高林曉 ,石慧麗 ,文冬冬 ,郭 蒙 ,楊再波 ,鄒洪濤

(1.黔南民族師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,都勻 558000;2.貴州省普通高校民族藥用植物資源開發(fā)工程研究中心,都勻 558000;3.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京 100015)

刺三加為五加科五加屬植物,主要分布于我國(guó)的華南、西南等地區(qū),其根、莖、葉、帶葉嫩枝等均可入藥,在亞洲東南亞地區(qū)甚至把刺三加作為與人參等同價(jià)值的藥物使用。已有一些針對(duì)刺三加的化學(xué)成分、提取工藝、藥理毒理活性等的綜述報(bào)道[1-6]。

近來(lái),關(guān)于刺三加的研究仍然受到國(guó)內(nèi)學(xué)者的持續(xù)關(guān)注。文獻(xiàn)[7]用鐵氰化鉀紫外-可見分光光度法測(cè)定了刺三加葉中多酚的含量,并進(jìn)一步研究了其根、莖、葉等部分的總多酚的提取[8-9];文獻(xiàn)[10]研究了5個(gè)刺三加品種嫩枝葉中的總多酚含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)青梗品種中總多酚含量最高,并與體外抗氧化顯著相關(guān);文獻(xiàn)[11]比較了5種型號(hào)的大孔樹脂對(duì)刺三加葉提取液中總多酚的吸附和解吸性能,發(fā)現(xiàn)純化多酚的最佳樹脂為HPD-100樹脂,純化后總多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定值可增大3.25倍;文獻(xiàn)[12]對(duì)刺三加醇提物進(jìn)行不同溶劑萃取,結(jié)果表明,乙酸乙酯萃取效果最好,但石油醚層的物質(zhì)抑菌活性最佳,且與黃酮含量間存在非簡(jiǎn)單正比的相關(guān)性。此外,文獻(xiàn)[13]進(jìn)一步研究了刺三加醇提物的乙酸乙酯層物質(zhì)在體外或體內(nèi)抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),預(yù)測(cè)提取物是預(yù)防和治療急性肺損傷的潛在新型藥物;文獻(xiàn)[14]利用刺三加葉片和陳皮等通過成型工藝制備成膠囊,結(jié)果表明,其生產(chǎn)過程中,需要控制相對(duì)濕度小于81%;文獻(xiàn)[15]用水提醇沉法提取了刺三加全草的多糖,并對(duì)其添加交聯(lián)聚維酮等制備成分散片,多糖溶出率高達(dá)85%;而文獻(xiàn)[16-18]進(jìn)一步純化了刺三加莖的多糖,得到以葡萄糖為主的一種中性均一的白簕多糖ATP-1,結(jié)果發(fā)現(xiàn),其不僅展現(xiàn)出良好量效關(guān)系的抗氧化性,而且還可以有效降低糖尿病小鼠的血糖、修復(fù)受損的糖代謝;文獻(xiàn)[19-20]用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定了刺三加葉中綠原酸、根與莖中沒食子酸的含量;文獻(xiàn)[21]用高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)對(duì)刺三加中貝殼杉烯酸的含量進(jìn)行了測(cè)定。

刺三加具有調(diào)節(jié)胃腸道功能,預(yù)防便秘、腸癌等療效[22]。這是因?yàn)樗缓S酮類、酚酸類等抗氧化劑,其中,蘆丁在促進(jìn)血液循環(huán)、降血脂、防治高血壓、抗氧化等方面有顯著療效[2],以抗氧化活性為基礎(chǔ),所開發(fā)研制的白簕茶也已進(jìn)入我們生活,由于其對(duì)強(qiáng)身健體和抗老化有顯著作用而得到廣泛推廣[23]。已報(bào)道的蘆丁含量測(cè)定方法有HPLC[24-25]、毛細(xì)管電泳法(CE)[6]、電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法(ECL)[26]和流動(dòng)注射液滴熒光檢測(cè)法(FILDS)[27]等。雖已有HPLC同時(shí)測(cè)定植物中蘆丁、沒食子酸等含量的報(bào)道[28-29],但尚未見HPLC同時(shí)測(cè)定刺三加葉中二者含量的報(bào)道。因此,本工作對(duì)來(lái)自不同產(chǎn)地的刺三加葉中蘆丁和沒食子酸進(jìn)行了提取,然后用HPLC同時(shí)測(cè)定二者含量,以期為建立刺三加的標(biāo)準(zhǔn)方法和進(jìn)一步深入地研究刺三加的藥用價(jià)值提供數(shù)據(jù)支撐。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀;TU-1901 型紫外可見分光光度計(jì);DL-360D 型智能超聲波清洗器。

對(duì)照品儲(chǔ)備溶液:稱取蘆丁和沒食子酸0.011 0 g和0.021 6 g,加入適量60%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙醇溶液溶解,以水定容至100 mL 容量瓶中,保存?zhèn)溆谩?/p>

對(duì)照品溶液:移取上述5.00 mL 蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備溶液和1.40 mL 沒食子酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液,分別置于100 mL容量瓶中,以水定容,得到5.50 mg·L-1蘆丁和3.02 mg·L-1沒食子酸對(duì)照品溶液。

蘆丁、沒食子酸、甲醇和乙腈均為色譜純;其他試劑均為分析純;試驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

刺三加葉采自廣東恩平和貴州都勻。

1.2 色譜條件

ZORBAXSB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流動(dòng)相為CH3OH-H2O-CH3COOH(體積比為44∶55.6∶0.4)溶液;蘆丁和沒食子酸檢測(cè)波長(zhǎng)分別為260,272 nm;流量1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量10μL;柱溫25 ℃。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取過孔徑0.425 mm(40目)篩的刺三加葉樣品25.00 g置于錐形瓶中,加入250 mL 沸水浸泡,靜置5 min,冷卻后過濾,上述操作重復(fù)1次,收集濾渣。濾渣中加石油醚100 mL 繼續(xù)浸泡,靜置3 h,重復(fù)4～5次,此時(shí)石油醚層接近無(wú)色,抽濾,收集濾渣作為試驗(yàn)用樣品[30]。

稱取2.00 g上述濾渣樣品,置于錐形瓶中,加入60%乙醇溶液100 mL,密塞,稱重,于100 W 功率下超聲提取30 min,冷卻到室溫。重復(fù)操作1次,再加入60%乙醇溶液補(bǔ)足質(zhì)量減少量,用0.45μm濾膜過濾提取液,濾液為供試液,按色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取一定量的蘆丁和沒食子酸的對(duì)照品溶液,分別在波長(zhǎng)200～400 nm 處進(jìn)行紫外吸收光譜掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn):蘆丁在260,354 nm 處,沒食子酸在215,272 nm 處均有吸收峰;而260 nm 處的蘆丁吸收峰、272 nm 處的沒食子酸吸收峰基線平穩(wěn),峰形對(duì)稱性好,雜質(zhì)峰的干擾少。故試驗(yàn)選擇260 nm、272 nm分別作為蘆丁和沒食子酸的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 提取方法的選擇

試驗(yàn)測(cè)定前需對(duì)刺三加葉進(jìn)行脫脂和脫色處理。查閱資料,煮沸浸提可破壞部分細(xì)胞膜,除去一些葉綠素,但由于葉綠素是脂溶性色素,采用有機(jī)溶劑浸漬技術(shù)更有利于其提取,故試驗(yàn)先采用水粗提法,然后再用石油醚對(duì)其進(jìn)行脫脂、脫色。

試驗(yàn)對(duì)水、甲醇和乙醇等溶劑作提取溶劑的提取效率進(jìn)行了對(duì)比,結(jié)果發(fā)現(xiàn):以水作為提取溶劑時(shí),樣品有效成分的提取率較低,且雜峰較多;以甲醇或乙醇作為提取溶劑時(shí),兩者提取的有效成分的含量無(wú)差別、雜質(zhì)峰均較少,但考慮到前者具有較強(qiáng)的毒性,最終選擇乙醇作為提取溶劑。試驗(yàn)結(jié)果表明:在60%乙醇溶液作提取溶劑、用量為100 mL、超聲提取30 min 的條件下,目標(biāo)組分提取效果最佳。

2.3 色譜條件的選擇

分別首先考察了蘆丁和沒食子酸在CH3OHH2O、CH3OH-H2O-CH3COOH (或 H3PO4)、CH3CN-H2O、CH3CN-H2O-CH3COOH (或H3PO4)等流動(dòng)相體系中的色譜保留行為[31-33],結(jié)果表明:以體積比為44∶55.6∶0.4 的CH3OHH2O-CH3COOH 溶液為流動(dòng)相時(shí),目標(biāo)組分分離效果最佳,色譜峰峰形對(duì)稱性好、背景噪聲干擾小、重現(xiàn)性好。此外,還考察了柱溫(20,25,30,35 ℃)和流量(0.6,0.8,1.0 mL·min-1)等因素對(duì)兩種目標(biāo)組分的分離效果的影響,結(jié)果表明:在柱溫為25 ℃、流量為1.0 mL·min-1時(shí),目標(biāo)組分的色譜峰峰形具有良好的對(duì)稱性,理論塔板數(shù)相對(duì)也較高。

2.4 專屬性試驗(yàn)

分別取經(jīng)0.45μm 濾膜過濾的60%乙醇溶液空白、對(duì)照品溶液和供試液,在色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,所得HPLC譜圖見圖1。

圖1 HPLC譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

由圖1 可見:蘆丁和沒食子酸的分離度大于1.5,根據(jù)所得二者的色譜峰計(jì)算理論塔板數(shù)大于2 000,說(shuō)明該方法分離效果良好,且其他成分無(wú)干擾。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測(cè)定下限

移取10.0 mL蘆丁和2.4 mL 沒食子酸的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液,分別置于100 mL 容量瓶中,以水定容,作為線性儲(chǔ)備溶液。分別移取0.50,1.00,2.00,4.00,6.00,8.00,10.0 mL 的蘆丁、沒食子酸線性儲(chǔ)備溶液置于10 mL 容量瓶中,以水稀釋配制蘆丁、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,按色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以蘆丁和沒食子酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果表明:蘆丁和沒食子酸的線性范圍分別為0.55～11.00 mg·L-1和0.26～5.18 mg·L-1;線性回歸方程分別為y蘆?。?7.54x蘆丁＋0.264 0 和y沒食子酸＝27.51x沒食子酸-2.683;相關(guān)系數(shù)分別為0.999 9,0.999 0。

根據(jù)3倍信噪比(S/N)計(jì)算方法的檢出限,蘆丁和沒食子酸的檢出限(3S/N)分別為0.04,0.03 mg·L-1;根據(jù)10 倍信噪比計(jì)算方法的測(cè)定下限,蘆丁和沒食子酸的測(cè)定下限(10S/N)分別為0.11,0.08 mg·L-1。

2.6 精密度和重復(fù)性試驗(yàn)

取適量蘆丁、沒食子酸對(duì)照品溶液,按色譜條件依次進(jìn)樣6次進(jìn)行測(cè)定,記錄測(cè)得的峰面積,并計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.1 Results of test for precision(n＝6)

由表1可見:蘆丁和沒食子酸的色譜峰峰面積的RSD 分別為0.25%和1.2%,說(shuō)明儀器的精密度良好。

分別移取6份1.00 mL的蘆丁和6份0.50 mL的沒食子酸供試液于10 mL 容量瓶中,用水定容,按色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明:蘆丁和沒食子酸的色譜峰峰面積的RSD 分別為1.6%和0.69%,這表明試驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

移取1.00 mL供試液置于10 mL容量瓶中,用水定容,按色譜條件測(cè)定室溫下放置不同時(shí)間后蘆丁和沒食子酸的色譜峰峰面積,結(jié)果見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.2 Results of test for stability(n＝6)

由表2可見,放置24 h,蘆丁和沒食子酸的色譜峰峰面積的RSD 僅為0.54%和0.98%。這表明測(cè)定時(shí)間內(nèi),供試液穩(wěn)定。

2.8 回收試驗(yàn)

分別移取6份0.80 mL和6份0.35 mL的供試液,至容量瓶,分別加入0.50 mL 蘆丁和0.12 mL沒食子酸對(duì)照品溶液(對(duì)照品的加入量相當(dāng)于樣品中各自待測(cè)成分含量的100%水平),用水定容,按色譜條件測(cè)定,進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),結(jié)果見表3。

由表3可見:蘆丁和沒食子酸的平均回收率分別為99.7% 和99.4%,RSD 分別為0.81% 和0.97%。

2.9 樣品分析

分別稱取3批采自廣東恩平和貴州都勻的刺三加葉樣品各25.00 g,按試驗(yàn)方法進(jìn)行處理,所得供試液按色譜條件進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)樣品平行測(cè)定5次,結(jié)果見表4。

表3 回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.3 Results of test for recovery(n＝6)

表4 不同產(chǎn)地樣品中蘆丁和沒食子酸含量的測(cè)定結(jié)果(n＝5)Tab.4 Determination results of rutin and gallic acid in samples from the different habitats(n＝5)

由表4可知:采自廣東恩平的刺三加葉中蘆丁的含量高于貴州都勻的,而采自貴州都勻的刺三加葉中沒食子酸的含量高于廣東恩平的。

本工作采用HPLC 同時(shí)測(cè)定了來(lái)自不同產(chǎn)地的刺三加葉中蘆丁和沒食子酸的含量,方法操作具有簡(jiǎn)便、易行的優(yōu)點(diǎn),且方法學(xué)驗(yàn)證符合要求,方法彌補(bǔ)了刺三加葉中有效成分含量測(cè)定研究的空白,可為建立刺三加葉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),深入研究刺三加樣品中其他部位的蘆丁和沒食子酸的含量提供數(shù)據(jù)支持。