唐宇其　顏彥　李美英　胡偉

摘要：【目的】克隆粉蕉1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）氧化酶（ACO）基因（MbACO2），并進行表達分析，為研究ACO基因家族在香蕉果實發(fā)育成熟過程及逆境脅迫過程中的功能作用提供參考依據，也為改良香蕉采后貯藏提供潛在的基因資源?！痉椒ā坷肦T-PCR從粉蕉果實克隆MbACO2基因，運用生物信息學軟件分析其編碼蛋白的理化性質、親疏水性、保守結構域及二、三級結構。利用農桿菌介導的瞬時轉化法進行亞細胞定位，并利用實時熒光定量PCR檢測MbACO2基因在果實發(fā)育成熟過程及高鹽、干旱和低溫脅迫處理下的表達情況。【結果】克隆獲得的MbACO2基因開放閱讀框（ORF）長度為918 bp，編碼305個氨基酸殘基，其蛋白分子量為34.583 kD，理論等電點（pI）為5.43，屬于親水性蛋白，具有典型的植物ACO蛋白家族的結構特征，含有DIOX_N和2OG-FeⅡ_Oxy 2個保守結構域。MbACO2氨基酸序列與同屬的香蕉（Musa acuminata AAA group）ACO氨基酸序列（XP_010908825.1）相似性最高，為98.04%，表明其具有高度的保守性。MbACO2蛋白在細胞核和細胞質中均有表達。隨著粉蕉果實發(fā)育成熟，MbACO2基因表達量整體呈升高趨勢，極顯著高于開花后0 d（對照）（P<0.01，下同），尤其是在果實采后6 d，其相對表達量達最高值。高鹽、干旱和低溫脅迫處理下，MbACO2基因的相對表達量較對照（未脅迫處理）顯著（P<0.05）或極顯著提高?！窘Y論】MbACO2基因屬于ACO基因家族成員，含有該家族的典型結構域，在粉蕉果實發(fā)育成熟過程及逆境脅迫的應答中發(fā)揮正向調控作用，高鹽、干旱和低溫脅迫處理均能誘導其上調表達。

關鍵詞： 粉蕉;1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶（ACO）;果實發(fā)育;逆境脅迫;表達分析

中圖分類號： S668.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）01-0155-08

Abstract：【Objective】To clone 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid（ACC） oxidase（ACO） gene （MbACO2） from Musa ABB group，cv Pisang Awak，FJ，and analyze its bioinformatics and expression，so as to provide reference for studying the function of ACO gene family in banana fruit ripening and stress process，and to provide potential gene resources for improving banana postharvest storage. 【Method】Gene MbACO2 was cloned from Musa ABB group，cv Pisang Awak，FJ by RT-PCR. The physicochemical properties，hydrophilicity/hydrophobicity，conserved domains and sec-ondary/tertiary structures of the encoded protein were predicted by bioinformatics analysis. Subcellular localization was conducted using Agrobacterium-mediated transient transformation. The expression level of MbACO2 gene in fruit deve-lopment and stress response（high-salt， drought and low temperature） was detected by real-time quantitative PCR. 【Result】The open reading frame（ORF） length of MbACO2 was 918 bp，encoding 305 amino acid residues. The molecular weight of the protein was 34.583 kD and the theoretical isoelectric point（pI） was 5.43. The protein encoded by MbACO2 gene belonged to hydrophilic protein，which had typical plant ACO structural characteristics and contained two conservative domainsDIOX_N and 2OG-FeⅡ_Oxy. The amino acid sequence of MbACO2 was similar to that of ACO amino acid sequence（XP_010908825.1） in banana（Musa acuminata AAA group） and the similarity reached 98.04%，indicating that the amino acid sequence of MbACO2 protein was highly conserved. The subcellular localization results showed that MbACO2 protein was expressed in both nucleus and cytoplasm. The expression of MbACO2 gene increased with the development of fruit ripening， and was extremely higher than 0 d after flowering（control） （P<0.01， the same below）. The expression level of MbACO2 was the highest 6 d after harvest. Under high-salt， drought and low temperature，the relative expression of MbACO2 gene was significantly up-regulated（P<0.05） or extremely up-regulated compared with control（no stress treatment）. 【Conclusion】MbACO2 gene belongs to ACO gene family， it contains the typical domains of the family， and? it playsa positive regulation role in banana fruit ripening and stress resistance of Musa ABB group，cv Pisang Awak，FJ. High-salt， drought and low temperature can induce its upregulation of expression.

Key words：Musa ABB group，cv Pisang Awak，FJ; 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase（ACO）; fruit growth; stress; expression analysis

Foundation item： Hainan Key Research and Development Project（SKJC-2020-02-002）

0 引言

【研究意義】香蕉作為世界四大水果之一，其果實富含碳水化合物和蛋白質，是熱帶地區(qū)及亞熱帶地區(qū)重要的糧食作物和經濟作物（Inaba et al.，2007）。香蕉是典型的呼吸躍變型果實，其成熟過程受乙烯的調控，在生產上主要通過乙烯吸收劑來延長香蕉的貨架期（施怡婷和楊淑華，2016）。乙烯（Ethylene）作為一種非常重要的氣態(tài)激素，其介導的信號通路在植物生長發(fā)育、果實成熟及脅迫應答等過程中發(fā)揮重要作用（賀立紅等，2009）。1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）氧化酶（ACO）作為乙烯生物合成途徑的限速酶，能直接催化ACC產生乙烯（Alexander and Grierson，2002;侯曉婉等，2015）。因此，加強ACO基因研究有助于深入探究乙烯生物合成的調控機制及其在脅迫應答中的潛在功能?！厩叭搜芯窟M展】目前，ACO基因已在擬南芥（5個）（Vandenbussche et al.，2003）、玉米（13個）（Gallie and Young，2004）、番茄（7個）（Sell and Hehl，2005）、水稻（9個）（Iwai et al.，2006）、蘋果（7個）（Binnie and McManus，2009）、菠蘿（朱家紅等，2018）等多種植物中被鑒定出來，且進行克隆及表達分析。Andersson-Gunneras等（2003）研究發(fā)現，重力刺激使張力木材形成組織中ACO活性急劇增強，進而促進形成楊樹應拉木。Shi等（2006）研究發(fā)現，乙烯生物合成是棉花纖維伸長過程中最顯著上調的生化途徑之一，且可通過ACO調控乙烯以促進棉花纖維細胞的伸長。Zhang等（2009）研究發(fā)現，乙烯應答因子ERF通過調控ACS和ACO基因在乙烯合成中發(fā)揮正向調控作用。Liu等（2015）通過基因沉默（VIGS）方法瞬時沉默ACS2、ACS4和ACO1基因后，ACS和ACO活性顯著降低，進而抑制果實成熟。Chen等（2016）研究發(fā)現，蛋白磷酸酶基因（WIP1）通過調控ACO基因的表達來控制黃瓜單性花的發(fā)育進程。在AAA型同源三倍體香蕉中，MaACS1、MaACO1、MaACO5、MaACO13和MaACO14與果實成熟密切相關，且一系列轉錄因子如MaHDZI19、MaHDZI126、MaHDZII4、MaHDZII7、MaBZR1、MaBZR2、MaERF9、MaERF11和MaMADS7與MaACS或MaACO基因啟動子互作調控其轉錄及乙烯合成（Xiao et al.，2013;Liu et al.，2015;Han et al.，2016;Guo et al.，2019;Yang et al.，2020）。此外，已有研究表明ACO基因在番茄果實呼吸躍變期具有重要的調控和限速作用（Van de Poel et al.，2012，2014;Grierson et al.，2014）。本課題組前期研究結果（Wang et al.，2019）表明，粉蕉B基因組上的ACO基因在果實成熟過程中發(fā)揮重要作用?！颈狙芯壳腥朦c】ACO基因在植物的生長發(fā)育及果實成熟過程中具有重要調控功能作用，但目前有關香蕉ACO基因，尤其是B基因組上ACO基因克隆及表達分析的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】以粉蕉（Musa ABB group，cv Pisang Awak，FJ）為研究對象，選擇B基因組上的ACO基因家族成員MbACO2基因進行生物信息學及表達分析，明確其在粉蕉組織和逆境脅迫中的表達水平，為解析該基因在乙烯信號通路及脅迫應答中的調控功能打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

粉蕉由中國熱帶農業(yè)科學院香蕉品種協會提供。本生煙由中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所提供。多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、DNA純化（回收）試劑盒及質粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司;2×Rapid Taq MasterMix、反轉錄試劑盒HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wi-per）和熒光定量試劑盒ChamQ Universal SYBR qPCR MasterMix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞和農桿菌GV3101（psoup-p19）感受態(tài)細胞購自上海唯地生物技術有限公司;亞細胞定位載體pNC-Green-SubC和連接酶試劑盒Nimble Cloning購自海南壹田生物科技有限公司;氯化鈉購自西隴科學股份有限公司;甘露醇購自廣州化學試劑公司。主要儀器設備：CT15RT高速冷凍離心機[天美（中國）科學儀器有限公司]、EPS300電泳儀（上海天能科技有限公司）、4100凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）、NanoDropTM One/OneC超微量紫外分光光度計（Thermo，美國）、PCR儀（Analytikjena，德國）、FluoView FV1000激光共聚焦顯微鏡（Olympus，日本）和MX3000熒光定量PCR儀（Agilent，美國）。

1. 2 樣品采集及脅迫處理

選擇發(fā)育狀況良好、無病蟲害的植株，分別取開花后0、20和80 d的果實及采后3和6 d的成熟果實，切片取樣，經液氮處理后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。選擇大小均一，生長良好，無病蟲害且僅帶有5片葉的粉蕉幼苗進行高鹽（300 mmol/L氯化鈉）、干旱（200 mmol/L甘露醇）和低溫（4 ℃ 22 h）脅迫處理，置于溫室[培養(yǎng)條件：28 ℃，200 ?mol/（m2·s）光強、16 h光照/8 h黑暗、相對濕度70%]培養(yǎng)7 d。取不同處理葉片經液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 RNA提取及cDNA合成

將不同時期及不同處理的粉蕉樣品，按照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明提取其總RNA。利用超微量紫外分光光度計分別測定RNA濃度，然后按照反轉錄試劑盒HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明反轉錄合成cDNA。

1. 4 基因克隆及載體構建

根據香蕉基因組數據庫Banana Genome Database（http：//musagd.biocloud.net/home）中的MbACO2基因序列（>Mb_03_t02600.1），設計其特異性擴增引物（pNC-MbACO2F和pNC-MbACO2R）（表1），以粉蕉果實cDNA為模板進行PCR擴增。反應體系25.0 μL：2×Rapid Taq MasterMix 12.5 μL，cDNA模板1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，ddH2O補足至25.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性3 min;95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 6 s，進行25個循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行切膠回收，并利用Nimble Cloning試劑盒與目的載體pNC-Green-SubC連接，轉化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞。挑取陽性單克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將測序正確的單克隆菌液保存并提取其質粒，轉化農桿菌GV3101（psoup-p19），保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 5 生物信息學分析

通過NCBI數據庫BLASTx對MbACO2基因進行開放閱讀框（ORF）預測及同源序列搜索;利用DNAMAN 6.0進行氨基酸序列比對及同源性分析;利用ExPASy預測MbACO2蛋白的理化性質;采用NCBI數據庫CDD進行保守結構域預測分析;運用PRABI和SWISS-MODEL預測MbACO2蛋白的二、三級結構;并以MEGA 5.0中的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1. 6 亞細胞定位

將MbACO2基因編碼區(qū)（CDS）序列與攜帶有綠色熒光蛋白（GFP）基因的pNC-Green-SubC表達載體連接，構建pNC-Green-SubC-MbACO2瞬時表達載體，通過農桿菌GV3101（psoup-p19）介導瞬時侵染本生煙草葉片，25 ℃培養(yǎng)3 d后，通過激光共聚焦顯微鏡觀察是否存在GFP信號。

1. 7 基因表達分析

分別設計MbACO2基因編碼區(qū)（CDS）序列的定量PCR引物（qRT-MbACO2F和qRT-MbACO2R）（表1） 。以粉蕉不同發(fā)育成熟階段的果實及高鹽、干旱和低溫脅迫處理下的葉片cDNA為模板、Maactin為內參基因，通過實時熒光定量PCR對MbACO2基因的表達量進行檢測。反應體系20.0 μL：SYBR qPCR MasterMix 10.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O補足至20.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性30 s;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，進行40個循環(huán)。每樣品技術重復均為3次。采用2-△△Ct法計算相對表達量。

1. 8 統(tǒng)計分析

試驗數據采用Excel 2016進行整理及單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結果與分析

2. 1 MbACO2基因PCR擴增結果

以粉蕉果實cDNA為模板、pNC-MbACO2F和pNC-MbACO2R為引物進行特異性擴增，獲得大小約900 bp的特異條帶（圖1）。測序結果顯示，該條帶長918 bp，編碼305個氨基酸殘基，經序列比對鑒定為目的基因MbACO2。

2. 2 MbACO2蛋白理化性質及結構預測分析結果

MbACO2蛋白的原子總數為4839個，化學分子式 C1548H2404N418O456S13，分子量34.583 kD，理論等電點（pI）5.43，蛋白脂肪系數77.12。鑒于不穩(wěn)定系數值為32.62，親水性平均值（GRAVY）為-0.475，推測MbACO2屬于穩(wěn)定的親水性蛋白。利用NCBI數據庫中的CDD預測MbACO2蛋白保守結構域（圖2），結果發(fā)現其含保守結構域PLN02299，故推測MbACO2屬于ACO家族成員。MbACO2蛋白二級結構預測結果（圖3）顯示，α-螺旋120個，占39.22%;延伸鏈58個，占18.95%;β-轉角23個，占7.52%，無規(guī)則卷曲105個，占34.31%。利用SWISS-MODEL預測Mb-ACO2蛋白三級結構，其結果（圖4）與二級結構預測結果相符。

2. 3 MbACO2氨基酸序列同源比對及系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析結果

利用NCBI數據庫中的BLASTp搜索MbACO2蛋白的同源氨基酸序列，結果顯示MbACO2氨基酸序列與多個物種的ACO氨基酸序列相似性均較高，包括香蕉（M. acuminata AAA group） AAG43057.1、海棗（Phoenix dactylifera） XP_008799050.1、油棕（Elaeis guineensis） XP_010908825.1、蘆筍（Asparagus officinalis）XP_020246901.1、南瓜（Cucurbita mo-schata）XP_022936989.1、黃瓜（Cucumis sativus）XP_004142637.1、菠蘿（Ananas comosus） XP_02010670 6.1、橡膠樹（Hevea brasiliensis） XP_021636599.1、黍（Panicum hallii） XP_025807219.1、小米（Setaria ita-lic） XP_004960278.1、稗子（Echinochloa crus-galli） AKA60095.1、苦瓜（Momordica charantia）XP_0221 34061.1、高粱（Sorghum bicolor）XP_002439286.1和野燕麥（Avena fatua） QCG69018.1，其ACD氨基酸序列相似性分別為98.04%、82.90%、81.99%、74.35%、73.79%、73.79%、73.55%、73.46%、73.14%、72.67%、72.17%、71.52%、71.02%和70.55%。利用ClustalX進行多序列比對分析，結果發(fā)現MbACO2具有典型的植物ACO家族特征結構域（朱家紅等，2018），即 DIOX_N（黑色劃線處）和2OG-FeⅡ_Oxy（綠色劃線處）2個保守結構域（圖5）。

基于ACO氨基酸序列相似性構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖6）顯示，MbACO2蛋白和香蕉、油棕和海棗ACO蛋白聚在同一分支上，親緣關系較近，與黍、小米和稗子親緣關系相對較遠。

2. 4 MbACO2蛋白的亞細胞定位分析結果

利用農桿菌介導的瞬時轉化法將pNC-Green-SubC-MbACO2轉化至煙草葉片中進行表達，結果（圖7）顯示，煙草葉片細胞質和細胞核均顯示出熒光信號，說明MbACO2蛋白可能在粉蕉的細胞質和細胞核中均有表達。

2. 5 MbACO2基因表達分析結果

利用實時熒光定量PCR檢測MbACO2基因在粉蕉果實發(fā)育階段及高鹽、干旱、低溫脅迫下的表達情況。由圖8可知，隨著粉蕉果實發(fā)育成熟，MbACO2基因表達量整體上呈逐漸升高趨勢，均極顯著高于開花后0 d（對照）（P<0.01，下同），尤其是在果實采后6 d，其相對表達量達最高值，是對照的1000多倍。由圖9可知，在高鹽、干旱和冷脅迫處理下，MbACO2基因的相對表達量較對照（未脅迫處理）顯著（P<0.05）或極顯著提高，說明這3種脅迫處理能誘導該基因上調表達，推測MbACO2基因在粉蕉果實發(fā)育成熟過程及逆境脅迫的應答中發(fā)揮重要作用。

3 討論

香蕉是典型的呼吸躍變型果實，其果實發(fā)育和成熟決定果實品質（Xu et al.，2007），因此研究粉蕉果實發(fā)育成熟的分子機理對延長其貨架期非常重要。粉蕉在廣東、廣西和海南已有廣泛種植（游伐，2019），其中ABB基因型植株特點是果實成熟快，較普通的巴西蕉（AAA group）提前約10 d（Wang et al.，2019）。ACO是乙烯形成過程中的關鍵酶，其對于果實成熟具有重要貢獻（Houben and Van de poel，2019）。且本課題組前期研究發(fā)現，粉蕉B基因組上的ACO基因在果實成熟過程中發(fā)揮重要調控作用（Wang et al.，2019）。由于目前針對于粉蕉成熟機理的研究報道較少，因此本研究選擇粉蕉中B基因組上的ACO基因家族成員MbACO2作為研究對象，經蛋白結構預測、序列比對及系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析等發(fā)現，MbACO2基因的CDS序列長度為918 bp，編碼305個氨基酸殘基，含有ACO蛋白家族的2個保守結構域DIOX_N和2OG-FeⅡ_Oxy，且與香蕉、海棗和油棕的氨基酸序列相似性均在80.00%以上，該蛋白定位于細胞質和細胞核，與Tatsuki等（2006）報道的紅花CtACO1定位結果一致。

香蕉是對逆境脅迫非常敏感的作物，低溫、干旱和高鹽脅迫均會造成其減產和品質降低（孫雪麗等，2019），因此研究香蕉對逆境脅迫的應答機理十分重要。隨著粉蕉果實發(fā)育成熟，MbACO2基因的表達量整體上呈升高趨勢，與Liu等 （2015）研究巴西蕉中MaMADS7基因的表達趨勢一致，進一步證實不同物種中ACO基因在果實發(fā)育成熟過程中發(fā)揮一定的調控作用。且低溫、高鹽和干旱均會顯著或極顯著提高MbACO2基因的相對表達量，與前人針對桃（Tatsuki et al.，2006）、馬鈴薯（Kim et al.，2008）及番茄（Mei et al.，2009）等物種的ACO基因研究結果一致，表明不同物種的ACO基因均可對逆境產生應答反應。這也與前人研究發(fā)現乙烯可提高植物對逆境抵抗能力的結論相符（Yang et al.，2020）。

本研究克隆獲得的MbACO2基因在果實發(fā)育成熟過程中高度表達，且經高鹽、干旱和低溫脅迫后呈高效表達，故推測其在果實發(fā)育成熟和逆境脅迫響應中發(fā)揮重要作用。在今后的研究中，可通過誘導或沉默MbACO2基因在果實中的表達，進一步深入解析其在果實發(fā)育成熟及響應逆境脅迫中的功能。

4 結論

MbACO2基因是ACO基因家族成員，含有該家族的典型結構域，在粉蕉果實成熟及逆境脅迫的應答中發(fā)揮正向調控作用，高鹽、干旱和低溫脅迫處理均能誘導其上調表達。

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（責任編輯 陳 燕）