白家玲，盧秀波

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院甲狀腺外科 鄭州 450052

甲狀腺髓樣癌(medullary thyroid cancer, MTC)起源于濾泡旁細(xì)胞，占甲狀腺惡性腫瘤的5%左右，是甲狀腺腫瘤中惡性程度較高的一種，預(yù)后相對較差[1]。MTC易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，腫塊可觸及的MTC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率大于75%[2]。研究[3]表明較高的惡性程度和因復(fù)發(fā)行二次手術(shù)等顯著降低了MTC患者的生存率，但目前臨床上缺乏MTC復(fù)發(fā)相關(guān)的預(yù)測指標(biāo)。為了更好地進(jìn)行風(fēng)險分層和制定個性化治療策略，研究相關(guān)的生物標(biāo)志物非常必要。

細(xì)胞角蛋白19(cytokeratin 19, CK-19)是一種主要標(biāo)記上皮的低相對分子質(zhì)量蛋白， 在正常甲狀腺濾泡中通常呈陰性表達(dá)，而在大部分甲狀腺乳頭狀癌組織中呈彌漫性陽性表達(dá)[4]，目前主要應(yīng)用于甲狀腺乳頭狀癌的輔助診斷。許多研究[5-9]證實CK-19在宮頸癌、甲狀腺癌、肺癌和肝癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用；CK-19表達(dá)水平已被證實是有價值的腫瘤標(biāo)志物，且其表達(dá)水平與腫瘤的侵襲及復(fù)發(fā)等有關(guān)。本研究通過分析129例MTC患者癌組織中CK-19的表達(dá)情況，探究其對MTC的臨床意義。

1 對象與方法

1.1研究對象選取2014年1月至2019年12月我院收治的MTC患者129例且行甲狀腺單側(cè)腺葉切除術(shù)或甲狀腺全切術(shù)且經(jīng)術(shù)后常規(guī)病理確診。排除接受過抗癌治療(包括手術(shù)治療或靶向藥物治療等)、合并乳頭狀癌、因癌灶侵犯重要神經(jīng)及血管行姑息切除的患者。其中男45例，女84例，年齡10～88(50.7±12.7)歲；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移79例(61.2%)，其中30例(23.2%)發(fā)生中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N1a),49例(38.0%)發(fā)生側(cè)區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N1b)；膜外侵犯30例(23.3%)；27例(20.9%)呈多灶性；54例(41.9%)TNM分期為Ⅰ或Ⅱ期，75例(58.1%)為Ⅲ或Ⅳ期。本研究經(jīng)我院倫理委員會審批。

1.2癌組織中CK-19表達(dá)的檢測手術(shù)切除的MTC組織標(biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)10%甲醛固定和石蠟包埋后切片，采用免疫組化SP法檢測CK-19表達(dá)情況。鼠抗人CK-19單克隆抗體、SP-9000試劑盒及DAB顯色試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，染色步驟按說明書進(jìn)行。以PBS代替一抗作為陰性對照。以已知CK-19陽性切片為陽性對照。由兩位以上經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師讀片并分析免疫組化染色結(jié)果。按染色強(qiáng)度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。按陽性細(xì)胞百分比評分：每張切片選取10個高倍視野計數(shù)陽性細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞百分比，0%～為0分，6%～為1分，26%～為2分，51%～為3分，76%～100%為4分。以兩項評分的乘積評價CK-19蛋白的表達(dá)強(qiáng)度，≤1分為陰性，>1分為陽性。

1.3隨訪收集患者臨床病歷資料，包括年齡、性別、既往史、手術(shù)日期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、有無膜外侵犯、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床分期等資料?；颊咝g(shù)后1個月、術(shù)后第一年每3個月、第二年每6個月復(fù)查血清降鈣素水平；患者術(shù)后第6個月行甲狀腺彩超檢查以評估局部復(fù)發(fā)及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，此后每12個月復(fù)查一次；對于有復(fù)發(fā)傾向或高危的患者復(fù)查胸片、腹部彩超、全身骨掃描，以評估肺、肝、骨轉(zhuǎn)移情況。以手術(shù)日期為起始日期，終點事件為復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)的定義為：血清降鈣素水平升高，基于影像學(xué)證據(jù)的局部復(fù)發(fā)和(或)基于組織學(xué)證據(jù)的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(部分選擇行再次手術(shù)的患者)[10]。隨訪終止日期為2020年3月1日。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。CK-19陽性和陰性患者年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)量、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、膜外侵犯和TNM分期情況的比較采用χ2檢驗或秩和檢驗。用Kaplan-Meier法繪制兩組無復(fù)發(fā)生存曲線并進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗。采用Cox比例風(fēng)險模型篩選復(fù)發(fā)影響因素。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1MTC患者癌組織中CK-19的表達(dá)情況129例中， CK-19陽性77例，陰性52例。CK-19陰性和陽性患者臨床病理特征的比較見表1。CK-19陽性組腫瘤直徑≥4 cm的患者比例、膜外侵犯率、N1b患者比例、Ⅳ期患者比例均高于CK-19陰性組。

表1 CK-19陽性和陰性的MTC患者臨床病理特征的比較 例

2.2CK-19陽性和陰性的MTC患者復(fù)發(fā)情況的比較隨訪2～72個月，45例(34.9%)患者復(fù)發(fā)，其中43例局部復(fù)發(fā)，2例遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)。CK-19陽性和陰性患者的Kaplan-Meier無復(fù)發(fā)生存曲線見圖1，log-rank檢驗結(jié)果顯示，CK-19陽性患者預(yù)后較陰性者差(χ2=14.205，P<0.001)。

圖1 CK-19陽性和陰性MTC患者的無復(fù)發(fā)生存曲線

對表1中的變量進(jìn)行共線性檢驗，結(jié)果顯示TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在強(qiáng)烈共線性(VIF=11.951。P<0.05)。最終以性別、腫瘤直徑、膜外侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為校正因素，以CK-19表達(dá)狀況為自變量，以復(fù)發(fā)為終點事件，進(jìn)行Cox回歸分析，結(jié)果表明，CK-19陽性表達(dá)是MTC術(shù)后復(fù)發(fā)的危險因素，HR(95%CI) 為 2.379(1.078～5.249)。

3 討論

MTC起源于濾泡旁C細(xì)胞，有散發(fā)性和家族性，多數(shù)為散發(fā)性[1]。MTC對促甲狀腺激素抑制療法及碘131治療均不敏感，因此手術(shù)切除病灶是目前最主要的治療方案[11]。MTC易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較乳頭狀癌差，術(shù)后再次復(fù)發(fā)的MTC患者預(yù)后相對更差，因此研究腫瘤標(biāo)志物對識別高風(fēng)險患者具有重要意義。

CK-19是一種主要標(biāo)記上皮的細(xì)胞角蛋白，在來源于甲狀腺濾泡上皮和卵巢上皮的腫瘤中，CK-19表達(dá)水平升高[12]。在本研究中，CK-19陽性表達(dá)的MTC患者有77例(59.7%)，且多呈局灶性表達(dá)。CK-19與上皮細(xì)胞的生長過程具有密切關(guān)系，在與上皮細(xì)胞穩(wěn)定性和細(xì)胞凋亡等相關(guān)的重要信號通路中也發(fā)揮調(diào)控作用。許多研究表明CK-19在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。有研究[13]證實肝細(xì)胞癌組織中CK-19蛋白與入侵相關(guān)基因的表達(dá)顯著相關(guān)。CK-19的降解片段Cyfra21-1在非小細(xì)胞肺癌治療反應(yīng)評價中的價值已被越來越多的研究肯定[14]。CK-19陽性的肝細(xì)胞癌患者不良預(yù)后風(fēng)險增加，且其表達(dá)與肝細(xì)胞癌的侵襲性和復(fù)發(fā)顯著相關(guān)[15]。有包膜浸潤或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺乳頭狀癌組織中CK-19陽性率高于無浸潤和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者[7]。本研究有類似發(fā)現(xiàn)，與CK-19陰性者相比，有膜外侵犯、側(cè)區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期Ⅳ期的患者中CK-19陽性表達(dá)率更高。這些研究結(jié)果提示CK-19可能與MTC的侵襲存在特定關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，與CK-19陰性者相比，CK-19陽性的MTC患者無復(fù)發(fā)生存時間縮短；Cox回歸分析結(jié)果表明，在校正性別、腫瘤直徑、膜外侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移后，CK-19陽性表達(dá)是MTC術(shù)后復(fù)發(fā)的危險因素，HR(95%CI) 為 2.379(1.078～5.249)。

本研究具有一定局限性。首先，本研究為單中心回顧性研究，結(jié)論還需要在其他中心及地區(qū)進(jìn)行驗證。其次，在研究對象的選擇上，我們盡力排除合并PTC的患者，但文獻(xiàn)調(diào)查發(fā)現(xiàn)MTC合并PTC時多為微小PTC，因此PTC患者不能完全被排除，可能存在病理結(jié)果偏倚[16]。此外，由于病例數(shù)較少，我們未能根據(jù)家族性及散發(fā)性MTC進(jìn)行分組比較。最后，對于CK-19的表達(dá)未能具體描述是局灶性表達(dá)還是彌漫性表達(dá)，因此不能明確不同程度的表達(dá)對結(jié)果的影響。

總之，癌組織中CK-19的表達(dá)與MTC膜外侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等關(guān)系密切，且CK-19陽性表達(dá)是MTC復(fù)發(fā)的危險因素；CK-19可能成為預(yù)測MTC患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。