羅 敏，徐 廣，譚秋生，章文偉，任星宇，鄧才富

(重慶市藥物種植研究所 中藥材質(zhì)量控制研究中心，重慶 408435)

藥用植物栽培中普遍存在一個(gè)突出問題：隨著藥用植物年齡增加或重茬、連作，植株生長不良，中藥材產(chǎn)量和品質(zhì)大幅度下降，如當(dāng)歸[1]、地黃[2]、三七[3]等。由于中藥材需求不斷增加，實(shí)行連作或復(fù)種連作的面積越來越大，加之占我國栽培品70%左右的根莖類中藥材中絕大部分均忌連作，因此，連作障礙已成為制約我國中藥材產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大問題。藥用植物連作障礙與其產(chǎn)生的化感物質(zhì)密切相關(guān)，植物化感自毒作用是發(fā)生連作障礙的重要因素之一，相關(guān)報(bào)道已證明蒼術(shù)[4]、當(dāng)歸[5]等中藥材的連作障礙與自毒作用有關(guān)。

本課題組前期在對半夏的栽培研究中發(fā)現(xiàn)，半夏連作后更容易患塊莖腐爛病，甚至有生育期縮短現(xiàn)象，嚴(yán)重影響藥農(nóng)和企業(yè)的種植積極性。連作障礙一直是制約半夏產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要原因，為半夏人工栽培發(fā)展的技術(shù)難題，因一直未能摸清其形成機(jī)理，故無法對癥下藥找準(zhǔn)良方。本研究通過對半夏及根際土壤化感效應(yīng)的初步研究，探索半夏不同浸提液對不同種子萌發(fā)化感效應(yīng)的差異性，以期為半夏化感作用研究提供理論依據(jù)，并為進(jìn)一步尋求植物間合理組合的生物防控技術(shù)來緩解連作障礙問題奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

半夏塊莖、地上部及土壤均采自連作2年的半夏試驗(yàn)地，土壤為半夏根際土壤。受體半夏種子于2018年6月采自試驗(yàn)地；白菜種子為四季小白菜(京研益農(nóng)種業(yè)科技有限公司)；狗尾草種子于2018年9月采自試驗(yàn)地周圍。

1.2 浸提液制備

半夏塊莖、地上部浸提液：將清洗晾干并去表皮的半夏塊莖、清洗晾干的半夏地上部，分別稱取200 g，充分研磨后分別加入1 000 mL蒸餾水，浸泡并振蕩提取24 h，過濾，濾液離心，上清液定容至1 000 mL，得相當(dāng)于200 mg/mL的半夏塊莖、地上部浸提母液；分別稀釋成25、50、100 mg/mL 3個(gè)質(zhì)量濃度梯度，以0 mg/mL為對照(CK)，各處理按照濃度從小到大依次編號(hào)，塊莖為CK、T25、T50、T100；地上部為CK、P25、P50、P100。

土壤浸提液：取200 g新鮮根際土壤，按照1∶2(w/v)的比例加入400 mL蒸餾水，充分振蕩后靜置過夜，離心取上清液，得相當(dāng)于500 mg/mL的根際土浸提母液；稀釋成50、100、250 mg/mL 3個(gè)質(zhì)量濃度梯度，以0 mg/mL為對照(CK)，各處理按照濃度從小到大依次編號(hào)為CK、S50、S100、S250。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

挑選籽粒飽滿、大小均勻一致的種子(半夏、白菜、狗尾草)，用10%雙氧水消毒1 min，用蒸餾水沖洗2～3次；將20粒種子均勻播種在墊有2層濾紙、直徑為9 mm的培養(yǎng)皿中，加入適量不同質(zhì)量濃度的浸提液，以液體不淹過種子為準(zhǔn)；每處理重復(fù)3次。將培養(yǎng)皿置于20℃、相對濕度60%的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。每天補(bǔ)加適量對應(yīng)的浸提液，以保證種子萌發(fā)及正常生長需要。

以胚根長度≥1 mm為種子萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)芽第6天計(jì)算發(fā)芽勢，第10天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。發(fā)芽勢=當(dāng)天發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子數(shù)×100%；發(fā)芽率=全部正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%?；行?yīng)分析參照Willamson和Richardson的化感效應(yīng)指數(shù)(RI)進(jìn)行，RI=T/C-1，式中T為測定值，C為對照值。當(dāng)RI>0時(shí)，為促進(jìn)作用；RI<0時(shí)，為抑制作用；RI絕對值的大小與作用強(qiáng)度一致[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 半夏塊莖浸提液的自毒化感效應(yīng)

由圖1和表1可知，半夏塊莖浸提液對半夏、白菜及狗尾草的種子萌發(fā)具有明顯影響。在本試驗(yàn)中，當(dāng)濃度為T100時(shí)，半夏的自毒抑制作用最強(qiáng)，其種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢均顯著低于對照，分別比對照降低18.41%和29.84%，其化感指數(shù)分別為-0.10和-0.27。另外，在較低濃度T25時(shí)，其發(fā)芽率化感指數(shù)RI為0.00，說明半夏塊莖浸提液低質(zhì)量濃度對其自身種子的萌發(fā)沒有影響或抑制作用不明顯。

圖1 不同濃度半夏塊莖浸提液對3種植物種子萌發(fā)的影響

半夏塊莖浸提液對白菜及狗尾草種子萌發(fā)的影響因濃度不同而存在差異。在T25時(shí)，二者的發(fā)芽率相對較高；且此時(shí)白菜、狗尾草種子發(fā)芽率的化感指數(shù)分別為0.005、0.02(>0)，說明低質(zhì)量濃度對二者種子的發(fā)芽率具有一定的促進(jìn)作用；而隨著濃度的升高，其發(fā)芽率和發(fā)芽勢均明顯降低。

2.2 半夏地上部分浸提液的自毒化感效應(yīng)

本試驗(yàn)半夏地上部分不包括珠芽和佛焰苞。由圖2和表2可知，地上部浸提液在低質(zhì)量濃度P25時(shí)對自身種子發(fā)芽率沒有影響，在高質(zhì)量濃度時(shí)則表現(xiàn)為抑制作用，且該抑制作用隨濃度的升高而增強(qiáng)。對半夏種子發(fā)芽勢的影響則表現(xiàn)為抑制作用，具有濃度效應(yīng)，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)100 mg/mL以上時(shí)抑制作用更顯著。

表2 半夏地上部不同濃度浸提液對3種植物種子萌發(fā)的化感指數(shù)

圖2 不同濃度半夏地上部浸提液對3種植物種子萌發(fā)的影響

半夏地上部浸提液對白菜及狗尾草種子的萌發(fā)具有明顯的抑制作用，且該抑制作用具有濃度效應(yīng)。不同濃度處理的白菜、狗尾草種子的發(fā)芽率均明顯低于對照，在P100時(shí)，分別比對照降低了11.45%、9.25%。對發(fā)芽勢的影響更顯著，隨著浸提液濃度的增加，二者發(fā)芽勢呈顯著下降趨勢；在最大質(zhì)量濃度P100時(shí)，分別比對照降低了38.30%、18.45%。白菜種子發(fā)芽勢對濃度變化更為敏感，在50 mg/mL時(shí)下降顯著。

2.3 連作半夏根際土壤浸提液的自毒化感效應(yīng)

半夏根際土壤浸提液對自身種子萌發(fā)的自毒效應(yīng)見圖3和表3。在本試驗(yàn)中低質(zhì)量濃度S50時(shí)，半夏種子發(fā)芽率與發(fā)芽勢均與對照無顯著差異，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)100 mg/mL后差異顯著，且S250時(shí)二者的化感指數(shù)分別為-0.25和-0.33。整體而言，半夏根際土壤浸提液對自身種子的萌發(fā)具有抑制作用，且該影響作用隨化感物質(zhì)溶液濃度的升高而增強(qiáng)。

半夏根際土壤不同濃度浸提液對白菜及狗尾草種子的萌發(fā)具有不同程度的影響。圖3和表3表明，不同濃度處理的白菜種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢均顯著低于對照，且隨著濃度的升高均呈明顯的下降趨勢，最大濃度時(shí)分別降低14.43%和46.42%。低濃度對狗尾草種子的萌發(fā)沒有影響或影響較小(RI=0.00)，但隨濃度升高，發(fā)芽率和發(fā)芽勢均不同程度地下降，S250時(shí)化感指數(shù)分別為-0.25和-0.15。以上均說明，半夏根際土壤化感物質(zhì)對白菜及狗尾草種子的萌發(fā)具有抑制作用。

圖3 不同濃度半夏根際土壤浸提液對3種植物種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的影響

表3 半夏根際土壤不同濃度浸提液對3種植物種子萌發(fā)的化感指數(shù)

3 結(jié)論與討論

前人通過對多種中藥材的研究，普遍認(rèn)為化感作用是生態(tài)系統(tǒng)中植物間自發(fā)進(jìn)行的化學(xué)調(diào)控，自毒現(xiàn)象是化感作用的重要形式之一[7-9]。在自然界中，化感物質(zhì)通過地上部雨水、霧滴淋溶、根系分泌物、植物殘茬分解機(jī)氣體揮發(fā)等途徑釋放的次生代謝產(chǎn)物在土壤中過度積累，從而對同一塊土地種植同種或同科植物生長產(chǎn)生危害。

本試驗(yàn)通過模擬雨水淋溶途徑研究發(fā)現(xiàn)，半夏塊莖、地上部分及根際土壤中化感物質(zhì)對受試種子的萌發(fā)具有化感作用，且不同部位、不同濃度的化感強(qiáng)度不同，不同作物的化感反應(yīng)亦有差異。低濃度(25 mg/mL)地上部浸提液對半夏種子發(fā)芽率沒有影響，但對發(fā)芽勢具有自毒抑制作用；而低濃度塊莖與根際土壤浸提液對半夏種子萌發(fā)均具有一定抑制作用，且該自毒抑制作用隨濃度的升高而增強(qiáng)。低濃度(25 mg/mL)塊莖浸提液對白菜種子萌發(fā)具有一定促進(jìn)作用，但與對照的差異不顯著。地上部及根際土壤浸提液對白菜種子萌發(fā)具有抑制作用，其中發(fā)芽勢對濃度變化更為敏感，在50 mg/mL時(shí)下降顯著。低濃度塊莖浸提液對狗尾草種子萌發(fā)具有促進(jìn)作用，而低濃度根際土壤浸提液對狗尾草種子的萌發(fā)沒有影響或影響較小，地上部浸提液具有明顯抑制作用。三種浸提液對受試種子萌發(fā)的抑制作用具有濃度效應(yīng)，均隨試驗(yàn)設(shè)置濃度的提高而逐漸增強(qiáng)。

相關(guān)研究表明，化感物質(zhì)在半夏不同組織中的含量存在差異，且不同部位浸提液對小麥種子萌發(fā)及幼苗生長具有化感作用，葉浸提液存在低濃度促進(jìn)、高濃度抑制現(xiàn)象[10]。半夏塊莖浸提液對白菜種子萌發(fā)及幼苗生長具有化感抑制作用[11]，而其根際土壤浸提液對白菜種子發(fā)芽率和胚根生長有化感促進(jìn)作用[12]。塊莖浸提液對巴天酸模、反齒莧和灰綠藜3種雜草發(fā)芽率的影響達(dá)顯著水平，且在浸提液中的化感物質(zhì)達(dá)到一定量時(shí)，化感物質(zhì)之間存在協(xié)同作用，而超過一定量則彼此之間存在拮抗作用[13]。在本研究中不同濃度對雜草狗尾草種子萌發(fā)的影響未達(dá)顯著水平，一方面說明或許狗尾草對半夏體內(nèi)的化感物質(zhì)具有一定的耐受性；另一方面或許是濃度設(shè)置不夠，此類猜想有待進(jìn)一步研究。

以上研究結(jié)果說明半夏及其連作土壤中存在抑制種子萌發(fā)的化感物質(zhì)，隨著種植年限的延長，大量的半夏根系分泌物及殘?bào)w腐解都會(huì)向土壤中釋放大量的化感物質(zhì)，從而抑制作物的生長，最終導(dǎo)致減產(chǎn)。因此，或許有望通過縮短半夏輪作間隔年限、與作物合理組合的生物防控技術(shù)改善生長環(huán)境相結(jié)合的方式來克服該連作障礙難題，此亦為下一步研究計(jì)劃。