劉書瑤,付曉蕓,雍智全,張傳維,鐘卓伶,黃 駿,徐小平,楊 明
(1.四川大學(xué)華西藥學(xué)院,四川 成都 610041; 2.廣州安好醫(yī)藥科技有限公司,廣東 廣州 510700; 3.成都科美迪檢測檢驗有限公司,四川 成都 610041; 4.四川體育職業(yè)學(xué)院康復(fù)科研中心,四川 成都 610041)
碳點(CDs)是一種自帶熒光的新型零維納米聚合材料。因其原料易得、合成簡便、安全低毒、生物相容性良好、理化性質(zhì)和光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定[1-4]而備受人們關(guān)注,被廣泛應(yīng)用于活體成像、生化傳感、分析檢測、基因治療[5-8]等領(lǐng)域。DX1002為新型腫瘤血管抑制劑,主要作用于腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞微管蛋白,干擾細(xì)胞有絲分裂,產(chǎn)生秋水仙堿樣效應(yīng),阻塞腫瘤血管,使腫瘤“斷養(yǎng)”餓死,目前處臨床試驗階段。建立高通量、高靈敏度、特異性的體內(nèi)分析方法是分析人員一直追求的目標(biāo),而面對生物樣本存在的數(shù)量多、濃度低、雜質(zhì)干擾嚴(yán)重等難點,人們常采用色譜法(HPLC、GC)或色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。其中色譜法可避免大多數(shù)雜質(zhì)干擾而實現(xiàn)良好分離,但存在的前處理繁瑣、分析耗時長、靈敏度低等缺陷限制了應(yīng)用[9-10]。色質(zhì)聯(lián)用的出現(xiàn)與普及大大優(yōu)化了分析時間和分辨率,然而基質(zhì)效應(yīng)及對樣品預(yù)處理的高要求及長分析時間是這一方法的瑕疵[11-13]。要實現(xiàn)高通量分析,光譜法具有較為理想的檢測形式,而避免雜質(zhì)干擾是一個亟待跨越的瓶頸。如今,碳點獨(dú)有的熒光性、抗漂白性,使其與分析對象間存在唯一性、特異性關(guān)系。若供試品與碳點熒光變化量間存在定量關(guān)系,則可能構(gòu)建出適用于藥代動力學(xué)、刑偵檢測等靈敏度、特異性良好的高通量體內(nèi)檢測方法?;跓晒馓剂孔狱c的特性,本文擬優(yōu)化制備出與DX1002存在定量猝滅關(guān)系的熒光碳點,建立并驗證檸檬酸尿素碳點(CACCDs)探針與DX1002的體外定量關(guān)系,為DX1002高通量特異性體內(nèi)分析方法的建立提供體外定量的依據(jù)。
RF-6000熒光分光光度計(日本島津分析儀器公司);UV-2300紫外-可見分光光度計(上海天美科學(xué)儀器有限公司);LC-2010 HPLC儀(日本島津分析儀器公司);Sartorios BT 125D十萬分之一電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司);SHANGPING FA2004萬分之一電子天平(上海天平儀器廠);KL 10260D型超聲清洗器(上海荊和分析儀器有限公司);凈水機(jī)(成都品成科技有限公司);902-ULTS酶標(biāo)儀(Thermo Fisher);DHG-9電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司);ZF-I型三用紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠);PHS-2F pH計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司);馬弗爐(4-10箱式電阻爐,沈陽市節(jié)能電爐廠);聚四氟乙烯內(nèi)襯高壓反應(yīng)釜KH型(上海予申儀器有限公司);RE-52系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司);冷凍干燥機(jī)(無錫沃鑫信儀器制造有限公司);85-2型恒溫磁力攪拌器(上海思樂儀器有限公司)。
檸檬酸(分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);尿素(分析純,湖南省芙蓉聯(lián)合制藥廠);羅丹明6G(分析純,上海麥克林生化科技有限公司);硫酸奎寧(98%,上海麥克林生化科技有限公司)。
1.2.1 檸檬酸尿素碳點(CACCDs)的制備
稱取1 g檸檬酸、1 g尿素,研磨混勻,混合粉末置于坩堝中,240 ℃加熱4 h,自然冷至室溫,加水150 mL,超聲溶解,過濾,得CACCDs溶液。
1.2.2 CACCDs的表征
取一定濃度的CACCDs溶液一滴,滴于銅網(wǎng)自然晾干后,用透射電鏡(TEM)觀察其形貌、粒徑,得到透射電鏡圖。取冷凍干燥的CACCDs粉末與溴化鉀粉末,一定比例混合均勻后壓制成透明薄片,紅外光譜儀測定紅外吸收光譜。取一定濃度的CACCDs溶液置于石英比色皿和熒光比色皿中,分別得紫外吸收光譜和熒光光譜。
1.2.3 DX1002的檢測
1)對照品溶液的制備
取DX1002對照品250 mg,精密稱定,置250 mL棕色容量瓶內(nèi),超純水溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得每毫升含1 mg DX1002對照品溶液,作儲備液,備用。
2)供試品溶液的制備
取 DX1002(20181201)原料藥細(xì)粉 250 mg,精密稱定,置250 mL棕色容量瓶內(nèi),超純水溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為DX1002供試品溶液,備用。
3)DX1002的測定
依次精密量取CACCDs溶液(1 mg/mL)、上述DX1002溶液各50 μL于0.5 mL的EP管中,再精密加入超純水100 μL,混勻,轉(zhuǎn)移至96孔板,將加樣后的96孔板置酶標(biāo)儀中測定各孔熒光強(qiáng)度。熒光分光光度法條件為:激發(fā)波長(λex):400 nm,發(fā)射波長(λem):530 nm,狹縫寬度為12 nm。
經(jīng)正交實驗考察加熱時間、加熱溫度、投料比3個條件,結(jié)果如表1所示,當(dāng)n(檸檬酸∶尿素)=1∶2,于250 ℃下加熱240 min時,合成產(chǎn)率及所得CACCDs量子產(chǎn)率最高,分別為26.00%和30.75%。確定了CACCDs最佳合成條件。
表 1 實驗因素考察
圖1為CACCDs的表征圖,可以看出,CACCDs在透射電鏡下呈單分散的類球形顆粒,粒徑均一。由CACCDs在紅外吸收光譜的。3 301.58 cm-1處吸收峰歸屬于O-H和N-H的伸縮振動,1 055.83 cm-1處峰屬C-N伸縮振動,1 573.62 cm-1處峰屬N-H面內(nèi)彎曲振動,1 481.30 cm-1處峰屬C-O彎曲振動,表明制得的CACCDs主要含C、N、O等元素且碳點表面有較多的-OH和-NH。
圖 1 CACCDs表征圖
由圖2為CACCDs的紫外吸收和熒光光譜圖,可以看出,CACCDs紫外吸收光譜的最大紫外波長在280 nm處,由碳點C=C的π~π*躍遷產(chǎn)生。CACCDs的熒光強(qiáng)度隨著激發(fā)波長的增加而增強(qiáng),而當(dāng)激發(fā)波長超過410 nm后,熒光強(qiáng)度反而隨著激發(fā)波長的增加呈明顯降低的趨勢,這可能是因為激發(fā)能量不足所致;以羅丹明6G為參比,計算得CACCDs量子產(chǎn)率約為26.00%。以上分析可知,CACCDs熒光性能良好。
圖 2 CACCDs的紫外吸收和和熒光光譜圖
實驗考察了室溫下CACCDs貯存時間、紫外照射時間、體系pH值、鹽濃度、常見潛在共存物質(zhì)(K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe3+、蔗糖、葡萄糖、甘氨酸、亮氨酸、丙氨酸等)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),以上條件對CACCDs的熒光強(qiáng)度幾乎無影響,表明該碳點具有良好的熒光穩(wěn)定性。
實驗條件下 CACCDs于 λex/λem=400/530處與DX1002猝滅效果最佳,此處CACCDs有較強(qiáng)熒光并在一定范圍內(nèi)隨DX1002溶液濃度的增加而減弱,如圖3所示。因此,后續(xù)實驗選擇激發(fā)波長為400 nm,發(fā)射波長為530 nm。
圖 3 CACCDs中加入不同濃度DX1002的熒光強(qiáng)度變化
2.5.1 緩沖體系的影響
實驗考察了BR緩沖溶液體系pH值(2、3、4、5.8、6.8、7.4、7.8、8、9)對 DX1002檢測的影響(圖4),結(jié)果表明,pH的變化對CACCDs與DX1002體系熒光猝滅程度無明顯影響,因此,體系中BR緩沖液可視情況加入。
圖 4 pH值對DX1002-CACCDs體系熒光強(qiáng)度影響
2.5.2 碳點CACCDs濃度優(yōu)化
考察CACCDs濃度對體系熒光測定結(jié)果的影響 (圖 5),當(dāng) CACCDs的濃度為 0.250 mg/mL時,直線斜率最大,靈敏度最高。
圖 5 CACCDs的濃度對DX1002-CACCDs體系的影響
2.5.3 反應(yīng)時間優(yōu)化
室溫下考察反應(yīng)時間對體系的影響,發(fā)現(xiàn)CACCDs熒光強(qiáng)度在加入DX1002后立即下降,猝滅程度幾乎不受反應(yīng)時間影響。
2.6.1 專屬性
1)常見共存物質(zhì)影響
當(dāng)相對誤差在±5.0%以內(nèi),CACCDs濃度為250 μg/mL,DX1002 濃度為 50 μg/mL 時,考察了常見細(xì)胞陽離子、微量金屬離子、糖類、氨基酸等潛在共存物質(zhì)對測定結(jié)果的影響,結(jié)果見表2。
表 2 共存物質(zhì)的影響
可看出,上述潛在共存物質(zhì)對DX1002-CACCDs體系的熒光信號幾乎無影響,說明方法選擇性及抗干擾能力好,可用來檢測DX1002的含量。
2)有關(guān)物質(zhì)的影響
將起始原料異香草醛、三甲氧基苯乙酸以及DX1002順式異構(gòu)體代替DX1002分別加入待測體系中,考察其對CACCDs熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明,異香草醛和DX1002順式異構(gòu)體可猝滅CACCDs熒光,且在一定范圍內(nèi)存在線性關(guān)系,三甲氧基苯乙酸對CACCDs熒光強(qiáng)度干擾較小。雜質(zhì)的限度要求為0.1%,上述物質(zhì)在該含量存在時均不會干擾DX1002的測定,方法專屬性良好。
2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及精密度
在最佳實驗條件下繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果表明,體系 ΔF(ΔF=F0-F)與DX1002 濃度在 2.5~75 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為ΔF=0.805C-0.506 8,相關(guān)系數(shù)r2=0.998 8,檢出限為1.16 μg/mL。對同一供試品溶液進(jìn)行6次平行測定,方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.82%。
2.6.3 重復(fù)性試驗
分別測定不同濃度的DX1002(20181201)供試品溶液,按“1.2.3”項下DX1002測定方法操作,結(jié)果表明在24.99~49.98 μg/mL DX1002濃度范圍的低、中、高濃度溶液中重復(fù)性精密度為1.89%。
2.6.4 加標(biāo)回收率實驗
取重復(fù)性中配制的高、中、低濃度DX1002(20181201)供試品溶液各3份,按1.2.3的DX1002測定方法操作,結(jié)果如表3所示,低、中、高濃度DX1002溶液的平均回收率為101.7%(RSD=2.08%)。
表 3 回收率結(jié)果
利用本法對三批DX1002樣品(20181201)、(20180501)、(20180301)進(jìn)行測定,結(jié)果如表 4。
表 4 樣品測定結(jié)果%
2.8.1 HPLC測定法
取 DX1002(20181201)原料藥細(xì)粉 250 mg,精密稱定,加適量流動相超聲,完全溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL的棕色容量瓶中,流動相定容至刻度。精密量取適量,加流動相稀釋成每毫升含25 μg DX1002原料藥的供試品溶液,備用。另取DX1002對照品250 mg,精密稱定,同法,加流動相稀釋成每毫升含25 μg DX1002對照品溶液,備用。分別精密量取DX1002的對照品溶液和供試品溶液各20μL,注入液相色譜儀,以 Platisil ODS 柱(150mm×4.6mm,5μm)為色譜柱,0.1%甲酸甲醇∶0.1%甲酸水溶液=70∶30(V/V)為流動相,0.5 mL/min的流量進(jìn)行分離,于314 nm檢測,記錄色譜圖,以峰面積外標(biāo)法計算DX1002的含量,測得DX1002(20181201)原料藥的平均含量為99.4%(RSD=1.19%)。
2.8.2 方法比較
由表5可知,HPLC法與本法測得的DX1002的含量基本吻合(P>0.05),RSD小于2%,單樣本分析時間比較可知,本法分析速度較HPLC法快75倍,體現(xiàn)出本法的高通量、特異性、高靈敏度等特點。
表 5 兩種方法含量測定結(jié)果1)(n=3)
針對腫瘤血管抑制劑DX1002的含量測定,本文構(gòu)建了一種基于新型納米碳點材料(CDs)的特異性熒光定量方法。以檸檬酸、尿素為原料,經(jīng)工藝優(yōu)化、條件篩選,得到自發(fā)熒光可被DX1002特異性猝滅的CACCDs,且在一定范圍內(nèi),體系ΔF值(ΔF=F0-F)與DX1002濃度存在良好的線性關(guān)系,以此為根據(jù)構(gòu)建了DX1002體外特異性熒光定量方法。本法可實現(xiàn)DX1002含量的快速、靈敏、特異性體外定量檢測,檢測結(jié)果與經(jīng)典的HPLC法基本吻合(P>0.05),分析速度卻較HPLC法快約75倍。體內(nèi)分析常采用的色譜法或色-質(zhì)聯(lián)用等方法存在著生物樣本前處理繁瑣、分析耗時長、靈敏度低等缺陷,本文利用DX1002與碳量子點間存在的熒光定量猝滅關(guān)系建立的體外定量方法,可為DX1002高通量特異性體內(nèi)分析檢測方法的建立提供依據(jù),并為其他與熒光碳點存在定量猝滅關(guān)系物質(zhì)的含量測定提供了思路。