周莉，白雪 綜述，楊琴 審校

重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶400016

缺血性腦卒中是危害極大的常見神經(jīng)系統(tǒng)疾病。及早恢復血流灌注是其治療的關鍵。但目前公認有效的溶栓、機械取栓等治療方法，由于治療時間窗窄，治療并發(fā)癥嚴重，僅能使5%的患者受益，仍需進一步尋找安全有效的治療方法。

干細胞是一種原始、未分化的細胞，可通過有絲分裂和分化發(fā)展成為多種特化細胞，具有再生多種組織和器官的潛力。干細胞的出現(xiàn)以及干細胞移植技術的發(fā)展，為缺血性腦卒中的治療提供了一條新的途徑。各種類型的干細胞已在動物模型或臨床研究中得到研究，其中，胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）治療面臨倫理問題；神經(jīng)祖細胞（neuralprogenitor cells，NPCs）難以獲取，增殖率低；工程細胞如誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）、人神經(jīng)干細胞（NT2N／hNT）、CTX0E3、SB623等受到技術阻礙［1］。而間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因其可用性高，易于分離培養(yǎng)，免疫耐受性高，治療并發(fā)癥少，不違背社會倫理等特點，已成為治療缺血性腦卒中的首選細胞。本文對MSCs的生物學特性及其在缺血性腦卒中治療中的神經(jīng)保護機制研究進展作一綜述，以期為缺血性腦卒中的治療提供新的方向。

1 MSCs概述

MSCs最早由FRIEDENSTEIN于1970年首次描述為黏附于塑料上的梭形骨髓基質(zhì)細胞。1991年，CAPLAN［2］創(chuàng)造了“間充質(zhì)干細胞”一詞，并預測這些中胚層來源的細胞將成為用于再生目的的自體治療的優(yōu)選方法。經(jīng)最近幾十年的發(fā)展，MSCs已成為研究最廣泛的干細胞群，并廣泛應用于臨床試驗和／或治療各種疾病，包括血液疾病、移植物抗宿主病、自身免疫性疾病，甚至病情嚴重的新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）患者也值得嘗試［3］。

MSCs來源廣泛，包括骨髓、胎盤、輸卵管、脂肪組織、牙髓、唾液腺、下鼻甲、人類母乳等。它們具有附壁性，并可表達間充質(zhì)標記，包括CD90、CD105、CD73等，但不表達CD11b、CD14、CD19、CD34、CD45和人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-DR。不同來源的MSCs其表面標記物、特點和分離數(shù)量受不同供體特征的限制，如脂肪組織MSCs（adipose tissue-MSCs，ADMSCs）能表達CD49d，并能比骨髓來源MSCs（bone-MSCs，BMSCs）產(chǎn)生更多的肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），且1 g脂肪組織所獲得的細胞數(shù)量可能是相同重量骨髓的500倍，但ADMSCs可促進已有癌細胞的增殖，尤其是乳腺癌［4］。

MSCs具有自我更新和多態(tài)分化的能力，在一定條件下可分化為中胚層（脂肪、骨和軟骨）、內(nèi)胚層（平滑肌）和外胚層（神經(jīng)元）細胞，從而促進對各種受損組織的修復。神經(jīng)新生、血管新生和突觸可塑性對腦卒中后功能恢復至關重要，由于MSCs具有可塑性、多向分化、免疫調(diào)節(jié)和抗炎以及神經(jīng)血管發(fā)生等特點，具有參與腦再生的潛力，可促進缺血性腦卒中后的組織修復。

2 MSCs移植治療缺血性腦卒中的動物實驗研究

自1998年AZIZI等［5］發(fā)表了第一篇關于人BMSCs移植入大鼠腦的報道以來，MSCs移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究越來越多。在缺血模型的臨床前研究中，研究人員通過立體定向移植、血管內(nèi)移植、鼻內(nèi)移植等多種途徑將MSCs移植入腦內(nèi)。

2.1 立體定位移植技術 首先，研究者關注的是立體定位移植技術，也稱為顱內(nèi)技術，該技術將MSCs精確地移植至顱內(nèi)選定的位置，不經(jīng)過全身代謝周期，更多的MSCs可到達腦損傷的靶部位，是最早用于實驗的移植手段。ZHAO等［6］率先進行的BMSCs顱內(nèi)移植研究顯示，BMSCs向腦梗死區(qū)遷移，并能在宿主腦內(nèi)存活并分化為成熟神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞，促進功能的恢復。在一項類似的研究中，大腦中動脈梗塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）后，通過2次注射將人類臍帶MSCs（human umbilical cord-MSCs，HUMSCs）移植至大鼠的腦梗死皮層中，增強了神經(jīng)元的代謝活性，促進了腦梗死皮層的修復，刺激了腦梗死皮層中的血管生成，改善了大鼠缺血性腦卒中后的功能［7］。此外，BMSCs的腦內(nèi)移植可調(diào)節(jié)與腦缺血相關的免疫反應。產(chǎn)生的轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGFβ）等因子抑制了單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）的分泌，限制了CD68+細胞向受損組織浸潤。AMINI等［8］將人脂肪來源干細胞（human adipose tissue-derived stem cells，hADSCs）注射至蛛網(wǎng)膜下腔中，也證明了hADSCs的安全性及改善卒中后功能恢復的能力。這些研究促進了MSCs在小鼠缺血性腦卒中模型中的應用。但由于立體定位手術的侵入性和復雜性較高，對大多數(shù)臨床患者來說應用較為困難，可能導致創(chuàng)傷性或插入性腦水腫，甚至空氣栓塞，因此，需優(yōu)化該移植技術。

2.2 血管內(nèi)移植 由于立體定位移植技術的侵襲性和復雜性，研究人員發(fā)現(xiàn)［9-10］，血管內(nèi)移植技術，包括靜脈（intra-vein，IV移植）、動脈（intra-arterial，IA移植），可使MSCs遷移至破壞區(qū)域，促進神經(jīng)發(fā)生和血管形成及軸突的芽生和再髓鞘化，也可減輕小膠質(zhì)細胞／巨噬細胞對缺血腦組織的浸潤，并在腦缺血區(qū)發(fā)揮抗膠質(zhì)增生、抗凋亡、促增殖的作用，顯著改善腦卒中大鼠的行為表現(xiàn)。IV簡單安全，可行性高，可重復操作，患者易接受，不良反應小。此外，這種路徑移植的MSCs將優(yōu)先遷移至脾臟，消除系統(tǒng)性炎癥引起的繼發(fā)性細胞死亡。但IV后的“首過效應”使移植的MSCs分布在肝、肺、脾、腎、骨髓、胸腺，甚至皮膚和腫瘤中，只有少數(shù)的MSCs到達病變位置［11］，因此，這種方法需要大量的細胞植入患者體內(nèi)，可能會增加潛在的副作用和治療成本。隨著基于腦卒中后導管干預治療（如機械取栓和對缺血半暗帶的導管介導溶栓）的不斷增加，可能IA在特定情況下是理想的，尤其是大動脈閉塞性腦卒中。IA移植率高，不經(jīng)其他器官直接快速到達腦皮層及病變外圍，能較快地改善動物神經(jīng)功能［12］。但IA可能形成微栓子而引起新的梗死，通過低劑量動脈內(nèi)細胞給藥可預防栓塞并發(fā)癥，并誘導功能恢復，但最佳劑量和效果尚需進一步探索。

2.3 其他移植方式 此外，鼻內(nèi)移植作為一種簡單、方便、無創(chuàng)的移植方法，能繞過血腦屏障（blood-brain barrier，BBB），在給藥后30 min內(nèi)到達腦額部，3 h后分布于全腦。WEI等［13］首次提供了鼻內(nèi)細胞給藥治療缺血性腦卒中的信息，缺氧的BMSCs通過上調(diào)一些遷移相關蛋白，包括基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloprotease-2，MMP-2）、MMP-9和基質(zhì)細胞衍生因子-1（stromal derived factor-1，SDF-1）受體CXCR4的表達水平，增加BMSCs向缺血區(qū)域的歸巢，降低缺血性腦卒中后細胞死亡和腦梗死體積。此外，腦卒中后鼻內(nèi)BMSCs移植可顯著減少BBB破壞，促進血管新生、神經(jīng)新生和神經(jīng)血管修復，改善局部腦缺血皮質(zhì)血流量，促進腦功能恢復，有效降低長期的功能損害［14］。這些均證明了該方法的可行性和有效性，是一種有效的微創(chuàng)給藥方式。

除此之外，研究還表明，對MSCs進行預處理，如缺氧、可溶性因子轉導等可提高MSCs的治療效果。目前，由于EVs（活細胞釋放的一組直徑30～300 nm的膜性結構）體積小，且能跨越血腦屏障，無血管阻塞的風險，常用于腦卒中模型的系統(tǒng)移植。應用MSC-EVs后，可觀察到對周圍免疫反應的長期神經(jīng)保護和調(diào)節(jié)，減少腦損傷，恢復缺血后受損的神經(jīng)功能［15］。其可能是一種很有前前景的治療方法，但其回避了細胞替代的想法，而且缺乏標準的操作程序。在進行人體試驗前，需在未來的動物模型研究中對基于MSC-EVs的治療方法的有效性和安全性進行批判性評估。

3 MSCs移植治療缺血性腦卒中的臨床研究

臨床前證據(jù)的不斷積累促進了MSCs移植治療的臨床進展，并取得了一定的治療效果。神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床治療可追溯至2002年［16］，當異體BMSCs應用于曾接受過造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs）治療的異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良（metachromatic leukodystrophy，MLD）患者時，6例MLD患者中有4例改善了神經(jīng)系統(tǒng)功能，且無論劑量大小，均無任何重大副作用。此后，MSCs在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的臨床應用越來越廣泛，目前，研究者采用了多種方法（IV、經(jīng)動脈導管移植、鞘內(nèi)注射）將MSCs應用于缺血性腦卒中患者，并重點關注MSCs治療缺血性腦卒中的安全性、可行性和短期療效。

2005年，BANG等［17］進行了第一次隨機對照臨床試驗，以評估IV自體BMSCs對大腦中動脈梗死患者的影響。30名30～75歲受試者（BMSCs組5名，對照組25名）在卒中后7 d內(nèi)隨機靜脈注入1×108個BMSCs，與安慰劑相比，隨訪1年未報告任何與移植相關的不良事件，提示IV自體BMSCs對于嚴重腦梗死患者可能是一種可行的、安全的治療方法，可改善功能恢復。2010年，LEE等［18］對52例30～75歲的腦梗死患者進行了病例對照研究（BMSCs組16例，對照組36例），IV（分2次）自體BMSCs 5×107個并隨訪5年，結果表明，患者的死亡率明顯低于對照組，且無明顯副作用或其他新的并發(fā)癥，提示了其安全性和有效性，但作者也提出，這取決于患者的具體特征，如血漿SDF-1a水平和側腦室室下區(qū)域受累程度。2013年，孫世超等［19］在35例中風后遺癥患者中（MSCs組20例，對照組15例）IV自體100 mL BMSCs混懸液，隨訪3個月，治療組中觀察到了感覺、運動功能方面的改善，對照組無明顯改善。一項單中心、開放標簽的RCT研究納入了31例年齡在18～70歲的中重度（NIHSS≥10分）缺血性頸動脈卒中后不到2周的患者，隨機2∶1的患者接受靜脈（1～3）×108個BMSCs（n=20）或不接受（n=11），并隨訪2年，發(fā)現(xiàn)靜脈移植MSCs治療中度到重度中風是安全、可行的［20］。這些報道顯示，臨床輸注MSCs治療腦卒中是安全有效的。

2012年，JIANG等［21］首次經(jīng)動脈導管移植2×107個UCMSCs至大腦中動脈梗死或出血的周圍區(qū)域（3例腦梗死，1例腦出血），隨訪6個月，發(fā)現(xiàn)3例腦梗死患者中有2例肌力改善，且未觀察到不良事件。

2013年，王利平等［22］報道了160例腦梗死患者經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔移植160～200 mL自體BMSCs，移植后NIHSS評分較前降低0～8分，生活功能評分較前提高0～15分，且未觀察到其他不良反應。2018年，DENG等［23］納入了108例發(fā)病30～90 d的嚴重腦梗死（NIHSS評分15～25分）患者，隨機分為實驗組（n=59）和對照組（n=59），每周4次鞘內(nèi)注射異體BMSCs（1×106個／kg），所有患者在細胞輸注前及輸注后每隔1年進行1次詳細的功能評估和磁共振成像，評估其安全性和有效性，目前正在進行Ⅱ期實驗。

現(xiàn)有的臨床研究結果為MSCs治療的安全性和可行性提供了依據(jù)，但考慮到患者群體、細胞來源、給藥時間和給藥方式的差異，以及小樣本、缺乏隨機化和雙盲對照限制了這些結果的解釋，因此，MSCs移植治療對腦卒中患者的安全性和有效性仍存在一些不確定性，需要更高質(zhì)量的隨機臨床試驗，以為闡明安全性和療效性提供更可靠的依據(jù)。

4 MSCs移植治療缺血性腦卒中的機制

MSCs具有多種修復受損腦組織的機制，但其具體的修復作用尚未完全闡明。目前，MSCs移植治療缺血性腦卒中的一般機制主要包括細胞替代、神經(jīng)回路的重建、血管生成、分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、免疫調(diào)節(jié)、促進細胞存活。但這些機制不是單一的過程，而是相互重疊，共同作用促進缺血腦組織修復。

4.1 細胞替代，重建神經(jīng)回路 體內(nèi)外研究均表明，MSCs具有多能性，可分化為內(nèi)、中、外胚層系細胞，包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞等。這些成熟的細胞能夠融合并替代受損細胞、構成神經(jīng)血管單元，維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，并最終減少腦卒中后的神經(jīng)功能缺陷。在大鼠缺血1周后，將純化的人BMSCs移植至腦梗死周圍皮層，可顯著改善腦功能，且移植的人BMSCs表達星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的標記物，并建立移植物和宿主軸突之間的連接。其次，在成人側腦室的室下區(qū)和海馬齒狀回的粒下區(qū)含有神經(jīng)前體細胞，腦缺血后，這些神經(jīng)前體細胞可從神經(jīng)源生態(tài)位遷移至損傷區(qū)域，但因細胞數(shù)量太少，不足以對卒中后的功能恢復產(chǎn)生顯著影響。MSCs能保護內(nèi)源性神經(jīng)前體細胞免受損傷，促進其增殖、遷移和分化，減輕腦組織損傷。MSCs移植至MCAO大鼠后，可觀察到病灶區(qū)神經(jīng)前體細胞陽性細胞逐漸增加，同時增加了缺血半球的少突膠質(zhì)細胞前體細胞數(shù)量，促進再髓鞘化和軸突芽生［24］。因此，移植的細胞可分化為功能性細胞，用于卒中的替代治療，介導梗死區(qū)和梗死周圍區(qū)的神經(jīng)回路重建，促進神經(jīng)功能的恢復。

4.2 分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子MSCs可通過產(chǎn)生和分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，包括腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）、HGF、VEGF、血管生成素-1（angiotensin-1，Ang-1）、人胰島素-生長因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）及堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）等，通過多種途徑協(xié)同或平行地直接或間接促進缺血性腦組織的修復和恢復。如BDNF可參與抑制興奮性毒性、減少神經(jīng)元凋亡、保護神經(jīng)元線粒體功能、增強突觸活性和內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生［25］；VEGF可促進星形膠質(zhì)細胞向成熟神經(jīng)元的轉分化，刺激血管內(nèi)皮細胞的遷移和增殖，重建血管，改善長距離軸突可塑性，降低MMP-9活性，抑制細胞凋亡，最終改善神經(jīng)功能［26］；GDNF則有助于促進血管生成和神經(jīng)發(fā)生，減少腦水腫，抑制細胞自噬和凋亡，減少梗死體積和修復學習記憶功能［27］。這些眾多的生物效應分子將為MSCs通過多種途徑在神經(jīng)保護方面的作用提供有價值的認識，如抗炎、抗凋亡、抑制纖維化、促進血管生成及神經(jīng)保護和發(fā)生、免疫調(diào)節(jié)等功能。

4.3 血管生成 血管形成或血管化在介導卒中后梗死區(qū)和周圍半暗帶神經(jīng)元的存活和再生中發(fā)揮關鍵作用。MSCs可通過分泌促血管生成因子，分化為內(nèi)皮細胞和／或血管平滑肌細胞，并作為血管周細胞參與側支重構。

首先，MSCs分泌可溶性血管生成因子，這是其在新生血管形成中發(fā)揮作用的主要機制。此外，各種可溶性生長因子和蛋白質(zhì)可放大它們的血管生成和動脈生成潛能。血管生成因子包括直接（VEGF、bFGF、HGF、Ang-1）和間接（TGF-β、IL-3、IL-6、IL-8）促血管生成因子，如缺血小鼠腦內(nèi)移植VEGF-MSCs可增加微血管密度，增強MSCs存活，改善行為功能［26］；Ang-1參與血管的成熟、穩(wěn)定和重構，可促進大腦血管新生，防止血管系統(tǒng)中泄漏，該作用有助于腦缺血后的抗水腫作用；與hMSC或Ang-hMSCs相比，Ang-VEGF-hMSCs對病變體積的影響更大，可促進局部小塊新生血管形成，使新生血管形成最大，功能恢復；IL-6增加ECs的存活，IL-3刺激VEGF基因表達及SMCs遷移和增殖［28］。其次，MSCs也表現(xiàn)出內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞分化的趨勢，并表達相關細胞標志物，同時保護內(nèi)皮細胞和內(nèi)皮祖細胞免受損傷，促進卒中后血管生成［29］。同時，移植的MSCs與血管周圍的周細胞有許多相似之處，常阻滯在血管區(qū)域，以類似周細胞的方式穩(wěn)定血管形成，這些作用共同促進了MSCs移植對卒中后血管重建的作用，從而改善缺血性腦卒中的功能預后。

4.4 免疫調(diào)節(jié) 體內(nèi)、外研究表明，MSCs可通過與先天性和適應性的免疫細胞相互作用，同時調(diào)節(jié)系統(tǒng)免疫反應，幫助修復受損腦組織。MSCs可抑制M1型小膠質(zhì)細胞／巨噬細胞的激活，減少促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-1、促氧化酶和趨化因子的釋放，促進保護性M2型小膠質(zhì)細胞／巨噬細胞分化，減少中性粒細胞的過度浸潤，抑制自然殺傷（natural killer cell，NK）細胞的細胞毒性，抑制CD14+單核細胞和CD34+祖細胞向樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）的分化和成熟，并使成熟的DCs向未成熟狀態(tài)傾斜，促進調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Tregs）的分化和增殖，抑制CD8+T細胞介導的靶細胞裂解，調(diào)節(jié)B細胞增殖、趨化作用和免疫球蛋白（IgM、IgG和IgA）的產(chǎn)生［30］。同時，MSCs可降低外周免疫抑制，減弱炎癥反應，降低全身感染的發(fā)生率，并可能形成先天免疫類記憶反應，從而對急性炎癥提供長期的持續(xù)保護［31］。利用其免疫調(diào)節(jié)作用可能有助于減少腦缺血后腦組織損傷和促進腦修復，但仍需大量臨床前和臨床試驗進一步證實。

4.5 促進細胞的存活 缺血性腦卒中會誘導細胞的自噬、凋亡、壞死，有研究表明，MSCs可調(diào)節(jié)缺血性腦卒中后細胞死亡，促進細胞存活，減少神經(jīng)功能損傷。

首先，MSCs的移植能夠通過早期（缺血后24 h內(nèi)）增加自噬，晚期（缺血后48～72 h）抑制自噬，促進受損細胞的存活。在卒中后早期，MSCs通過分泌BDNF，減少mTOR通路的激活，促進自噬標志物Beclin-1和微管相關蛋白LC3的表達，增強神經(jīng)元自噬，抑制神經(jīng)元凋亡，最終改善腦缺血損傷的恢復［32］。但持續(xù)48～72 h或更長時間的缺氧和葡萄糖缺乏會導致過度的自噬，在該時期，MSCs移植可降低Beclin-1和LC3的表達，促進神經(jīng)突生長和再生，抑制自噬，保護神經(jīng)元。在MCAO大鼠模型中，尾靜脈注射ADMSCs可通過誘導抗凋亡因子Bcl-2的激活，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和促凋亡分子Bax的活性，從而減少缺血腦組織的凋亡［33］。MSCs還可引起MMPs功能障礙，并阻止其上調(diào)，抑制caspase-3等細胞死亡信號，激活STAT3和Akt磷酸化等細胞存活信號通路。最近還發(fā)現(xiàn)，MSCs可通過將自身的線粒體轉移至神經(jīng)元中，增加神經(jīng)元活動和改善代謝功能，挽救受損神經(jīng)元［34］。

5 結論

綜上所述，動物和臨床研究均廣泛證實了MSCs移植在治療缺血性腦卒中的作用，其機制復雜且相互作用。但由于患者病情和生理條件不同，在臨床應用前仍有許多關鍵問題需解決，如最佳細胞來源、劑量、移植時間窗和途徑、不良事件監(jiān)測和處理等。因此，更好地了解MSCs治療中風的機制，將有助于解決上述問題。總之，MSCs可作為中風治療的候選新的治療途徑，以改善缺血性腦卒中患者的神經(jīng)功能、生存和生活質(zhì)量。