袁青領(lǐng)，樊玉霞，劉 洋，王曉明，劉 征，賈 勐，耿祖仕，鄭 建，盧秀波

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院甲狀腺外科 鄭州 450052

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是最常見的人類甲狀腺惡性腫瘤之一，目前全球發(fā)病率逐漸升高；PTC占所有甲狀腺惡性腫瘤的60%～80%[1]。MicroRNA(miRNA)是長約22個(gè)核苷酸的小分子非編碼單鏈RNA，可與其下游靶基因的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)相結(jié)合，參與細(xì)胞的增殖、凋亡及分化等生物學(xué)過程[2-3]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine-threonine kinase, AKT)在細(xì)胞生理過程的各個(gè)階段發(fā)揮重要作用，可磷酸化絲氨酸/蘇氨酸[4]。AKT3是其亞型之一，其高表達(dá)可引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，參與甲狀腺癌的進(jìn)展過程[5]。

我們使用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-637與AKT3基因之間存在靶向關(guān)系并應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證，然后觀察轉(zhuǎn)染miR-637的PTC細(xì)胞TPC-1中AKT3蛋白表達(dá)的變化以及細(xì)胞遷移及侵襲能力的改變，以期從分子水平闡明miR-637對PTC的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、主要試劑及儀器DMEM、胎牛血清(美國 Hyclone公司)；二甲基亞砜、Transwell試劑盒(美國Sigma公司)；TPC-1細(xì)胞株(中國科學(xué)院細(xì)胞庫)；miR-637 mimic、miR-637陰性對照(NC)購自上海吉凱基因公司；LipofectamineTM2000、質(zhì)粒提取試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)試劑盒(美國Invitrogen公司)；CCK-8(碧云天公司)；兔抗人AKT3、β-actin抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Abcam公司)；熒光素酶活性檢測儀(德國Berthold公司)。

1.2miR-637與AKT3基因靶向關(guān)系的預(yù)測及驗(yàn)證運(yùn)用TargetScan對miR-637可能的靶基因進(jìn)行預(yù)測。然后，應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。由上海吉凱基因公司設(shè)計(jì)并合成AKT3的野生型(AKT3-WT)和突變型(AKT3-MUT)3’UTR雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，并分別連接到pmirGLO載體上，構(gòu)建成pmirGLO-AKT3-WT-3’UTR和pmirGLO-AKT3-MUT-3’UTR。按照LipofectamineTM2000操作指南操作，將pmirGLO-AKT3-WT-3’UTR或pmirGLO-AKT3-MUT-3’UTR聯(lián)合miR-637 mimic或miR-637 NC共轉(zhuǎn)染至TPC-1細(xì)胞中，24 h后檢測細(xì)胞的熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3實(shí)驗(yàn)分組TPC-1細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。調(diào)整細(xì)胞密度，以每孔1.0×104個(gè)/孔接種于96孔板中，分為空白對照組(不轉(zhuǎn)染)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染miR-637 NC)及miR-637組(轉(zhuǎn)染miR-637 mimic)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。按操作手冊進(jìn)行轉(zhuǎn)染，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染4～6 h，更換培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4Western blot法檢測細(xì)胞中AKT3蛋白的表達(dá)取3組細(xì)胞，RIPA裂解細(xì)胞并提取總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h后加入AKT3抗體(按1∶500稀釋)，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(按1∶500稀釋)，室溫孵育2 h。ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)中曝光。以目的條帶與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示AKT3相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力分組處理48 h后，用胰蛋白酶將miR-637組和空白對照組細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸液。在6孔培養(yǎng)板背面每隔0.5 cm畫橫線。分別在每孔中加入5×105個(gè)細(xì)胞，過夜。將直尺垂直于培養(yǎng)孔背后的橫線，用移液槍槍頭沿直尺在培養(yǎng)板上做劃痕，PBS溶液洗滌劃下的細(xì)胞，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，0、48 h后分別取樣拍照，使用Image J軟件分析劃痕寬度變化。細(xì)胞遷移率=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲能力分組處理48 h后，取miR-637組和空白對照組細(xì)胞，分別加入無血清培養(yǎng)基孵育12 h，消化并離心，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL。用基質(zhì)膠包被Transwell小室，在含有體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃孵育3 h，上室中加入細(xì)胞懸液100 μL，下室加入含體積分?jǐn)?shù)30%胎牛血清的培養(yǎng)液500 μL繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS液沖洗，用多聚甲醛固定并用結(jié)晶紫染色，然后于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野(×100)，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞，計(jì)算均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 22.0分析和處理數(shù)據(jù)。miR-637 NC組和miR-637 mimic組熒光素酶活性的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；空白對照組、陰性對照組及miR-637組AKT3蛋白相對表達(dá)量的比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)；miR-637組和空白對照組細(xì)胞遷移率及穿膜細(xì)胞數(shù)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1miR-637與AKT3靶向關(guān)系的驗(yàn)證TargetScan預(yù)測結(jié)果(圖1)說明miR-637能夠識別AKT3 mRNA 3’UTR的CCCCCAG序列，并與之互補(bǔ)配對。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表1)顯示，pmirGLO-AKT3-WT-3’UTR與miR-637 mimic共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞螢火蟲熒光素酶活性下調(diào)，表明miR-637通過與野生型AKT3 mRNA的3’UTR結(jié)合，促進(jìn)其降解，AKT3是miR-637的靶基因。

圖1 生物信息學(xué)預(yù)測miR-637和AKT3的靶向關(guān)系

表1 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.23組細(xì)胞中AKT3蛋白表達(dá)的比較Western blot結(jié)果見圖2?？瞻讓φ战M、陰性對照組及miR-637組AKT3蛋白相對表達(dá)量分別為(0.37±0.03)、(0.48±0.06)和(0.17±0.02)；3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=40.526，P<0.001)；與空白對照組和陰性對照組比較，miR-637組細(xì)胞AKT3蛋白相對表達(dá)量降低(P<0.05)。

A：空白對照組；B：陰性對照組；C：miR-637組

2.3劃痕實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3、圖4和表2。與空白對照組相比，miR-637組細(xì)胞遷移率和穿膜細(xì)胞數(shù)均明顯降低。

上：miR-637組；下：空白對照組

A、C：miR-637組；B、D:空白對照組

表2 2組細(xì)胞遷移率和侵襲細(xì)胞數(shù)的比較

3 討論

PTC患者可通過放/化療或外科手術(shù)進(jìn)行治療，但治療后存在生活質(zhì)量降低的風(fēng)險(xiǎn)[6]，并伴有預(yù)后不良或復(fù)發(fā)[7]，這主要是因?yàn)镻TC具有增殖異常、凋亡受阻、侵襲能力強(qiáng)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高等特性[8-9]。因此，進(jìn)一步探究PTC的發(fā)病機(jī)制，對臨床開發(fā)治療PTC的新方法至關(guān)重要。目前研究表明，已經(jīng)有多種miRNA通過調(diào)節(jié)其下游靶基因的表達(dá)影響PTC的發(fā)展：miR-128通過負(fù)調(diào)控鞘氨醇激酶1抑制PTC細(xì)胞的生長[10]；miR-146b-5p通過靶向結(jié)合 CCDC6，促進(jìn)PTC的發(fā)展[11]。miR-637是一個(gè)潛在的抑癌分子，且在人和小鼠中高度保守，可抑制膠質(zhì)瘤、黑色素瘤細(xì)胞的增殖，同時(shí)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12-13]。另外，已有研究證明miR-637能夠通過調(diào)控下游靶基因的表達(dá)發(fā)揮抗肝癌[14]、抗膽管癌[15]以及抗胰腺癌[16]的作用，但在PTC 中的作用尚不清楚。我們利用生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)miR-637與AKT3 mRNA的3’UTR 存在結(jié)合位點(diǎn)，提示AKT3可能是miR-637的靶基因；雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)兩者存在靶向關(guān)系。研究[17-20]表明，AKT3在多種癌癥中發(fā)揮原癌基因作用，如前列腺癌、肺癌、乳腺癌、食管癌等。miR-200a可通過抑制AKT3 mRNA的翻譯影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力[21]。上調(diào)miR-203可通過下調(diào)AKT3表達(dá)，抑制PTC細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲、增殖和遷移，誘導(dǎo)PTC細(xì)胞凋亡[22]。

我們以TPC-1細(xì)胞株為研究對象，應(yīng)用miR-637過表達(dá)技術(shù)，觀察其對AKT3表達(dá)的影響：Western blot檢測結(jié)果表明miR-637過表達(dá)能夠降低TPC-1細(xì)胞中AKT3蛋白的表達(dá)；劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-637過表達(dá)能夠抑制TPC-1細(xì)胞的侵襲和遷移能力。綜上所述，miR-637通過靶向作用于AKT3 mRNA的3’UTR，負(fù)性調(diào)控AKT3的表達(dá)，從而抑制甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞的侵襲和遷移能力。miR-637有望成為PTC治療的新靶點(diǎn)。