王日成

中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué) 附屬第一醫(yī)院，安徽 合肥 230001

疏風(fēng)解毒膠囊是由虎杖、連翹、板藍(lán)根、柴胡、敗醬草、馬鞭草、蘆根、甘草8味中藥制備而成的復(fù)方制劑，具有疏風(fēng)清熱、解毒利咽的功效，臨床用于發(fā)熱、惡心、咽痛、頭痛、鼻塞、流濁涕、咳嗽等急性上呼吸道感染屬風(fēng)熱證及流感的防治，體內(nèi)外研究表明，其療效確切[1-2]?，F(xiàn)行質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)(YBZ00652009)，采用薄層掃描法測(cè)定虎杖中大黃素的含量[3]。但疏風(fēng)解毒膠囊中多種化學(xué)成分已被證實(shí)有明確藥理活性，如方中虎杖[4](虎杖苷、大黃素8-O-葡萄糖苷、大黃酸、大黃酚)具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰的功效，連翹[5](連翹苷、連翹酯苷A)具有清熱、解毒、散結(jié)、消腫的功效，馬鞭草[6](馬鞭草苷)具有涼血、散瘀、通經(jīng)、清熱、解毒、止癢、驅(qū)蟲(chóng)、消脹的功效，甘草[7](甘草酸銨)具有清熱解毒、祛痰止咳、脘腹的功效，故僅以大黃素做為唯一質(zhì)控指標(biāo)難以全面體現(xiàn)疏風(fēng)解毒膠囊的內(nèi)在質(zhì)量。現(xiàn)有文獻(xiàn)資料[8-11]采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定疏風(fēng)解毒膠囊中的虎杖苷、馬鞭草苷、連翹苷等成分，尚未有采用超高效液相色譜法(UPLC)同時(shí)定量測(cè)定疏風(fēng)解毒膠囊中多種成分的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用UPLC測(cè)定疏風(fēng)解毒膠囊中馬鞭草苷、虎杖苷、連翹苷、連翹酯苷A、蘆薈大黃素、大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃酸、甘草酸銨、大黃素、大黃酚10個(gè)指標(biāo)成分含量，以期全面、有效評(píng)價(jià)其質(zhì)量，完善質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，為進(jìn)一步的臨床研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY UPLC超高效液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司)；ABS-135S型電子天平(d=0.01 mg，瑞士梅特勒公司)；AS1001K型數(shù)控超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯公司)。

1.2 試藥

對(duì)照品連翹苷(批號(hào)：110821-201615，純度：94.9%)、連翹酯苷A(批號(hào)：111810-201707，純度：97.2%)、蘆薈大黃素(批號(hào)：110795-201609，純度：98.1%)、大黃酸(批號(hào)：110757-201607，純度：99.3%)、甘草酸銨(批號(hào)：110731-201720，純度：97.7%)、大黃素(批號(hào)：110756-201512，純度：98.7%)、大黃酚(批號(hào)：110796-201520，純度：99.2%)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；馬鞭草苷(成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)：M-042，純度≥98%)；虎杖苷(成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：A0052，純度：98%)；大黃素8-O-葡萄糖苷(成都克洛瑪生物科技有限公司，批號(hào)：130822，純度≥98%)。

疏風(fēng)解毒膠囊由安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)分別為160511、160922、170204、170516、170709、170715、170824、180104、180514；甲醇、乙腈均為色譜純(默克公司)；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLCTMC18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～3 min，10%A；3～6 min，10%～30%A；6～11 min，30%～40%A；11～17 min，40%～80%A；17～19 min，80%A；19～20 min，80%～10%A)；流速為0.3 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為2 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品馬鞭草苷、虎杖苷、連翹苷、連翹酯苷A、蘆薈大黃素、大黃素8-O-葡萄糖苷、大黃酸、甘草酸銨、大黃素、大黃酚適量，加甲醇超聲溶解并定容，制成分別含馬鞭草苷0.545 mg·mL-1、虎杖苷1.082 mg·mL-1、連翹苷0.213 mg·mL-1、連翹酯苷A0.636 mg·mL-1、蘆薈大黃素0.381 mg·mL-1、大黃素8-O-葡萄糖苷0.035 mg·mL-1、大黃酸0.079 mg·mL-1、甘草酸銨0.793 mg·mL-1、大黃素0.561 mg·mL-1、大黃酚0.018 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液(以上對(duì)照品質(zhì)量濃度已按對(duì)照品純度折算)，室溫避光保存，備用。

精密吸取混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，分別置10 mL量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，得系列混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 疏風(fēng)解毒膠囊20粒，取內(nèi)容物混合均勻，精密稱定約1.0 g，置100 mL圓底燒瓶中，加入稀乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取2 h，冷卻后稱定質(zhì)量并用稀乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液，室溫避光保存。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別精密吸取2.2項(xiàng)下的供試品溶液、混合對(duì)照品溶液及空白溶劑，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果10個(gè)化學(xué)成分均可達(dá)到基線分離，與相鄰色譜峰之間的分離度>1.5，理論塔板數(shù)按虎杖苷計(jì)>15 000，對(duì)稱因子均小于1.2，空白溶劑對(duì)測(cè)定結(jié)果均無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

注：A.供試品；B.混合對(duì)照品；C.空白樣品；1.馬鞭草苷；2.虎杖苷；3.連翹苷；4.連翹酯苷A；5.蘆薈大黃素；6.大黃素8-O-葡萄糖苷；7.大黃酸；8.甘草酸銨；9.大黃素；10.大黃酚。

2.3.2線性關(guān)系考察 取2.2.2項(xiàng)下系列混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸，計(jì)算10個(gè)化學(xué)成分回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r)，見(jiàn)表1。

表1 疏風(fēng)解毒膠囊中10種化學(xué)成分的回歸方程及線性范圍

精密量取2.2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，用稀乙醇倍比稀釋，按2.1項(xiàng)下液相色譜條件分析，取各成分峰信噪比S/N為10時(shí)的混合對(duì)照品溶液濃度為定量限(LOQ)，結(jié)果馬鞭草苷、虎杖苷、連翹苷、連翹酯苷A、蘆薈大黃素、大黃素8-O-葡萄糖苷、大黃酸、甘草酸銨、大黃素和大黃酚LOQ分別為4.33、6.08、3.27、3.49、3.81、0.024、1.36、2.99、2.73、0.51 μg·mL-1。

2.3.3精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖并計(jì)算10個(gè)化學(xué)成分峰面積RSD。結(jié)果馬鞭草苷、虎杖苷、連翹苷、連翹酯苷A、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素8-O-葡萄糖苷、甘草酸銨、大黃素、大黃酚峰面積RSD分別為0.33%、0.26%、0.19%、0.57%、0.43%、0.48%、0.32%、1.01%、0.97%、0.71%(n=6)，儀器精密度符合要求。

2.3.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào)：20180526)，分別于0、4、8、12、16、20、24 h按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖并計(jì)算10個(gè)成分峰面積RSD。結(jié)果馬鞭草苷、虎杖苷、連翹苷、連翹酯苷A、蘆薈大黃素、大黃素8-O-葡萄糖苷、大黃酸、甘草酸銨、大黃素、大黃酚峰面積RSD分別為1.64%、1.72%、1.00%、2.14%、1.51%、2.62%、1.84%、1.50%、2.21%、2.25%(n=7)，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品(批號(hào)：20180526)內(nèi)容物6份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖及峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算10個(gè)成分含量及其RSD。結(jié)果馬鞭草苷、虎杖苷、連翹苷、連翹酯苷A、蘆薈大黃素、大黃素8-O-葡萄糖苷、大黃酸、甘草酸銨、大黃素、大黃酚平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8.171、16.232、3.198、9.547、5.713、0.529、1.122、11.895、8.417、0.272 mg·g-1，RSD分別為0.74%、0.56%、0.28%、0.77%、0.92%、1.11%、0.78%、0.66%、0.49%、1.40% (n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取2.3.5項(xiàng)下已知含量供試品9份，每份約0.5 g，分成3組，精密稱定，分別加入含馬鞭草苷(1.641 mg·g-1)、虎杖苷(3.245 mg·g-1)、連翹苷(0.638 mg·g-1)、連翹酯苷A(1.889 mg·g-1)、蘆薈大黃素(1.141 mg·g-1)、大黃素8-O-葡萄糖苷(0.106 mg·g-1)、大黃酸(0.225 mg·g-1)、甘草酸銨(2.378 mg·g-1)、大黃素(1.681 mg·g-1)、大黃酚(0.054 mg·g-1)混合對(duì)照品溶液2.0、2.5、3.0 mL，按2.2.2項(xiàng)下方法處理，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算10個(gè)化學(xué)成分加樣回收率及相應(yīng)RSD。結(jié)果馬鞭草苷、虎杖苷、連翹苷、連翹酯苷A、蘆薈大黃素、大黃素8-O-葡萄糖苷、大黃酸、甘草酸銨、大黃素、大黃酚平均加樣回收率分別為104.37%、97.35%、100.50%、101.02%、102.42%、100.16%、104.27%、100.84%、98.14%、99.79%；RSD分別為0.40%、0.98%、0.41%、0.56%、0.83%、1.00%、0.58%、0.88%、0.91%、0.71% (n=9)。見(jiàn)表2。

表2 疏風(fēng)解毒膠囊10個(gè)成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

續(xù)表2

2.4 樣品含量測(cè)定

取9批供試品，按照2.2.2項(xiàng)下條件處理，按2.1項(xiàng)下色譜條件平行進(jìn)樣3次，記錄色譜圖及相應(yīng)峰面積，照外標(biāo)法計(jì)算10個(gè)化學(xué)成分含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 疏風(fēng)解毒膠囊10個(gè)成分含量測(cè)定結(jié)果(n=3) mg·g-1

3 討論

3.1 質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)成分的選擇

疏風(fēng)解毒膠囊中虎杖為君藥，含有虎杖苷及蒽醌類成分大黃素、大黃酚等；連翹為臣藥，含有木脂素類連翹苷和苯乙醇苷類連翹酯苷A、連翹酯苷E等；馬鞭草為方中佐藥，含有環(huán)烯醚萜類成分戟葉馬鞭草苷和馬鞭草苷；甘草為方中使藥，含有甘草酸銨、甘草次酸及黃酮類成分甘草苷，筆者經(jīng)UPLC多次實(shí)驗(yàn)分析，最終選擇藥效確切、性質(zhì)穩(wěn)定、色譜響應(yīng)值高且分離效果好的馬鞭草苷、虎杖苷、連翹苷、連翹酯苷A、蘆薈大黃素、大黃素8-O-葡萄糖苷、大黃酸、甘草酸銨、大黃素、大黃酚10個(gè)化學(xué)成分做為質(zhì)量研究指標(biāo)。

3.2 色譜柱選擇

本實(shí)驗(yàn)分別比較不同品牌UPLC色譜儀(Agilent 1290 Infinity型UPLC色譜儀、Waters ACQUITY UPLC系統(tǒng))和色譜柱(Thermo SyncromisTMC18(100 mm×3.0 mm，1.7 μm)、ACQUITY UPLCTMC18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)、ZORBAX Eclipse plus C18(150 mm×2.1mm，1.8 μm)對(duì)10個(gè)化學(xué)成分含量結(jié)果的影響，結(jié)果各成分色譜峰分離度均符合規(guī)定，含量測(cè)定結(jié)果RSD均小于2.0%，方法耐用性良好。

3.3 供試品溶液制備方法選擇

本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品提取方法(超聲30 min、回流2 h、索氏提取3 h)、提取溶劑(甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%乙醇、水)分別進(jìn)行考察，超聲不能完全提取出10種化學(xué)成分，且糖類等成分對(duì)分析結(jié)果影響較大，回流和索氏提取方法結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但回流所需時(shí)間短、易于操作，故選擇70%乙醇回流提取2 h作為供試品處理方法。

3.4 色譜條件選擇

本研究考察流動(dòng)相以甲醇、乙腈作為有機(jī)相，0.05%甲酸、0.05%磷酸、0.1%甲酸、0.2%甲酸作為水相，結(jié)果乙腈-0.1%甲酸水溶液梯度洗脫時(shí)分離效果最佳，基線平穩(wěn)，保留時(shí)間適中，各色譜峰峰形較好。

本研究采用二極管陣列檢測(cè)器210～400 nm全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示，馬鞭草苷、虎杖苷、連翹苷、連翹酯苷A、蘆薈大黃素、大黃素8-O-葡萄糖苷、大黃酸、甘草酸銨、大黃素和大黃酚在250 nm處均有最大吸收，基線平穩(wěn)、靈敏度高，故選擇250 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究建立UPLC同時(shí)測(cè)量疏風(fēng)解毒膠囊中的馬鞭草苷、虎杖苷、連翹苷、連翹酯苷A、蘆薈大黃素、大黃素8-O-葡萄糖苷、大黃酸、甘草酸銨、大黃素、大黃酚10個(gè)成分的含量，與HPLC相比不僅增加檢測(cè)指標(biāo)、縮短分析時(shí)間、減少溶液消耗，極大降低分析成本，提高了檢驗(yàn)效率[12]，且經(jīng)精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率等方法學(xué)考察均符合要求，結(jié)果準(zhǔn)確、快速、可靠，可做為疏風(fēng)解毒膠囊質(zhì)量評(píng)價(jià)的有效方法。