陳文東, 朱秀娟, 陳耀年， 葉文斌, 韓 強

(1.隴南師范高等?？茖W(xué)校 農(nóng)林技術(shù)學(xué)院， 甘肅 成縣 742500； 2.隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開發(fā)中心， 甘肅 成縣 742500； 3.成縣狗博士動物醫(yī)院， 甘肅 成縣 742500)

0 引言

油橄欖(OleaeuropaeaL.)原種植于地中海地區(qū)，又稱洋橄欖，屬木犀科木樨屬油料作物，我國自1956年開始引種油橄欖，種植區(qū)域主要分布在甘肅、四川、云南、廣東和廣西等地[1,2]，甘肅武都區(qū)作為我國最大的油橄欖種植基地之一，已被《國家地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)規(guī)定》(2015年)重點保護(hù)[3].油橄欖果實中榨取的橄欖油含有豐富的不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素、維生素、角鯊烯和多酚等活性物質(zhì)，可以保持健康的腸道菌群、養(yǎng)膚護(hù)膚、預(yù)防慢性疾病，被譽為“植物油皇后"和"液體黃金”[4].

隨著橄欖油市場需求的不斷增加，每年各地產(chǎn)出大量油橄欖果實附屬產(chǎn)物，油橄欖葉作為附屬產(chǎn)物之一，卻未被充分合理利用，有研究發(fā)現(xiàn)，油橄欖葉中含有多種酚類化合物生物活性物質(zhì)，包括裂環(huán)烯醚帖類、黃酮類化合物、咖啡酰苯乙醇苷類、木脂素類和簡單酚類等[5]，具有抗病毒、抗腫瘤、抗真菌、抗氧化、降血糖和保護(hù)心血管等功效[6,7].

本研究以油橄欖葉提取物(Oliveleavesextract,OLE)和常見四種病原菌為研究對象，初步探討油橄欖葉提取物的抑菌抗炎作用，為研究和開發(fā)替代抗生素的高效、低毒、低殘留純中藥制劑提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 藥物、菌種和培養(yǎng)基

油橄欖葉提取物，隴南田園油橄欖科技開發(fā)有限公司；阿司匹林，拜耳醫(yī)藥；舒泰50，法國維克；大腸埃希氏菌、糞腸球菌、溶血性鏈球菌和克雷伯氏肺炎菌，均來自腹瀉灰鶴的泄殖腔；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和普通瓊脂平板，上海博微生物科技有限公司，按微生物教材配制.

1.2 試劑和儀器

伊文斯蘭，Sigma；二甲苯，無水乙醇，乙酸，均購自天津大茂化學(xué)試劑廠；分析天平，上海精密科學(xué)儀器；分光光度計，上海屹譜；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮；鼓風(fēng)干燥箱，泰州天泰；電熱式壓力蒸汽滅菌器，上海新豐.

1.3 實驗動物

SPF級BALB/c小鼠，體重30～35 g，雌雄各半，購自蘭州獸醫(yī)研究所.

1.4 實驗方法

1.4.1 OLE水煎液制備

將50 g油橄欖葉提取物浸泡于500 mL蒸餾水內(nèi)半小時，電爐煮沸后繼續(xù)熬制30 min，將煎煮好的藥液分裝入10 mL離心管，2 500 r/min離心，將上清液保存，沉淀物再次熬制.混合兩次上清液并濃縮至50 mL，此時藥液含藥量為1 g/mL，121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌20 min，密封，置于4 ℃冰箱備用.

1.4.2 OLE對四種病原菌的抑制作用

(1)細(xì)菌懸液濃度的調(diào)整

超凈臺內(nèi)無菌操作，將已培養(yǎng)18 h的細(xì)菌懸液倍比稀釋，再將各濃度的細(xì)菌懸液分別涂布到普通瓊脂培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，精確數(shù)取各培養(yǎng)基內(nèi)的菌落數(shù)，根據(jù)培養(yǎng)基內(nèi)菌落個數(shù)調(diào)整細(xì)菌懸液濃度至5×106CFU/mL.

(2)OLE對細(xì)菌的MIC和MBC

超凈臺內(nèi)無菌操作，在九支試管內(nèi)分別加入3 mL普通肉湯培養(yǎng)基，然后在第一支試管內(nèi)加入3 mL OLE，混合均勻后，吸取3 mL液體至第二支試管，以此類推，梯度稀釋至第八支試管，第九支試管不加OLE，另取一支試管只加OLE 3 mL.最后在前九支試管內(nèi)分別加入上述已調(diào)整好濃度的菌液100μL，第十支試管加0.9%NaCl 100μL，旋渦混合器上混合均勻，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察各試管渾濁情況，記錄結(jié)果.以試管內(nèi)液體清亮透明為OLE的MIC，將確定MIC及與該試管前后相鄰試管內(nèi)的液體涂布于普通瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)計數(shù)，以普通瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)不超過5個菌落的試管濃度為OLE的MBC.

(3)OLE的抑菌圈

超凈臺內(nèi)無菌操作，在普通瓊脂培養(yǎng)基上涂布100μL調(diào)整好濃度的細(xì)菌懸液，然后再將三個牛津杯置于培養(yǎng)基上，每個牛津內(nèi)加OLE濃度為1 g/mL、0.5 g/mL、0.25 g/mL的藥液250μL，37 ℃培養(yǎng)24 h后測定抑菌圈直徑.直徑≥20 mm為細(xì)菌對OLE極敏感；20 mm>直徑≥15 mm為細(xì)菌對OLE高度敏感；15 mm>直徑≥10 mm為細(xì)菌對OLE中度敏感；直徑<10 mm為細(xì)菌對OLE無效.

1.4.3 OLE體內(nèi)抗炎作用

(1)OLE對小白鼠毛細(xì)血管通透性的影響

取50只小白鼠，雌雄各半，平均分成五組，第一組為高劑量組，每日灌胃0.2 g/mL OLE，第二組為中劑量組，每日灌胃0.1 g/mL OLE，第三組為低劑量組，每日灌胃0.05 g/mL OLE，第四組為陽性對照組，每日灌胃0.001 g/mL阿司匹林，第五組為空白對照組，每日灌胃0.1 g/mL 0.9%NaCl，各組灌胃量均為0.01 mL/g，連續(xù)灌胃7日.末次灌胃12 h后，將Evans blue溶液注入小白鼠血管內(nèi)，然后倒提小白鼠將冰乙酸注入腹腔，使小白鼠自由活動半小時后，斷頸致死，再將5 mL 0.9%NaCl注入小白鼠腹腔，按摩后，解剖小白鼠，移液器吸腹腔內(nèi)液體到離心管中，2 500 r/min離心10 min，用紫外分光光度計在590 nm波長下測上清液吸光度，記錄數(shù)據(jù)并計算通透性抑制率.通透性抑制率=(空白組吸光值-藥物組吸光值)/空白組吸光值×100%.

(2)OLE對小白鼠耳腫脹的影響

小白鼠分組及灌胃方法同1.4.3(1)，末次灌胃12 h后，在小白鼠一側(cè)耳廓的上下兩面分別滴涂10μL二甲苯，另一側(cè)耳廓作空白對照，半小時后將小白鼠斷頸致死，用打孔器將小白鼠左、右相同位置的耳廓打下，電子分析天平稱重，記錄數(shù)據(jù)并計算耳腫脹抑制率和腫脹度.

小白鼠耳腫脹度=滴二甲苯側(cè)耳廓質(zhì)量-空白對照側(cè)耳廓質(zhì)量；腫脹抑制率=(對照組平均腫脹度-滴二甲苯組平均腫脹度)/對照組平均腫脹度×100%.

(3)OLE對小白鼠棉球肉芽腫的影響

小白鼠分組同1.4.3(1)，小白鼠注射舒泰50麻醉，將小白鼠一側(cè)腹股溝背毛剃光，碘伏消毒后用剪刀剪一小口，然后用鑷子將滅菌后的脫脂棉球塞入皮下，常規(guī)縫合，12 h后灌胃給藥，灌胃方法同1.4.3(1)，末次灌胃12 h后，斷頸致死小白鼠，解剖出腹股溝皮下的脫脂棉球，置于烘箱內(nèi)干燥至恒重，記錄數(shù)據(jù)并計算肉芽腫質(zhì)量和增生抑制率.

肉芽腫質(zhì)量=棉球肉芽腫質(zhì)量-原棉球質(zhì)量；增生抑制率=(空白對照組肉芽腫平均質(zhì)量-OLE組肉芽腫平均質(zhì)量)/空白對照組肉芽腫平均質(zhì)量×100%[8].

(4)統(tǒng)計學(xué)分析

運用SPSS26.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SE)”表示；用單因子方差分析(One- way ANOVA,LSD)進(jìn)行差異顯著性檢驗.

2 結(jié)果與討論

2.1 體外抑菌作用

三個濃度的OLE分別作用于大腸埃希氏菌、糞腸球菌、溶血性鏈球菌和克雷伯氏肺炎菌.結(jié)果表明，1 g/mL、0.5 g/mL、0.25 g/mL的OLE對大腸埃希氏菌、糞腸球菌和溶血性鏈球菌具有一定的抑制作用，且濃度越高，抑菌效果越好，1 g/mL OLE對大腸埃希氏菌、糞腸球菌和溶血性鏈球菌的抑菌圈直徑分別為15.28 mm、17.59 mm和18.37 mm，均為高度敏感(如表1所示).OLE對大腸埃希氏菌的MIC和MBC為0.125 g/mL和0.25 g/mL，對糞腸球菌和溶血性鏈球菌的MIC和MBC均為0.062 5 g/mL和0.125 g/mL，OLE對克雷伯氏肺炎菌無抑制作用.表明OLE對三種病原菌具有一定的抑菌和殺菌作用(如表2所示).

表1 OLE抑菌直徑 (mm)

表2 OLE的MBC和MIC (mg/mL)

2.2 抗炎作用

2.2.1 OLE對小白鼠毛細(xì)血管通透性的影響

OLE對小白鼠毛細(xì)血管通透性升高抑制作用(如表3所示),高、中、低劑量和陽性對照組對毛細(xì)血管通透性升高抑制率分別為49.15%、35.88%、23.30%和53.40%.與空白對照組相比，陽性對照和OLE高劑量組對小白鼠毛細(xì)血管通透性的影響差異極顯著(P<0.01)，中劑量組對小白鼠毛細(xì)血管通透性的影響差異顯著(P<0.05)，OLE低劑量組與陽性對照存在顯著性差異(P<0.05)，其余各組之間相比無統(tǒng)計學(xué)意義，差異不顯著.

表3 OLE對小白鼠毛細(xì)血管通透性的影響

2.2.2 OLE對小白鼠耳腫脹的影響

OLE對小白鼠耳腫脹有抑制作用(如表4所示)，陽性對照和高、中、低劑量組的耳腫脹抑制率分別為59.63%、53.00%、31.34%和9.03%.與空白對照組相比，陽性對照和OLE高、中劑量組對小白鼠耳腫脹抑制作用極顯著 (P<0.01)，與陽性對照相比，OLE中、低劑量組抑制小白鼠耳腫脹作用極顯著(P<0.01)，OLE高劑量組與中劑量組存在顯著差異(P<0.05)，與低劑量組存在極顯著差異(P<0.01)，OLE中劑量組與低劑量組之間存在顯著性差異(P<0.05)，OLE高劑量組與陽性對照、低劑量組與空白對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義，差異不顯著.

表4 OLE對小白鼠耳腫脹的影響

2.2.3 OLE對小白鼠棉球肉芽腫的影響

OLE對小白鼠棉球肉芽腫增生有抑制作用(如表5所示),高、中、低劑量組和陽性對照組對小白鼠肉芽腫增生抑制率分別為55.27%、29.39%、23.96%和57.83%.與空白對照組相比，OLE高劑量組和陽性對照對小白鼠棉球肉芽腫增生有極顯著的抑制作用(P<0.01)，與低劑量組相比，陽性對照和高劑量組對小白鼠棉球肉芽腫增生有顯著的抑制作用(P<0.05)，其余各組之間相比無統(tǒng)計學(xué)意義，差異不顯著.

表5 OLE對小鼠棉球肉芽腫的影響

近年來，由于獸醫(yī)臨床上抗生素濫用現(xiàn)象嚴(yán)重，導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性情況急劇惡化，而我們研發(fā)新藥物的能力遠(yuǎn)趕不上細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的速度[9,10]，細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生嚴(yán)重危害人類和畜禽養(yǎng)殖業(yè)健康，已經(jīng)成為全球公認(rèn)的一大公共衛(wèi)生問題.Trotter A J等[11]預(yù)計如果不及時制止細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生，到2050年全球因細(xì)菌耐藥性而死亡的人數(shù)將達(dá)到1 000萬.因此，尋找一種高效、低毒、低殘留、無副作用的純中藥制劑來替代抗生素稱為當(dāng)前熱門議題.炎癥是機體對致炎因素引起的損傷所產(chǎn)生的以防御反應(yīng)為主的免疫應(yīng)答性反應(yīng)，常發(fā)生于各種組織，是十分常見而復(fù)雜的病理過程，臨床上動物傳染病、動物寄生蟲病、動物內(nèi)科病及外科病等都以炎癥為基礎(chǔ)[12].研究表明，白藜蘆醇、葛根素、姜黃素和苦參堿等天然化合物可改善肺部疾病哮喘[13]，中藥黃連的提取物黃連素能介導(dǎo)NF-κB信號通路緩解哮喘的呼吸道炎癥反應(yīng)[14]，也能減輕香煙煙霧引起的急性肺部炎癥[15,16].本研究以O(shè)LE和致四種病原菌為研究對象，初步探討OLE的抑菌抗炎作用，為研究和開發(fā)能替代抗生素的高效、低毒、低殘留、無副作用的純中藥制劑提供理論依據(jù)；為畜牧養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展，促進(jìn)動物綠色健康生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù).

3 結(jié)論

本研究以O(shè)LE和四種常見病原菌為研究對象，用試管二倍稀釋法和牛津杯法檢測OLE對病原菌的MIC、MBC和抑菌活性.結(jié)果表明,OLE對四種病原菌中的三種有一定的抑制生長作用，抗炎效果隨著藥物劑量的增加而增加.OLE對大腸埃希氏菌的MIC和MBC為0.125 g/mL和0.25 g/mL，對糞腸球菌和溶血性鏈球菌的MIC和MBC均為0.062 5 g/mL和0.125 g/mL.1 g/mLOLE對大腸埃希氏菌、糞腸球菌和溶血性鏈球菌的抑菌圈直徑分別為15.28 mm、17.59 mm和18.37 mm，均為高度敏感，OLE對克雷伯氏肺炎菌無抑制作用.

通過小白鼠毛細(xì)血管通透性試驗、小白鼠耳腫脹試驗和小白鼠棉球肉芽腫增生試驗測定OLE抗炎作用，分別測定通透性抑制率、小白鼠耳腫脹抑制率和棉球肉芽腫增生抑制率，評價OLE的抗炎效果.試驗結(jié)果表明，OLE對三種驗證模型均有抑制作用，且抗炎作用隨著OLE水煎液劑量的增大而增強.OLE水煎液高劑量組(2 g/kg)毛細(xì)血管通透性抑制率為49.15%，小白鼠耳腫脹抑制率53.00%，小白鼠棉球肉芽腫增生抑制率為55.27%，與空白對照組和陽性對照組相比存在極顯著性差異(P<0.01)，表明OLE有較好的抗炎作用，但抗炎效果不如阿司匹林.