畸變的或空的、無功能的核衣殼粒子[10]。

二、在研的CAMs 分類

目前在研CAMs 可以大致分為5 類： 苯丙烯酰胺（PPAs）、異芳基二氫嘧啶（HAPs）、磺酰苯甲酰胺（SBAs）、氨基酰吡咯酰胺（SPAs）和乙二氫吡咯酰胺（GLPs）。 CAMs 使cccDNA 暴露而便于其被降解酶降解， 以阻止cccDNA 的形成，目前推測比現(xiàn)有抗HBV 的NAs 更難出現(xiàn)耐藥[11]。 近期，CAMs 造成核衣殼錯誤組裝的能力也被證明[12]。

1.PPAs 和HAPs

PPAs 和HAPs 是目前被研究較多的CAMs，兩者都結(jié)合在HBV 核心蛋白亞基C-末端附近的二聚體-二聚體界面形成的相同疏水腔上，這導致了大規(guī)模的變構(gòu)構(gòu)象變化，從而破壞了HBV 核心蛋白的穩(wěn)定性并增加了核衣殼的裝配率。

PPAs 可以作為一種分子黏合劑以促進核衣殼組裝速度[13]，因其高速的組裝，不能包裹pgRNA，從而不能形成核衣殼和pgRNA 的復合物，最終導致空衣殼的產(chǎn)生。PPAs 抑制野生類型和拉米夫定耐藥HBV株[化合物AT-61 及其優(yōu)化結(jié)構(gòu)AT-130抑制病毒復制的50%最大效應濃度（EC50）分別是1200 和130 nmol][14]，但是仍然需要臨床試驗證實其作用。 HAPs 能形成異常的、無功能的衣殼顆粒[15]，因為它們干擾了病毒基因組末端的直接相互作用，并改變了核衣殼蛋白二聚體在第4 級水平上的接觸幾何結(jié)構(gòu)。 對HAPs 的不斷優(yōu)化，現(xiàn)已產(chǎn)生了許多有效的類似物， 例如BAY41-4109 （EC50 =50 nmol）和GLS-4（EC50 =12 nmol）。

2.苯甲酰胺（BAs）和SBAs

BAs 是在Blumberg 研究所通過26900 個高通量篩選的結(jié)果而被發(fā)現(xiàn)的化合物。通過對2017年初始BAs 的優(yōu)化，產(chǎn)生了BA-38017（EC50=160 nmol/L），它能抑制HBV 復制，并誘導空衣殼的形成[16]。 此外，2013年首次披露的早期SBAs-DVR-23 ，能抑制DNA 合成之前的病毒復制步驟，以形成類似于PPAs 的空衣殼。 Blumberg 研究所探索了SBAs 支架的環(huán)A 和環(huán)B 上的取代基[17]。幾種化合物對HepDES19 細胞的EC50均低于1 μmol/L。

Emory 大學研究團隊對SBAs 進行進一步優(yōu)化， 分子模型顯示取代氨基的位置處在狹窄的、疏水的、暴露于溶劑的通道中， 該通道不僅與HBV 核衣殼蛋白形成特定的相互作用，并且?guī)讉€小的疏水取代均具有良好的耐受性。 在取代的氨基中，環(huán)烷基團的結(jié)果最好；芐基磺酰胺、氨基酸和二磺酰胺取代的化合物由于空間位阻沖突而效力小；原始苯胺部分與取代芐胺的交換導致活性喪失；N-芳基氨基是一個重要的基團， 顛倒酰胺的NH 和C=O 官能團的位置，N-甲基化和磺?；〈@著降低了活性；同樣，剛性雙環(huán)衍生物也沒有顯示出活性。 然而，顛倒磺酰胺基的NH 和SO2的位置，在很大程度上保留了效力[18]。

Janssen 公司報告了他們研究SBA 的抗HBV 活性，在HepG2.2.15 細胞中EC50 值為59 μmol/L～50 nmol/L[19]，在SBAs中觀察到低代謝穩(wěn)定性（暴露于人肝微粒體15 min 后殘留＜10%）和低溶解性[20]。然而，在環(huán)A 上引入4-氟取代基，在環(huán)B上引入支鏈氨基烷基或四氫呋喃后，增強了代謝穩(wěn)定性。 優(yōu)化后的化合物顯示出中等的血漿清除率，良好的口服生物利用度， 并有望在具有人源化肝臟的基因D 型HBV 感染嵌合小鼠體內(nèi)減少cccDNA。 Janssen 公司還報告了SBAs 的生物學特征， 揭示了它們的化合物具有雙重作用模式， 即干擾HBV 衣殼的組裝和拆卸， 并阻止新生肝細胞獲得病毒遺傳物質(zhì)[21]。

3.SPAs

Janssen 公司的研究還擴展到呋喃、吡咯，吡啶和苯基環(huán)B 的噻吩取代。 在磺胺類藥物中， 鑒定出幾種EC50 值達到32 nmol/L 的強效化合物[22]。 進一步的研究表明，將環(huán)B 轉(zhuǎn)化為吡咯環(huán)比氨磺酰噻吩酰胺的效力提高了10 倍以上， 并建立了一類新型抑制劑， 即SPAs。 除了導致總病毒RNA 和pgRNA 水平下降外，SPAs 還調(diào)節(jié)HBV 生命周期的多個步驟，包括HBeAg 生成[23]。 在2017年，Vendeville 等[24]報道新發(fā)現(xiàn)的環(huán)化SPAs 能維持低納米摩爾抗病毒活性。

4.GLPs

GLPs 能破壞已形成的衣殼， 是最新的一類高效CAMs，由SPAs 中磺酰胺基被乙二醛取代而產(chǎn)生，有報道發(fā)現(xiàn)GLP-26 的EC50 為0.1～0.9 nmol/L[25]。 GLP-26 具有良好的代謝 穩(wěn)定性，在狗和人血漿中半衰期＞24 h，在高脂血癥中的半衰期為7.6 h，GLP-26 和恩替卡韋的雙重聯(lián)合具有很強的協(xié)同抗病毒作用[25]。 Gilead 公司專利申請描述了用2，3-二氫-1H-吡咯嗪和1，1a，6，6a-四氫環(huán)丙烷[b]吡咯烷取代吡咯的探索[26]。這兩個系列均表現(xiàn)出低納米摩爾HBV 抑制作用， 半衰期范圍為4～16 h 不等。 與具有1-甲基取代的3，3-二氟環(huán)丁氮烷環(huán)的結(jié)構(gòu)相比（EC50 = 60～100 nmol/L），引入3，3-二氟環(huán)丁氮烷環(huán)上的1，2，3-三氮唑支鏈導致效價增加5 倍（EC50 =2～4 mmol/L）。

三、新型CAMs

除SBAs、SPAs 和GLPs 外，已出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)新穎的CAMs。Assembly Biosciences 公司提交了新型二氫二苯并 [b，f][3，6]噻嗪-8-羧酰胺的專利申請[27]，該系列在10 μmol/L 處所測得cccDNA 病毒載量的百分比表明其活性良好。此外，Hoffmann-La Roche 公司公布了關(guān)于三環(huán)4-吡啶酮-3-羧酸的專利申請[28]，指出其EC50 值處于中納米摩爾濃度。 Janssen 公司的研究人員目前正在開發(fā)N-苯基羧酰胺衍生物，這些衍生物也具有針對cccDNA 的中納米摩爾到低納米摩爾EC50 值[29]。

四、HBV 核心蛋白突變體對CAMs 的抗性

HBV 核心蛋白及其組裝成核衣殼已成為CAMs 作為抗病毒藥物的重要靶點。 自然產(chǎn)生的T109 突變體已被證明對部分CAMs 具有抗性，Ruan 等[30]發(fā)現(xiàn)T109 突變體（T109M，T109I 和T109S）導致核衣殼穩(wěn)定性變化和對弱CAMs 出現(xiàn)抗性， 通過從微秒長的全原子分子動力學模擬中挖掘數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，可以阻止核衣殼進入CAMs 結(jié)合位點。 Klumpp 等[31]比較NVR010-001-E2 和BAY 41-4109 對HBV 核心蛋白氨基酸變異株與野生型病毒復制的抗病毒活性，發(fā)現(xiàn)含有核心Y118F變異體的HBV 基因組不太容易受到兩種核心抑制劑的抑制。

五、結(jié)語

CAMs 的研究中，SPAs 和GLPs 顯示出良好的活性，但目前所有的細胞培養(yǎng)模型只能產(chǎn)生極低數(shù)量的cccDNA[32]，將來有待進行更好的藥物有效性和安全性研究。 隨著針對核衣殼組裝過程的新型CAMs 的出現(xiàn)，可以證明這些調(diào)節(jié)劑是干擾實際組裝還是干擾核衣殼的自校正過程。 將CAMs 與現(xiàn)有的抗病毒藥物結(jié)合使用， 或許可以形成一種阻斷cccDNA 生成以達到臨床治愈的串聯(lián)機制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突