董江鍇，黃青紅，范娟，黃迎燕，張?jiān)茲瑮顣悦鳎?

1.上海捷諾生物科技有限公司，上海201700；2.中國生物技術(shù)股份有限公司，北京100029；3.國家聯(lián)合疫苗工程技術(shù)研究中心武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，湖北武漢430207

自新型冠狀病毒（2019 new coronavirus，2019-nCoV）肺炎疫情暴發(fā)以來，各國監(jiān)管機(jī)構(gòu)和體外診斷試劑（in vitro diagnosis，IVD）企業(yè)陸續(xù)采取措施，積極助力疫情防控。疫情初期，針對武漢市不明原因肺炎病例快速增多的情況，上海捷諾生物科技有限公司采用獨(dú)家引進(jìn)的22 重肺炎微生物核酸檢測系統(tǒng)，率先了解到引起本次肺炎疫情可能為一種新型病原體。國內(nèi)多個(gè)研究機(jī)構(gòu)隨即確認(rèn)引起本次肺炎疫情爆發(fā)的病原體為一種新型的冠狀病毒［1-2］。2020 年1 月22 日國家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布《新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)指南（第二版）》，指導(dǎo)IVD 企業(yè)積極投入研發(fā)新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒［3］。國家藥品監(jiān)督局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心于2020 年2 月12 日對外發(fā)布《2019 新型冠狀病毒核酸檢測試劑注冊技術(shù)審評要點(diǎn)》對核酸檢測試劑盒檢測性能提出相應(yīng)要求［4］。同時(shí)世界衛(wèi)生組織（WHO）緊急修訂了Emergency Use Listing Procedure（《緊急使用清單（EUL）程序》）后發(fā)布《SARSCoV-2 核酸檢測試劑申報(bào)要求指南》［5］。鑒于2019-nCoV 高傳染性的特征，其核酸檢測試劑盒的檢測準(zhǔn)確度和敏感度在疾病診斷和疫情監(jiān)測方面顯得尤為重要。

我國與WHO、FDA 在檢測試劑最低檢測限研究方法中，制定的要求均采用核酸梯度稀釋、多次重復(fù)測定并獲得 ≥ 95%陽性檢出率的濃度水平［6-7］。另外，我國要求至少采用不同來源的3 個(gè)具有代表性的2019-nCoV 樣本或假病毒，以及另外3 個(gè)不同真實(shí)臨床樣本或核酸提取液，分別進(jìn)行最低檢測限確定和驗(yàn)證［3-4］。

由于目前國內(nèi)外尚無2019-nCoV 病毒核酸定量標(biāo)準(zhǔn)品，本研究將經(jīng)數(shù)字PCR 法進(jìn)行核酸絕對定量的不同類型臨床樣本作為定量參考品，通過多樣本、多次重復(fù)測定的方法，確定了上海捷諾生物科技有限公司研制生產(chǎn)的新型冠狀病毒2019-nCoV 核酸檢測試劑盒（熒光PCR 法）的最低檢測限，并對其進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 樣本 來自全國不同省份CDC 及臨床醫(yī)院的45份2019-nCoV 核酸陽性患者的痰液、鼻咽拭子及口咽拭子樣本（所有樣本均用數(shù)字PCR 進(jìn)行濃度定值）。

1.2 主要試劑及儀器 連續(xù)5 批新型冠狀病毒2019-nCoV 核酸檢測試劑盒（熒光PCR 法）（nCoV20-20001，失效日期：2020-08-26；nCoV2020002，失效日期：2020-09-03；nCoV2020003，失效日期：2020-09-04；nCoV-20-20004，失效日期：2020-09-20；nCoV2020005，失效日期：2020-09-20）均由上海捷諾生物科技有限公司生產(chǎn)；QIAamp Viral RNA Mini Kit（50）提取試劑盒（貨號：52904）購自德國QIAGEN 公司；核酸提取或純化試劑（貨號：DA0591）購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司；實(shí)時(shí)熒光PCR 儀（ABI 7500 型）購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.3 估計(jì)最低檢測限的確定 20 份不同陽性樣本核酸（5 份痰液樣本、5 份鼻咽拭子樣本和10 份口咽拭子樣本）分別稀釋至 62 500、12 500、2 500、500、100 copies ／ mL 5 個(gè)濃度梯度，用 nCoV2020002 批新型冠狀病毒2019-nCoV 核酸檢測試劑盒進(jìn)行檢測，均重復(fù)3 次，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)果判定：當(dāng)Ct 值 ≥ 37 或無Ct 值判定為陰性，當(dāng)Ct值＜37 判定為陽性，同1 份樣本中2019-nCoV ORF 1ab和N 基因檢測同時(shí)陽性，則該樣本判定為陽性，2個(gè)基因中任意一基因檢出為陽性，另一基因?yàn)殛幮詴r(shí)，復(fù)檢結(jié)果至少有1 個(gè)基因?yàn)殛栃裕瑒t該樣本判定為陽性。

1.4 最低檢測限的確定 在初步最低檢測限濃度附近設(shè)置5 個(gè)濃度梯度，將20 份不同陽性樣本核酸（5份痰液樣本、5 份鼻咽拭子樣本和10 份口咽拭子樣本）分別稀釋至 1 500、700、500、300、150 copies／mL 5 個(gè)濃度梯度，用 nCoV2020002、nCoV2020004 及 nCo-V2020005 批新型冠狀病毒2019-nCoV 核酸檢測試劑盒進(jìn)行檢測，均重復(fù)20 次，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)果判定：當(dāng)Ct 值≥37 或無Ct 值判定為陰性，當(dāng)Ct 值＜37 判定為陽性，同1 份樣本中2019-nCoV ORF1ab 和N 基因檢測同時(shí)陽性，則該樣本判定為陽性，2 個(gè)基因中任意一基因檢出為陽性，另一基因?yàn)殛幮詴r(shí)，復(fù)檢結(jié)果至少有1 個(gè)基因?yàn)殛栃裕瑒t該樣本判定為陽性。

1.5 最低檢測限的驗(yàn)證 另取25 份不同陽性樣本核酸（5 份痰液樣本、10 份鼻咽拭子樣本和10 份口咽拭子樣本）分別稀釋至確定的最低檢測限濃度（500 copies ／ mL），用 nCoV2020001、nCoV2020002及nCoV2020003 批新型冠狀病毒2019-nCoV 核酸檢測試劑盒進(jìn)行檢測，均重復(fù)20 次，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)果判定：當(dāng)Ct 值 ≥ 37 或無Ct 值判定為陰性，當(dāng)Ct 值＜37 判定為陽性，同一份樣本中2019-nCoV ORF1ab 和N 基因檢測同時(shí)陽性，則該樣本判定為陽性，2 個(gè)基因中任意一基因檢出為陽性，另一基因?yàn)殛幮詴r(shí)，復(fù)檢結(jié)果至少有1 個(gè)基因?yàn)殛栃?，則該樣本判定為陽性。

2 結(jié) 果

2.1 估計(jì)最低檢測限的確定 20 份陽性樣本檢測結(jié)果顯示，樣本濃度 ≥ 500 copies ／ mL 時(shí)，ORF1ab和N 基因3 次檢測結(jié)果均為陽性，且陽性檢出率均為100%；病毒核酸濃度為 100 copies ／ mL 時(shí)，陽性檢出率均≤55%。因此估計(jì)最低檢測限水平應(yīng)在500 copies ／ mL 附近。見表1。

表1 估計(jì)最低檢測限陽性檢出率結(jié)果統(tǒng)計(jì)（%，n = 20）Tab.1 Positive rate of samples for estimation of minimum detection limit（%，n = 20）

2.2 最低檢測限的確定 20 份陽性樣本檢測結(jié)果顯示，樣本濃度為 500 copies／mL 時(shí)，3 批試劑盒的陽性檢出率均≥95%，樣本濃度為300 及150 copies／mL時(shí)，3 批試劑盒陽性檢出率均 ≤ 35%，見表2 ～4。因此確定最低檢測限為500 copies ／ mL。

2.3 最低檢測限的驗(yàn)證 25 份陽性樣本3 批試劑盒重復(fù)20 次檢測結(jié)果顯示，3 種不同采樣途徑樣本的陽性檢出率均≥95%，見表5。因此，本試劑盒對最低檢測限水平的病毒樣本可有效檢出，驗(yàn)證合格。

表2 nCoV2020002 批試劑盒確定最低檢測限陽性檢出率結(jié)果統(tǒng)計(jì)（%，±s，n = 20）Tab.2 Positive rate of samples for determination of minimum detection limit of kit of Lot nCoV2020002（%，±s，n = 20）

表2 nCoV2020002 批試劑盒確定最低檢測限陽性檢出率結(jié)果統(tǒng)計(jì)（%，±s，n = 20）Tab.2 Positive rate of samples for determination of minimum detection limit of kit of Lot nCoV2020002（%，±s，n = 20）

樣本濃度（copies ／ mL）1 500 700 500 300 150痰液1 95 100 100 20 0 2 100 100 100 35 0 3 100 90 100 30 0 4 100 95 100 30 0 5 100 100 100 25 0鼻咽拭子6 100 100 95 15 0 7 100 100 95 20 30 8 100 100 100 30 30 9 100 100 100 30 10 10 100 100 100 20 20口咽拭子11 100 100 95 30 10 12 100 100 95 25 15 13 100 100 100 30 5 14 100 100 95 15 0 15 100 100 95 15 0 16 100 100 100 25 0 17 100 100 95 10 0 18 100 100 95 10 0 19 100 100 100 10 0 20 100 100 95 10 0樣本

表3 nCoV2020004 批試劑盒確定最低檢測限陽性檢出率結(jié)果統(tǒng)計(jì)（%，±s，n = 20）Tab.3 Positive rate of samples for determination of minimum detection limit of kit of Lot nCoV2020004（%，±s，n = 20）

表3 nCoV2020004 批試劑盒確定最低檢測限陽性檢出率結(jié)果統(tǒng)計(jì)（%，±s，n = 20）Tab.3 Positive rate of samples for determination of minimum detection limit of kit of Lot nCoV2020004（%，±s，n = 20）

樣本濃度（copies ／ mL）1 500 700 500 300 150痰液1 100 100 95 10 10 2 100 100 95 35 15 3 100 100 95 15 10 4 100 100 95 15 15 5 100 100 100 25 20鼻咽拭子6 100 100 100 25 5 7 100 100 100 20 15 8 100 100 95 15 20 9 100 100 95 25 10 10 100 100 95 0 10口咽拭子11 100 100 95 10 0 12 100 100 100 15 0 13 10 100 95 5 0 14 100 100 100 15 0 15 100 100 95 10 0 16 100 100 100 0 0 17 100 100 100 15 5 18 100 100 95 5 0 19 100 100 100 15 0 20 100 100 100 10 0樣本

表4 nCoV2020005 批試劑盒確定最低檢測限陽性檢出率結(jié)果統(tǒng)計(jì)（%，±s，n = 20）Tab.4 Positive rate of samples for determination of minimum detection limit of kit of Lot nCoV2020005（%，±s，n = 20）

表4 nCoV2020005 批試劑盒確定最低檢測限陽性檢出率結(jié)果統(tǒng)計(jì)（%，±s，n = 20）Tab.4 Positive rate of samples for determination of minimum detection limit of kit of Lot nCoV2020005（%，±s，n = 20）

樣本濃度（copies ／ mL）1 500 700 500 300 150痰液1 100 100 100 25 10 2 100 100 95 20 10 3 100 100 95 15 0 4 100 100 100 15 0 5 100 100 95 25 0鼻咽拭子6 100 100 100 15 0 7 100 100 95 20 0 8 100 100 95 25 0 9 100 100 100 20 0 10 100 100 95 25 20口咽拭子11 100 100 100 15 0 12 100 100 95 10 0 13 100 100 95 15 0 14 100 100 100 15 0 15 100 100 100 10 0 16 100 100 100 10 0 17 100 100 95 20 0 18 100 100 95 15 5 19 100 100 95 0 0 20 100 100 100 15 0樣本

表5 最低檢測限驗(yàn)證結(jié)果（%，±s，n = 20）Tab.5 Verification for minimum detection limit（%，±s，n=20）

表5 最低檢測限驗(yàn)證結(jié)果（%，±s，n = 20）Tab.5 Verification for minimum detection limit（%，±s，n=20）

樣本編號 樣本類型 nCOV2020001 nCOV2020002 nCOV2020003 1 鼻咽拭子 95 95 100 2 鼻咽拭子 100 100 95 3 鼻咽拭子 100 100 100 4 鼻咽拭子 100 95 95 5 鼻咽拭子 95 100 95 6 鼻咽拭子 100 95 100 7 鼻咽拭子 95 95 95 8 痰液 100 95 100 9 痰液 100 100 95 10 鼻咽拭子 100 95 95 11 鼻咽拭子 95 95 100 12 痰液 95 95 95 13 痰液 95 95 95 14 痰液 95 100 100 15 鼻咽拭子 95 95 95 16 口咽拭子 95 95 95 17 口咽拭子 100 95 95 18 口咽拭子 95 95 100 19 口咽拭子 100 95 95 20 口咽拭子 95 95 100 21 口咽拭子 95 95 100 22 口咽拭子 100 100 95 23 口咽拭子 100 95 95 24 口咽拭子 95 100 95 25 口咽拭子 100 100 100

3 討 論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 具有較高的敏感性，是檢測是否被2019-nCoV 感染或污染的有效手段［8-12］。目前我國批準(zhǔn)的2019-nCoV 核酸檢測試劑盒均為定性檢測試劑［13］。目前尚無2019-nCoV 病毒核酸檢測國際標(biāo)準(zhǔn)品，我國與WHO 對核酸試劑盒最低檢測限研究方法相關(guān)要求基本一致，在試劑盒注冊審評過程中，均要求采用科學(xué)的方法標(biāo)定病毒滴度或病毒拷貝數(shù)，進(jìn)行最低檢出限相關(guān)的定量研究。雖然中國食品藥品檢定研究院建立了應(yīng)急用國家參考品，用于評估所申報(bào)試劑的相對靈敏度，但并未對參考品進(jìn)行定值。數(shù)字PCR 法可對起始核酸樣本濃度進(jìn)行定量，是目前核酸分子絕對定量最成熟的技術(shù)［14-15］，但是昂貴的檢測成本限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。本研究利用微滴式數(shù)字PCR 平臺(tái)對臨床核酸樣本進(jìn)行絕對定量用于試劑盒最低檢測限的確立。準(zhǔn)確的最低檢測限的確立不僅是對方法及操作過程在低濃度水平檢測能力的準(zhǔn)確評估，對2019-nCoV 感染大規(guī)模篩查、流行病學(xué)調(diào)查及治療效果評價(jià)均具有重要意義［16-19］。

上海捷諾生物科技有限公司研制生產(chǎn)的新型冠狀病毒2019-nCoV 核酸檢測試劑盒（熒光PCR 法），可定性檢測2019-nCoV ORF1ab 和N 基因，用于2019-nCoV 疑似感染患者的鼻咽拭子、口咽拭子、痰液等多種采樣途徑樣本病毒檢測。在方法學(xué)驗(yàn)證過程中，本研究采用采集自不同地點(diǎn)、不同時(shí)間臨床確診2019-nCoV 患者的鼻咽拭子、口咽拭子及痰液樣本，經(jīng)數(shù)字PCR 法進(jìn)行病毒核酸絕對定量，對定量核酸樣本進(jìn)行不同稀釋度、多次重復(fù)以及應(yīng)用多批次檢測試劑盒進(jìn)行檢測，以確定其最低檢測限。結(jié)果表明，在樣本濃度≥500 copies ／ mL 時(shí)，陽性檢出率均≥95%，而樣本濃度 ＜ 500 copies ／ mL 時(shí)，陽性檢出率均＜95%，按照《2019 新型冠狀病毒核酸檢測試劑注冊技術(shù)審評要點(diǎn)》要求［4］，將 500 copies ／ mL 作為試劑盒的最低檢測限；經(jīng)驗(yàn)證，在最低檢測限水平上的鼻咽拭子、口咽拭子及痰液樣本陽性檢出率均可達(dá)95%以上，表明試劑盒適用于多種類型樣本2019-nCoV核酸檢測。最終確定的以500 copies ／ mL 作為本試劑盒最低檢測限是有效的，符合我國藥監(jiān)部門對檢測試劑盒最低檢測限研究的要求。

因目前尚無可進(jìn)行計(jì)量學(xué)溯源的2019-nCoV 國際標(biāo)準(zhǔn)品或國家標(biāo)準(zhǔn)品，因此無法將用于檢測的樣本進(jìn)行精確的計(jì)量學(xué)溯源。本研究利用經(jīng)數(shù)字PCR法絕對定量的特異性病毒陽性樣本，作為標(biāo)定試劑盒最低檢測限的參考品，進(jìn)行試劑盒最低檢測限的確定和驗(yàn)證，對核酸定性檢測試劑盒的檢測能力進(jìn)行了系統(tǒng)評價(jià)；期望能夠?qū)?019-nCoV 核酸檢測試劑盒的臨床應(yīng)用及疾病診斷提供更加詳細(xì)準(zhǔn)確的參考和判定方法。