王成云，馮均利，白爽，孫小穎，李泳濤，李勇，楊左軍

(深圳海關(guān)工業(yè)品檢測(cè)技術(shù)中心，廣東 深圳 518067)

皮革及其制品富含蛋白質(zhì)和油脂，易發(fā)生霉變，需進(jìn)行抗菌防霉整理以提高防霉性能。異噻唑啉酮類抗菌劑是一類高效、廣譜抗菌劑，首先由美國(guó)Rohm&Haas 公司取得專利權(quán)，抗菌機(jī)理是抗菌劑分子穿透微生物的細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，與核酸(RNA 和DNA)中的堿性基結(jié)合，抑制微生物的再生繁殖[1,2]。異噻唑啉酮類抗菌劑大量用于皮革及其制品的防霉整理[3-6]。但是，部分異噻唑啉酮具有接觸致敏性，長(zhǎng)期接觸時(shí)可導(dǎo)致接觸性皮炎、皮膚灼傷、濕疹、哮喘[7-19]。部分異噻唑啉酮類抗菌劑被證明對(duì)水生動(dòng)物具有急性毒性[20-22]，職業(yè)性接觸時(shí)甚至可導(dǎo)致中毒性肝病死亡[23]。因此各國(guó)紛紛立法限制其使用[24,25]，2012 年發(fā)布?xì)W盟生物殺滅產(chǎn)品法規(guī)(Biocidal Products Regulation,BPR)，禁止在皮革中使用2- 甲基 -4- 異噻唑啉 -3- 酮(2-methyl-4-isothiazolinone,MI)、1,2- 苯并異噻唑啉 -3- 酮(1,2-benzisothiazo- lin-3-one,BIT)、5- 氯 -2- 甲基 -4- 異噻唑啉 -3-酮(5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one, CMI)、2-丁基-1,2- 苯并異噻唑啉-3- 酮(2-butyl-1,2- benzisothiazolin-3-one, BBIT)、4,5- 二 氯 -2- 正 辛 基-4- 異噻唑啉-3- 酮 (4,5-dichloro-n-octyl-4- isothiazo-lin-3-one, DCOI)、2- 正辛基 -4- 異噻唑啉-3- 酮(2-n- octyl-4- isothiazolin-3-one, OI)等 6 種異噻唑啉酮類抗菌劑，2013 年 9 月 1 日起，BPR 禁用2- 甲基-1,2- 苯并異噻唑啉-3- 酮(2- methyl-1,2-benzisothiazolin-3-one,MBIT)。皮革中異噻唑啉酮的測(cè)定已有文獻(xiàn)報(bào)道[26-29]，但測(cè)試對(duì)象只涵蓋了部分限用異噻唑啉酮。本文采用超聲萃取技術(shù)提取皮革及其制品中的異噻唑啉酮類抗菌劑，提取液用固相萃取柱進(jìn)行凈化后進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)用分析，建立了1 個(gè)能同時(shí)測(cè)定皮革及其制品中7 種限用異噻唑啉酮類抗菌劑的氣質(zhì)聯(lián)用分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Shimazdu GCMS-TQ 8040MX 氣質(zhì)聯(lián)用儀 (日本Shimazdu 公司)；Retch SM2000 織物研磨儀 (德國(guó)Retch 公司)；MJ-600 型超聲波清洗機(jī)(無(wú)錫市美極超聲設(shè)備有限公司)；RV10 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(廣州市華馨科學(xué)儀器有限公司)；DCY-12 型氮吹儀(常州市萬(wàn)合儀器制造有限公司)；0.45μ m 聚四氟乙烯濾膜(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；supelclean LC-Ph 固相萃取柱(0.5g/3mL,美國(guó) supelco 公司)。

OI (純度 99.9%)、BIT (純度 99.2%)、MI (純度99.5%)均由美國(guó) Sigma-Aldrich 公司提供；DCOI(純度99.8%)由日本東京化成株式會(huì)社提供；MBIT(純度 98.0%)、BBIT(純度 95.0%)、CMI(純度 99.0%)均由德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司提供。色譜純甲醇由美國(guó)Merck 公司提供，用甲醇配制質(zhì)量濃度約為1000 g/mL 的各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，移取適量體積的各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液到25 mL 容量瓶中，用甲醇配制成混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中MI、DCOI、CMI、BIT、MBIT、BBIT、OI 的質(zhì)量濃度分別為 40.23、39.67、39.20、38.40、20.75、20.49、19.19 g/mL，用甲醇將其分別稀釋 2、5、10、20、50、100、200、400 倍，得到系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

陽(yáng)性樣品：市售黑色牛皮革，含有MI 和CMI。

1.2 樣品前處理

樣品前處理參照文獻(xiàn)[28]進(jìn)行，選取有代表性的樣品，切割成小塊后，用織物研磨儀粉碎成粉末。準(zhǔn)確稱取1.0 g 粉末，置于35 mL 玻璃反應(yīng)瓶中，加入25 mL 甲醇，40℃ 下超聲萃取 25 min，過(guò)濾，用雞心瓶收集濾液。將雞心瓶轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在真空下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。將雞心瓶轉(zhuǎn)移至氮吹儀中，用干燥氮?dú)饩徛蹈?，? mL 甲醇溶解殘?jiān)?。所得溶液轉(zhuǎn)移到已經(jīng)用5 mL 甲醇進(jìn)行預(yù)活化的supelclean LC-Ph 固相萃取柱(0.5g/3mL)中，用5 mL 甲醇淋洗，收集流出液，控制液體流出速度為2 滴/s。將流出液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用干燥氮?dú)饩徛蹈珊螅? mL 甲醇溶解殘留物，所得溶液用0.45μ m 濾膜過(guò)濾，供 GC/MS 分析用。

1.3 分析條件

1.3.1 色譜條件

RXi-5MS(30m× 0.25mm× 0.25μ m)色譜柱，初始溫度為90℃，以15℃/min 的速度升至280℃，保持3 min。傳輸線溫度、進(jìn)樣口溫度分別為280℃、270℃。不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1.0 L。載氣為高純氦氣(純度＞99.999%)，載氣流速為1.1 mL/min。溶劑延遲3.0 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電離方式為電子轟擊電離(EI)，電離能為70eV，四極桿溫度和離子源溫度分別為150℃、210℃。采用全掃描方式定性，選擇離子監(jiān)測(cè)方式(GC/MS-SIM)定量，7 種限用異噻唑啉酮類抗菌劑的特征離子和豐度比見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 凈化條件優(yōu)化

皮革基質(zhì)復(fù)雜，在超聲提取目標(biāo)分析物時(shí)，大量伴生雜質(zhì)也被提取出來(lái)，對(duì)儀器分析造成干擾，需要先進(jìn)行凈化處理[28，29]。固相萃取柱凈化技術(shù)是一種常用的凈化技術(shù)，但經(jīng)固相萃取柱凈化后，往往會(huì)損失部分目標(biāo)分析物，還可能會(huì)引入其他雜質(zhì)。分別考察了 Varian HF Bond C18SPE 柱 (2g/12mL) (1# 柱 )、Supelclean LC-18 SPE 柱 (1g/6mL)(2# 柱)、Supelclean LC-Si SPE 柱 (3g/6mL)(3# 柱)、Supelclean LC-Florisil SPE 柱 (1g/6mL)(4# 柱 )、Agilent Bond Elut C18柱(1g/6mL)(5# 柱)、Agilent Bond Elut Si SPE 柱(1g/6mL)(6# 柱)、Waters Sep-Pak Vac Silica 柱(1g/6mL)(7# 柱)、Anpelclean PA SPE 柱 (1g/6mL)(8# 柱 )、CNW Bond LC-C18SPE 柱 (1g/6mL)(9# 柱)、Supelclean ENVI-18 SPE 柱(0.5g/3mL)(10# 柱)、Agilent Bond Elut Al-N 中性氧化鋁柱(1g/6mL)(11# 柱)、Accu Bond Alumina 柱(1g/6mL) (12# 柱 )、Supelclean LC-Ph 柱 (0.5g/3mL)(13# 柱)、Waters Sep-Pak Vac C18柱 (0.5g/3mL)(14#柱)、Varian Bond Elut SCX 柱(0.5g/3mL)(15# 柱)、Accu Bond Florisil PR 柱(0.5g/3mL)(16# 柱)等 16 種固相萃取柱對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的處理效果，表2 給出了經(jīng)和未經(jīng)固相萃取柱處理的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液色譜峰面積百分比。從表2 可知，經(jīng)固相萃取柱凈化處理后，所有目標(biāo)分析物均有一定損失，其中經(jīng)supelclean LC-Ph 柱(0.5g/3mL)處理時(shí)損失最少，7 種目標(biāo)分析物的回收率均大于95%。比較經(jīng)16 種固相萃取柱凈化處理后的目標(biāo)分析物的譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)supelclean LC-Ph 柱(0.5g/3mL)凈化處理后，譜圖基線平穩(wěn)，基本無(wú)雜質(zhì)峰出現(xiàn)。因此，最終選擇supelclean LC-Ph 柱(0.5g/3mL)進(jìn)行凈化。

2.2 超聲萃取條件優(yōu)化

萃取溶劑種類、萃取溫度、萃取時(shí)間、萃取溶劑體積、萃取方式均對(duì)萃取量有影響[30]。以甲醇為萃取溶劑，對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行單次超聲萃取。首先單獨(dú)考察萃取溫度(因素A)、萃取時(shí)間(因素B)、萃取溶劑體積(因素C)對(duì)萃取量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)萃取量最大時(shí)萃取溫度、萃取時(shí)間、萃取溶劑體積的值分別為40℃、30 min、25 mL。為考察這3 個(gè)因素對(duì)萃取量的綜合影響，設(shè)計(jì)了表3 所示的三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，在表3 給出的9 個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行單次超聲萃取。根據(jù)表3 的數(shù)據(jù)計(jì)算各因素的k 值和極差[31]，確定優(yōu)方案，結(jié)果見(jiàn)表4。該陽(yáng)性樣品中含有MI 和CMI，對(duì)于 MI 和 CMI，其優(yōu)方案均為 A1B2C1。在此條件下，對(duì)該陽(yáng)性樣品連續(xù)萃取3 次，測(cè)定每次的萃取量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第1 次萃取時(shí)，萃取量占總萃取量的97%以上，第3 次萃取時(shí)，MI 和CMI 均未檢出。因此，最終選用單次超聲萃取方式。在此條件下選擇不同的溶劑進(jìn)行單次超聲萃取，考察MI 和CMI 萃取量的變化情況。皮革及其制品中含有大量脂肪，脂肪易溶于丙酮、正己烷、石油醚、叔丁基甲醚等弱極性溶劑，采用這些溶劑萃取時(shí)，萃取產(chǎn)物中夾雜有大量雜質(zhì)，干擾測(cè)試，因此不能使用這些溶劑來(lái)萃取。選擇極性較強(qiáng)的溶劑對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行萃取，結(jié)果見(jiàn)表5。從表5 可知，甲醇的萃取量最大。因此，超聲萃取條件最終優(yōu)化為：以25 mL 甲醇為萃取溶劑，40℃下超聲萃取25 min。

表1 特征離子及其豐度比

表2 經(jīng)固相萃取柱凈化后的回收率

表3 正交實(shí)驗(yàn)

表4 正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

表5 不同溶劑的萃取效果/mg/kg

2.3 分析條件的優(yōu)化

目標(biāo)分析物在色譜柱固定相和流動(dòng)相中的分配系數(shù)不同，氣相色譜分離時(shí)，目標(biāo)分析物通過(guò)在固定相和流動(dòng)相之間反復(fù)分配來(lái)實(shí)現(xiàn)各組分間的分離，影響分離效果的關(guān)鍵因素是固定相組成，此外，色譜柱長(zhǎng)度、固定相厚度也對(duì)分離效果有影響。采用RXi-5MS（30m× 0.25mm× 0.25μ m）、DB- 35MS（30m×0.25mm × 0.25μ m）、DB-5HT （15m × 0.25mm ×0.10μ m）、DB-624 （30m× 0.25mm× 4.10μ m）、DB-Wax （60m × 0.25mm × 0.25μ m）、DB-5MS（30m× 0.25mm× 0.25μ m）、DB-5MS（60m× 0.25mm×0.25μ m）、DB-17MS （30m× 0.25mm× 0.25μ m）等8 種常見(jiàn)色譜柱對(duì)7 種異噻唑啉酮類抗菌劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分離，改變載氣流速、升溫程序，觀察在不同色譜條件下的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用1.3.1 中的色譜條件時(shí)，分離效果最好。在此條件下對(duì)7 種限用異噻唑啉酮類抗菌劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，其GC/MS-SIM圖見(jiàn)圖1，7 種異噻唑啉酮類抗菌劑之間完全分離，各譜峰峰形尖銳，對(duì)稱性好。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的GC/MS-SIM圖

2.4 線性關(guān)系和檢出限

按1.3 給定的分析條件對(duì)系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測(cè)試，考察各組分峰面積(A)隨其質(zhì)量濃度(ρ )的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)于每種異噻唑啉酮類抗菌劑，在一定質(zhì)量濃度(ρ )范圍內(nèi)，其峰面積(A)均與質(zhì)量濃度(ρ )線性相關(guān)，其線性關(guān)系見(jiàn)表6。在3倍信噪比 (S/N =3) 的條件下計(jì)算方法的檢出限，OI、MBIT、BBIT 的檢出限均為 0.05 mg/kg，CMI、DCOI、MI、BIT 的檢出限均為 0.10 mg/kg。

表6 線性關(guān)系和檢出限(LOD)

2.5 回收率和精密度

以不含目標(biāo)分析物的牛皮革作為空白基質(zhì)，通過(guò)添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)制備3 個(gè)不同濃度水平的測(cè)試樣，每個(gè)濃度各制備9 個(gè)平行樣，按上述方法對(duì)各測(cè)試樣進(jìn)行測(cè)試，確定每個(gè)樣品中各組分的濃度，計(jì)算各組分的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=9)，結(jié)果見(jiàn)表7。7 種目標(biāo)分析物的加標(biāo)平均回收率為80.21%～95.87%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD, n=9)為1.26%～4.85%。

表7 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

2.6 實(shí)際樣品測(cè)試

采用本文建立的方法對(duì)32 個(gè)市售皮革和皮革制品樣品(羊皮革及其制品樣品8 個(gè)、牛皮革及其制品樣品17 個(gè)、豬皮革及其制品樣品7 個(gè))進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果在1 個(gè)黑色牛皮革樣品中同時(shí)檢出MI 和CMI，其余31 個(gè)樣品中則未檢出目標(biāo)分析物。圖2是該樣品的GC/MS-SIM圖，該圖中在tR=3.754min、tR=4.152min 處各出現(xiàn)1 個(gè)尖銳譜峰，分別對(duì)應(yīng)于MI和 CMI，其含量分別為 1.98、3.55 mg/kg。

圖2 1 個(gè)陽(yáng)性樣品的GC/MS-SIM圖

3 結(jié) 論

建立了1 個(gè)同時(shí)測(cè)定皮革及其制品中7 種限用異噻唑啉酮類抗菌劑的氣質(zhì)聯(lián)用分析方法，該方法采用超聲萃取技術(shù)提取皮革及其制品中殘留的異噻唑啉酮類抗菌劑，提取產(chǎn)物經(jīng)supelclean LC-Ph 柱(0.5g/3mL) 固相萃取柱凈化后直接進(jìn)行GC/MS-SIM測(cè)定，外標(biāo)法定量。該方法檢出限為0.05～0.10 mg/kg，遠(yuǎn)低于相關(guān)法規(guī)的限量要求。該方法簡(jiǎn)單快速，靈敏度高，檢出限低，可完全滿足皮革及其制品中限用異噻唑啉酮類抗菌劑日常檢測(cè)工作的需要。