劉兆祿，潘超 綜述，朱力，王恒樑， 審校

1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所，北京100071

百日咳是由百日咳博德特菌引起的細(xì)菌性呼吸系統(tǒng)疾病，其他博德特菌菌種，如副百日咳博德特菌、支氣管敗血癥桿菌和霍爾姆斯桿菌，也會引起相似的持續(xù)不斷地咳嗽癥狀［1］。該病多發(fā)于兒童及嬰幼兒，特別是6 個(gè)月以下的嬰兒。目前，百日咳仍是兒童死亡的主要病因之一［2］。

為提高對新生兒的保護(hù)效果，美國免疫咨詢委員會（Advisory Committee on Immunization Practices，ACIP）建議孕婦在孕27 ～ 36 周時(shí)接種無細(xì)胞百白破三聯(lián)疫苗（tetanus，diphtheria toxoids and acellular pertussis vaccine，Tdap）［3］。母體免疫球蛋白在妊娠約30 周后可通過胎盤主動轉(zhuǎn)移至胎兒，理論上，胎兒能夠通過該機(jī)制獲得足夠高的抗體水平，出生后可得到保護(hù)［4］，但母體中高水平百日咳抗體經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)移至胎兒可致嬰兒在初次接種百日咳疫苗時(shí)免疫應(yīng)答減弱，也稱為“鈍化”［5］。因此，需進(jìn)一步評估孕婦免疫Tdap 疫苗后嬰兒對全細(xì)胞百日咳疫苗的免疫應(yīng)答。

目前使用的百日咳疫苗有兩種，即全細(xì)胞疫苗（whole-cell pertussis vaccine，wP）和無細(xì)胞疫苗（acellular pertussis vaccine，aP）［6］。20 世紀(jì)中期，人類首次報(bào)道了可通過接種wP 來控制百日咳的發(fā)病率。wP 是由滅活的百日咳博德特菌組成，并與白喉和破傷風(fēng)毒素疫苗聯(lián)合為百白破三聯(lián)疫苗（diphtheria，tetanus and whole-cell pertussis combined vaccine，DTwP），臨床試驗(yàn)表明，DTwP 對百日咳發(fā)病率的控制非常有效［7］。接種DTwP 的人群雖降低了患百日咳的風(fēng)險(xiǎn)，但會伴有引發(fā)腦損傷或神經(jīng)系統(tǒng)疾病等嚴(yán)重副作用。20 世紀(jì)70 年代中期，日本研發(fā)出由純化百日咳毒素（pertussis toxin，PTX）、絲狀血凝素（filamentous haemagglutinin，F(xiàn)HA）和百日咳黏著素（pertactin，PRN）及兩種鞭毛蛋白（fimbriae types 2 and 3，F(xiàn)im2 and Fim3）為抗原組成的新一代aP 疫苗。這種亞單位疫苗避免了wP 疫苗帶來的安全隱患，還能誘導(dǎo)有效的保護(hù)性免疫應(yīng)答，對預(yù)防和控制百日咳發(fā)病產(chǎn)生了重要影響。aP 疫苗在全球覆蓋率越來越高，但許多國家的百日咳發(fā)病率在20 世紀(jì)90 年代卻出現(xiàn)了明顯反彈［8］。有研究表明，aP 疫苗在狒狒感染模型中不能預(yù)防百日咳博德特菌在呼吸道定植，不能改善其傳播風(fēng)險(xiǎn)［9］。另外，近年歐美國家出現(xiàn)了ptxP3 系的菌株，其比ptxP1 株具有更高水平的PTX［10］，aP 疫苗對這些新菌株的保護(hù)效率可能降低。近20 年中，百日咳的流行病學(xué)特征發(fā)生了較大變化［11］，許多發(fā)展中國家發(fā)生了幾次重大疫情，在疫苗接種率較高的發(fā)達(dá)國家也出現(xiàn)了類似情況［12］。因此，開發(fā)具有長效免疫能力和可對不同基因型菌株產(chǎn)生保護(hù)的新型百日咳疫苗尤為重要。

百日咳博德特菌的外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMVs）是該菌表面分泌的一種具有球形雙層膜、天然非復(fù)制性的囊泡結(jié)構(gòu)［13］，在百日咳細(xì)菌生長、生存和毒力等生理活動中發(fā)揮重要作用，有研究證明，基于OMVs 的疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答比具有Th1 ／ Th17 和Th2 細(xì)胞譜的aP 疫苗更強(qiáng)大，可產(chǎn)生長期保護(hù)作用［14］，具有廣泛的應(yīng)用前景。因此，本文對OMVs 的研究現(xiàn)狀及其作為新型替代疫苗的可能性作一綜述。

1 OMVs 的生物學(xué)作用

百日咳博德特菌OMVs 直徑一般在20～250 nm范圍內(nèi)，但某些情況下會變成不規(guī)則形狀，直徑最高范圍也能增加至500 nm［15］。OMVs 可協(xié)助生物膜的形成，生物膜是由外多糖、DNA、蛋白質(zhì)和許多其他分子基質(zhì)組成的表面黏附結(jié)構(gòu)。FULSUNDAR 等［16］證實(shí)，細(xì)菌在應(yīng)激期間釋放的OMVs 明顯增加，表明OMVs 與生物膜的形成相關(guān)。OMVs 通過參與細(xì)胞的共聚集，為胞外多糖、DNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)及細(xì)菌細(xì)胞的相互作用提供了平臺，為病原體創(chuàng)造一個(gè)適合宿主生存的微環(huán)境；其次，OMVs 能夠在細(xì)胞間遞送生物分子，保護(hù)胞內(nèi)的運(yùn)輸分子免受外部環(huán)境稀釋和降解。有研究表明，OMVs 在輸送營養(yǎng)物質(zhì)中具有重要作用，金屬離子通常在自然細(xì)菌環(huán)境中是稀缺的，導(dǎo)致物種間和物種內(nèi)對金屬營養(yǎng)源的競爭［17］。百日咳博德特菌OMVs 可從環(huán)境中攝取鐵并將其輸送至細(xì)菌中，補(bǔ)充細(xì)菌生長所需的鐵營養(yǎng)［18］。除上述作用外，OMVs 在殺死競爭微生物、對外界環(huán)境發(fā)生反應(yīng)和保護(hù)細(xì)胞方面均具有重要意義。

2 百日咳博德特菌OMVs 的病理學(xué)功能

在博德特菌屬中，參與毒力基因調(diào)控的主要雙組分系統(tǒng)BvgAS 由傳感器激酶BvgS 和響應(yīng)調(diào)節(jié)劑BvgA 組成。BvgS 是一種“雜合”傳感器激酶，在3 個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域中具有3 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，介導(dǎo)BvgA 磷酸化。磷酸化的BvgA（即BvgA-P）以不同的結(jié)合模式與不同的毒力基因啟動子結(jié)合以激活轉(zhuǎn)錄［19］。BvgAS 控制超過100 種毒力基因的表達(dá)，在兩個(gè)不同的表型階段，即毒性Bvg+階段和無毒Bvg-階段之間發(fā)揮轉(zhuǎn)換作用［20］，且BvgS 和BvgA 序列在百日咳博德特菌菌株和臨床分離株中幾乎不變［21］。GASPERINI 等［18］采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定Bvg+和Bvg-毒力階段百日咳OMVs 中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，比較該病原體在其毒性或無毒狀態(tài)下的外膜蛋白模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bvg+OMVs 中特異性蛋白含量約占總蛋白的64%，在Bvg-OMVs 中降至約0.6%，該發(fā)現(xiàn)與百日咳桿菌BvgAS 雙組分系統(tǒng)對毒力基因具有良好調(diào)控的結(jié)論一致。另一方面，Bvg-OMVs 中所有非Bvg+特異性蛋白質(zhì)的數(shù)量普遍增加，在納米粒子跟蹤分析中進(jìn)一步證明了Bvg-OMVs 外膜蛋白的補(bǔ)償機(jī)制，即在Bvg+OMVs 和Bvg-OMVs 中囊泡蛋白質(zhì)大小分布和數(shù)量無差異的情況下，Bvg-OMVs 中大多數(shù)蛋白質(zhì)過度表達(dá)以彌補(bǔ)Bvg-外膜蛋白質(zhì)的缺乏。在Bvg+OMVs 中，被Bvg 激活的FHA 和PRN的黏附素在OMVs 與上皮細(xì)胞的結(jié)合中不發(fā)揮作用。該結(jié)果也表明，百日咳菌及其OMVs 是通過不同的黏附分子分別與上皮細(xì)胞相互作用，且這種差異結(jié)合可在宿主與病原體相互作用過程中產(chǎn)生協(xié)同作用［22］。

前期研究表明，百日咳博德特菌OMVs 能夠?qū)⒈砻娴南佘账岘h(huán)化酶毒素ACT 傳遞給靶細(xì)胞使其中毒，而PTX 被鑒定為Bvg+特異性蛋白，且能夠引起中國倉鼠卵巢CHO-K1 細(xì)胞的聚集，相比來自表達(dá)解毒PTX 的OMVs 未顯示出毒性［23］。盡管Bvg+OMVs 表達(dá)的PTX 不足以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，但其能為細(xì)菌中毒宿主細(xì)胞提供重要的補(bǔ)充機(jī)制，與其他分泌毒素產(chǎn)生協(xié)同作用，有助于感染期間的炎癥反應(yīng)。

3 OMVs 作為預(yù)防性疫苗的可能性

3.1 O M V s的免疫原性 百日咳OMVs 含有免疫刺激劑和抗原分子，在機(jī)體中能激活宿主系統(tǒng)免疫應(yīng)答。BOTTERO 等［24］將百日咳OMVs 與破傷風(fēng)和白喉類毒素聯(lián)合制備百白破三聯(lián)疫苗TdapMOVsBp，制備的TdapMOVsBp 具有良好的安全性，并能有效誘導(dǎo)Th1 ／ Th2 混合免疫應(yīng)答，這種混合的免疫反應(yīng)賦予小鼠對百日咳的最佳保護(hù)能力，且相比于aP 疫苗能夠提供更持久的獲得性免疫保護(hù)。

ZURITA 等［25］評估了OMVs 能否通過肺部免疫對缺失PRN 的百日咳菌株提供保護(hù)，研究表明，OMVs 疫苗能夠有效保護(hù)小鼠免受肺部百日咳PRN-菌株感染，且誘導(dǎo)的保護(hù)能力高于市售aP 疫苗。關(guān)于誘導(dǎo)免疫的持久性，研究發(fā)現(xiàn)，具有組織駐留記憶的CD4 TRM 細(xì)胞在OMVs 免疫接種后14 d積聚在小鼠的肺中。OMVs 疫苗誘導(dǎo)免疫小鼠呼吸TRM 細(xì)胞是一個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)，已證明CD4 TRM 細(xì)胞在預(yù)防百日咳桿菌再感染的免疫中起著關(guān)鍵作用［26］。這種記憶CD4 T 細(xì)胞群可提供比天然T 細(xì)胞賦予的抗病原體反應(yīng)更直接和有效的保護(hù)［27］。在用wP 疫苗免疫的小鼠中也能檢測到CD4 TRM的存在，但在用商業(yè)aP 疫苗免疫的小鼠中并未檢測到［26］。OMVs 實(shí)驗(yàn)主要針對肺部TRM 細(xì)胞，但不排除OMVs 在上呼吸道或腸道誘導(dǎo)TRM 細(xì)胞的可能性。用OMVs 和wP 疫苗免疫可誘導(dǎo)長期記憶T 細(xì)胞并擴(kuò)散至全身，其中一部分細(xì)胞構(gòu)成呼吸TRM 細(xì)胞群。在百日咳菌攻毒后，CD4 TRM 細(xì)胞誘導(dǎo)的干擾素γ（interferon γ，IFNγ）和白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）水平顯著升高，并可提供長期有效的保護(hù)。

3.2 O M V s作為黏膜佐劑和抗原載體 由于無細(xì)胞疫苗引發(fā)的不是保護(hù)免受感染最有效的免疫反應(yīng)，且亞單位疫苗本身能夠誘導(dǎo)的免疫效率不高，迫切需要能夠引發(fā)體液、細(xì)胞和黏膜免疫的新型免疫增強(qiáng)劑和遞送載體來有效地提高抗原的提呈效率。OMVs 具有獨(dú)特的免疫學(xué)和結(jié)構(gòu)特征，包括納米尺度的囊泡結(jié)構(gòu)、自佐劑效應(yīng)、對外源性大分子量蛋白的耐受性和攜帶免疫刺激物的能力，使其能夠作為一種有效的黏膜佐劑和抗原載體。雖然許多納米材料，如聚合物納米顆粒、無機(jī)納米顆粒、脂質(zhì)體和乳液等，也能夠作為遞送載體將抗原轉(zhuǎn)移至抗原呈遞細(xì)胞，但其不具有天然刺激免疫系統(tǒng)能力［28］。OMVs將抗原呈遞與自身佐劑特性相結(jié)合，使其非常適合作為疫苗載體。

3.3 降低O M V s內(nèi)毒性 安全性是實(shí)現(xiàn)百日咳OMVs 應(yīng)用的重要問題之一。天然百日咳OMVs 由于含有完全內(nèi)毒素的脂寡糖（lipooligosaccharide，LOS），能夠誘導(dǎo)過度的免疫激活和炎癥，不能直接用于疫苗生產(chǎn)。因此，降低LOS 活性對于百日咳OMVs 的應(yīng)用至關(guān)重要。傳統(tǒng)的OMVs 通過脫氧膽酸鹽（deoxycholate，DOC）等洗滌劑能夠降低LOS 含量，但也有諸多缺點(diǎn)：DOC 在去除LOS 的同時(shí)會去除OMVs 外膜局部脂蛋白，其中一些是疫苗的重要組成成分，如H 因子結(jié)合蛋白（factor H-binding protein，fHbp）；DOC 處理的OMVs 易聚集，使OMVs 在生產(chǎn)操作過程中更加復(fù)雜化［29］。

ASENSIO 等［30］研究了脂肪酶PagL 的表達(dá)對百日咳OMVs 內(nèi)毒素活性和保護(hù)能力的影響，結(jié)果表明，PagL 會引起類脂A 的脫?；{(diào)節(jié)TLR4 ／ MD-2受體復(fù)合物對類脂A 的識別并降低內(nèi)毒素活性。通過小鼠模型證明，與對照組OMVsBp 相比，OMVs-BpPagL 組展示了其低毒性的優(yōu)勢，且誘導(dǎo)IL-1 和IL-6 的水平低于OMVsBp，這些結(jié)果與小鼠體重增加試驗(yàn)中觀察到的低毒性和OMVBpPagL 誘導(dǎo)的促炎性能力降低一致［30］。作為免疫佐劑和內(nèi)毒素拮抗劑的類脂A，如何對其修飾從而降低LOS 的內(nèi)毒性是應(yīng)用百日咳OMVs 的重要方面。了解類脂A 的生物化學(xué)及其對發(fā)病機(jī)制的影響，可在百日咳感染期間提供有效的治療方案。

3.4 噴霧干燥百日咳O M V s的應(yīng)用 越來越多的研究證明基于百日咳OMVs 疫苗是一個(gè)較有潛力的候選疫苗。KANOJIA 等［31］開發(fā)了一種噴霧干燥的OMVPV，這種方式不影響OMVPV 的結(jié)構(gòu)完整性，與液體OMVPV 配方相比具有更高的穩(wěn)定性。在通過小鼠的肺部途徑給藥時(shí)，噴霧干燥的OMVPV 顯示出與液體OMVPV 相當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答和針對百日咳博德特菌的特異性保護(hù)。除廣泛的系統(tǒng)性IgG 和Th1 ／ Th17 應(yīng)答外，噴霧干燥的OMVPV 還能夠誘導(dǎo)黏膜IgA 和Th17 細(xì)胞免疫應(yīng)答。噴霧干燥技術(shù)可提高OMVPV 冷鏈外的長期儲存，避免了由冷凍干燥引起的對抗原的潛在損害。另外，噴霧干燥的優(yōu)勢也在于其干燥顆?？捎糜诜尾?、鼻內(nèi)或口服給藥過程［28-33］，對于百日咳穩(wěn)定疫苗在全球的輸送和應(yīng)用具有實(shí)質(zhì)性優(yōu)勢。

4 展 望

全球范圍內(nèi)百日咳發(fā)病率呈增長趨勢，開發(fā)新一代疫苗需要進(jìn)一步研究百日咳博德特菌的發(fā)病機(jī)制和免疫力。百日咳OMVs 具有作為有效疫苗產(chǎn)品所需的許多功能，包括引起體液反應(yīng)的膜表面抗原的天然結(jié)構(gòu)、誘發(fā)T 細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)的潛能、多個(gè)PAMPs 的存在觸發(fā)先天免疫反應(yīng)及適合抗原呈遞細(xì)胞有效加工的體積。這些優(yōu)勢使其作為第三代百日咳疫苗具有巨大的市場潛力。但對于OMVs 的開發(fā)仍存在一些障礙，如尚無大規(guī)模臨床和臨床前評估、對OMVs 制造工藝的了解有限及研究成本的投資不足。隨著人類對幾種基于腦膜炎球菌OMVs 疫苗的上市批準(zhǔn)［32］，百日咳OMVs 作為新型疫苗產(chǎn)品也將具有廣泛的應(yīng)用前景。