劉書瑤，付曉蕓，雍智全，張傳維，鐘卓伶，黃 駿，徐小平，楊 明

(1.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川 成都 610041; 2.廣州安好醫(yī)藥科技有限公司，廣東 廣州 510700; 3.成都科美迪檢測檢驗有限公司，四川 成都 610041; 4.四川體育職業(yè)學(xué)院康復(fù)科研中心，四川 成都 610041)

0 引 言

碳點（CDs）是一種自帶熒光的新型零維納米聚合材料。因其原料易得、合成簡便、安全低毒、生物相容性良好、理化性質(zhì)和光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定[1-4]而備受人們關(guān)注，被廣泛應(yīng)用于活體成像、生化傳感、分析檢測、基因治療[5-8]等領(lǐng)域。DX1002為新型腫瘤血管抑制劑，主要作用于腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞微管蛋白，干擾細(xì)胞有絲分裂，產(chǎn)生秋水仙堿樣效應(yīng)，阻塞腫瘤血管，使腫瘤“斷養(yǎng)”餓死，目前處臨床試驗階段。建立高通量、高靈敏度、特異性的體內(nèi)分析方法是分析人員一直追求的目標(biāo)，而面對生物樣本存在的數(shù)量多、濃度低、雜質(zhì)干擾嚴(yán)重等難點，人們常采用色譜法（HPLC、GC）或色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。其中色譜法可避免大多數(shù)雜質(zhì)干擾而實現(xiàn)良好分離，但存在的前處理繁瑣、分析耗時長、靈敏度低等缺陷限制了應(yīng)用[9-10]。色質(zhì)聯(lián)用的出現(xiàn)與普及大大優(yōu)化了分析時間和分辨率，然而基質(zhì)效應(yīng)及對樣品預(yù)處理的高要求及長分析時間是這一方法的瑕疵[11-13]。要實現(xiàn)高通量分析，光譜法具有較為理想的檢測形式，而避免雜質(zhì)干擾是一個亟待跨越的瓶頸。如今，碳點獨(dú)有的熒光性、抗漂白性，使其與分析對象間存在唯一性、特異性關(guān)系。若供試品與碳點熒光變化量間存在定量關(guān)系，則可能構(gòu)建出適用于藥代動力學(xué)、刑偵檢測等靈敏度、特異性良好的高通量體內(nèi)檢測方法?；跓晒馓剂孔狱c的特性，本文擬優(yōu)化制備出與DX1002存在定量猝滅關(guān)系的熒光碳點，建立并驗證檸檬酸尿素碳點（CACCDs）探針與DX1002的體外定量關(guān)系，為DX1002高通量特異性體內(nèi)分析方法的建立提供體外定量的依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

RF-6000熒光分光光度計（日本島津分析儀器公司）；UV-2300紫外-可見分光光度計（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；LC-2010 HPLC儀（日本島津分析儀器公司）；Sartorios BT 125D十萬分之一電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；SHANGPING FA2004萬分之一電子天平（上海天平儀器廠）；KL 10260D型超聲清洗器（上海荊和分析儀器有限公司）；凈水機(jī)（成都品成科技有限公司）；902-ULTS酶標(biāo)儀（Thermo Fisher）；DHG-9電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；ZF-I型三用紫外分析儀（上海顧村電光儀器廠）；PHS-2F pH計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；馬弗爐（4-10箱式電阻爐，沈陽市節(jié)能電爐廠）；聚四氟乙烯內(nèi)襯高壓反應(yīng)釜KH型（上海予申儀器有限公司）；RE-52系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司）；冷凍干燥機(jī)（無錫沃鑫信儀器制造有限公司）；85-2型恒溫磁力攪拌器（上海思樂儀器有限公司）。

檸檬酸（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；尿素（分析純，湖南省芙蓉聯(lián)合制藥廠）；羅丹明6G（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；硫酸奎寧（98%，上海麥克林生化科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 檸檬酸尿素碳點（CACCDs）的制備

稱取1 g檸檬酸、1 g尿素，研磨混勻，混合粉末置于坩堝中，240 ℃加熱4 h，自然冷至室溫，加水150 mL，超聲溶解，過濾，得CACCDs溶液。

1.2.2 CACCDs的表征

取一定濃度的CACCDs溶液一滴，滴于銅網(wǎng)自然晾干后，用透射電鏡（TEM）觀察其形貌、粒徑，得到透射電鏡圖。取冷凍干燥的CACCDs粉末與溴化鉀粉末，一定比例混合均勻后壓制成透明薄片，紅外光譜儀測定紅外吸收光譜。取一定濃度的CACCDs溶液置于石英比色皿和熒光比色皿中，分別得紫外吸收光譜和熒光光譜。

1.2.3 DX1002的檢測

1）對照品溶液的制備

取DX1002對照品250 mg，精密稱定，置250 mL棕色容量瓶內(nèi)，超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每毫升含1 mg DX1002對照品溶液，作儲備液，備用。

2）供試品溶液的制備

取 DX1002（20181201）原料藥細(xì)粉 250 mg，精密稱定，置250 mL棕色容量瓶內(nèi)，超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為DX1002供試品溶液，備用。

3）DX1002的測定

依次精密量取CACCDs溶液（1 mg/mL）、上述DX1002溶液各50 μL于0.5 mL的EP管中，再精密加入超純水100 μL，混勻，轉(zhuǎn)移至96孔板，將加樣后的96孔板置酶標(biāo)儀中測定各孔熒光強(qiáng)度。熒光分光光度法條件為：激發(fā)波長（λex）：400 nm，發(fā)射波長（λem）：530 nm，狹縫寬度為12 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 CACCDs的工藝優(yōu)化

經(jīng)正交實驗考察加熱時間、加熱溫度、投料比3個條件，結(jié)果如表1所示，當(dāng)n（檸檬酸∶尿素）=1∶2，于250 ℃下加熱240 min時，合成產(chǎn)率及所得CACCDs量子產(chǎn)率最高，分別為26.00%和30.75%。確定了CACCDs最佳合成條件。

表 1 實驗因素考察

2.2 CACCDs的表征

圖1為CACCDs的表征圖，可以看出，CACCDs在透射電鏡下呈單分散的類球形顆粒，粒徑均一。由CACCDs在紅外吸收光譜的。3 301.58 cm-1處吸收峰歸屬于O-H和N-H的伸縮振動，1 055.83 cm-1處峰屬C-N伸縮振動，1 573.62 cm-1處峰屬N-H面內(nèi)彎曲振動，1 481.30 cm-1處峰屬C-O彎曲振動，表明制得的CACCDs主要含C、N、O等元素且碳點表面有較多的-OH和-NH。

圖 1 CACCDs表征圖

由圖2為CACCDs的紫外吸收和熒光光譜圖，可以看出，CACCDs紫外吸收光譜的最大紫外波長在280 nm處，由碳點C=C的π～π*躍遷產(chǎn)生。CACCDs的熒光強(qiáng)度隨著激發(fā)波長的增加而增強(qiáng)，而當(dāng)激發(fā)波長超過410 nm后，熒光強(qiáng)度反而隨著激發(fā)波長的增加呈明顯降低的趨勢，這可能是因為激發(fā)能量不足所致；以羅丹明6G為參比，計算得CACCDs量子產(chǎn)率約為26.00%。以上分析可知，CACCDs熒光性能良好。

圖 2 CACCDs的紫外吸收和和熒光光譜圖

2.3 CACCDs的熒光穩(wěn)定性

實驗考察了室溫下CACCDs貯存時間、紫外照射時間、體系pH值、鹽濃度、常見潛在共存物質(zhì)（K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe3+、蔗糖、葡萄糖、甘氨酸、亮氨酸、丙氨酸等）的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以上條件對CACCDs的熒光強(qiáng)度幾乎無影響，表明該碳點具有良好的熒光穩(wěn)定性。

2.4 DX1002猝滅CACCDs熒光的定量關(guān)系

實驗條件下 CACCDs于 λex/λem＝400/530處與DX1002猝滅效果最佳，此處CACCDs有較強(qiáng)熒光并在一定范圍內(nèi)隨DX1002溶液濃度的增加而減弱，如圖3所示。因此，后續(xù)實驗選擇激發(fā)波長為400 nm，發(fā)射波長為530 nm。

圖 3 CACCDs中加入不同濃度DX1002的熒光強(qiáng)度變化

2.5 DX1002檢測條件優(yōu)化

2.5.1 緩沖體系的影響

實驗考察了BR緩沖溶液體系pH值（2、3、4、5.8、6.8、7.4、7.8、8、9）對 DX1002檢測的影響(圖4)，結(jié)果表明，pH的變化對CACCDs與DX1002體系熒光猝滅程度無明顯影響，因此，體系中BR緩沖液可視情況加入。

圖 4 pH值對DX1002-CACCDs體系熒光強(qiáng)度影響

2.5.2 碳點CACCDs濃度優(yōu)化

考察CACCDs濃度對體系熒光測定結(jié)果的影響 (圖 5)，當(dāng) CACCDs的濃度為 0.250 mg/mL時，直線斜率最大，靈敏度最高。

圖 5 CACCDs的濃度對DX1002-CACCDs體系的影響

2.5.3 反應(yīng)時間優(yōu)化

室溫下考察反應(yīng)時間對體系的影響，發(fā)現(xiàn)CACCDs熒光強(qiáng)度在加入DX1002后立即下降，猝滅程度幾乎不受反應(yīng)時間影響。

2.6 方法學(xué)驗證

2.6.1 專屬性

1)常見共存物質(zhì)影響

當(dāng)相對誤差在±5.0%以內(nèi)，CACCDs濃度為250 μg/mL，DX1002 濃度為 50 μg/mL 時，考察了常見細(xì)胞陽離子、微量金屬離子、糖類、氨基酸等潛在共存物質(zhì)對測定結(jié)果的影響，結(jié)果見表2。

表 2 共存物質(zhì)的影響

可看出，上述潛在共存物質(zhì)對DX1002-CACCDs體系的熒光信號幾乎無影響，說明方法選擇性及抗干擾能力好，可用來檢測DX1002的含量。

2)有關(guān)物質(zhì)的影響

將起始原料異香草醛、三甲氧基苯乙酸以及DX1002順式異構(gòu)體代替DX1002分別加入待測體系中，考察其對CACCDs熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，異香草醛和DX1002順式異構(gòu)體可猝滅CACCDs熒光，且在一定范圍內(nèi)存在線性關(guān)系，三甲氧基苯乙酸對CACCDs熒光強(qiáng)度干擾較小。雜質(zhì)的限度要求為0.1%，上述物質(zhì)在該含量存在時均不會干擾DX1002的測定，方法專屬性良好。

2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及精密度

在最佳實驗條件下繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，體系 ΔF(ΔF=F0-F)與DX1002 濃度在 2.5～75 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為ΔF=0.805C-0.506 8，相關(guān)系數(shù)r2=0.998 8，檢出限為1.16 μg/mL。對同一供試品溶液進(jìn)行6次平行測定，方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.82%。

2.6.3 重復(fù)性試驗

分別測定不同濃度的DX1002(20181201)供試品溶液，按“1.2.3”項下DX1002測定方法操作，結(jié)果表明在24.99～49.98 μg/mL DX1002濃度范圍的低、中、高濃度溶液中重復(fù)性精密度為1.89%。

2.6.4 加標(biāo)回收率實驗

取重復(fù)性中配制的高、中、低濃度DX1002(20181201)供試品溶液各3份，按1.2.3的DX1002測定方法操作，結(jié)果如表3所示，低、中、高濃度DX1002溶液的平均回收率為101.7%（RSD=2.08%）。

表 3 回收率結(jié)果

2.7 樣品測定

利用本法對三批DX1002樣品（20181201）、（20180501）、（20180301）進(jìn)行測定，結(jié)果如表 4。

表 4 樣品測定結(jié)果%

2.8 與HPLC含量測定結(jié)果的比較

2.8.1 HPLC測定法

取 DX1002（20181201）原料藥細(xì)粉 250 mg，精密稱定，加適量流動相超聲，完全溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL的棕色容量瓶中，流動相定容至刻度。精密量取適量，加流動相稀釋成每毫升含25 μg DX1002原料藥的供試品溶液，備用。另取DX1002對照品250 mg，精密稱定，同法，加流動相稀釋成每毫升含25 μg DX1002對照品溶液，備用。分別精密量取DX1002的對照品溶液和供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀，以 Platisil ODS 柱（150mm×4.6mm，5μm）為色譜柱，0.1%甲酸甲醇∶0.1%甲酸水溶液=70∶30（V/V）為流動相，0.5 mL/min的流量進(jìn)行分離，于314 nm檢測，記錄色譜圖，以峰面積外標(biāo)法計算DX1002的含量，測得DX1002（20181201）原料藥的平均含量為99.4%（RSD=1.19%）。

2.8.2 方法比較

由表5可知，HPLC法與本法測得的DX1002的含量基本吻合（P＞0.05），RSD小于2%，單樣本分析時間比較可知，本法分析速度較HPLC法快75倍，體現(xiàn)出本法的高通量、特異性、高靈敏度等特點。

表 5 兩種方法含量測定結(jié)果1)（n=3）

3 結(jié)束語

針對腫瘤血管抑制劑DX1002的含量測定，本文構(gòu)建了一種基于新型納米碳點材料（CDs）的特異性熒光定量方法。以檸檬酸、尿素為原料，經(jīng)工藝優(yōu)化、條件篩選，得到自發(fā)熒光可被DX1002特異性猝滅的CACCDs，且在一定范圍內(nèi)，體系ΔF值(ΔF=F0-F)與DX1002濃度存在良好的線性關(guān)系，以此為根據(jù)構(gòu)建了DX1002體外特異性熒光定量方法。本法可實現(xiàn)DX1002含量的快速、靈敏、特異性體外定量檢測，檢測結(jié)果與經(jīng)典的HPLC法基本吻合（P＞0.05），分析速度卻較HPLC法快約75倍。體內(nèi)分析常采用的色譜法或色-質(zhì)聯(lián)用等方法存在著生物樣本前處理繁瑣、分析耗時長、靈敏度低等缺陷，本文利用DX1002與碳量子點間存在的熒光定量猝滅關(guān)系建立的體外定量方法，可為DX1002高通量特異性體內(nèi)分析檢測方法的建立提供依據(jù)，并為其他與熒光碳點存在定量猝滅關(guān)系物質(zhì)的含量測定提供了思路。