賈鵬莉，沈 碩

(青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海省馬鈴薯育種重點實驗室，青藏高原生物技術(shù)教育部重點實驗室，青海 西寧 810016)

馬鈴薯是全球第四大重要糧食作物，但在貯藏過程中，容易被馬鈴薯晚疫病、馬鈴薯黑痣病、馬鈴薯枯萎病、馬鈴薯干腐病、馬鈴薯早疫病、馬鈴薯癌腫病、馬鈴薯銀腐病、馬鈴薯黃萎病、馬鈴薯粉痂病等多種病害侵襲[1]。其中，馬鈴薯干腐病是馬鈴薯貯藏期主要的真菌性病害之一，其由多種鐮刀菌(Fusariumspp.)引起[2]。據(jù)統(tǒng)計，每年由馬鈴薯干腐病造成的產(chǎn)量損失為6%～25%，最高可達60%[3-5]。生產(chǎn)中對這種病害的防治以化學(xué)防治手段為主，常用的藥劑有苯醚甲環(huán)唑·嘧菌酯、霜脲·錳鋅、戊唑醇等，但長期使用化學(xué)藥劑防治，容易造成菌株抗藥性、環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留等嚴(yán)重問題[6-7]。生物防治是利用有益生物及其代謝產(chǎn)物來控制植物病蟲害的方法，具有不易產(chǎn)生抗藥性、不污染環(huán)境和安全無毒等優(yōu)點[8-9]。因此，利用微生物等天然資源及其代謝產(chǎn)物對馬鈴薯干腐病進行生物防治具有重要意義。目前，已報道可用于防治馬鈴薯干腐病的生防菌有芽孢桿菌(Bacillusspp.)[10]、放線菌(Actinomycesspp.)[11]、木霉菌(Trichodermaspp.)[12]、伯克霍爾德菌(Burkholderiaspp.)[13]、假單胞菌(Pseudomonasspp.)[14]等。白酒糟醅是以谷物為原材料經(jīng)發(fā)酵、蒸餾、提取酒精等加工后所殘余的廢渣物料。近年來，白酒糟醅多應(yīng)用于食品[15]、飼料[16]、以及抗癌[17]等方面的研究。已有研究顯示青稞白酒糟醅在抑草、抑菌和抗病毒等方面具有生物活性[18]。有關(guān)生物防治細(xì)菌抑制植物病原真菌的報道較多，但用其抑制馬鈴薯干腐病病原菌的報道較少。前期發(fā)現(xiàn)一株分離自青稞白酒糟醅的菌株JZ2-1-12對馬鈴薯干腐病病原菌具有抑菌活性[19]。本研究對18株分離自青稞白酒糟醅的菌株進行抑菌活性篩選，采用生理生化特征及分子生物學(xué)方法對活性菌株進行鑒定，并測定活性菌株發(fā)酵液萃取物的抑菌活性和穩(wěn)定性，以期為微生物來源的馬鈴薯干腐病生物防治菌劑及保鮮制劑的開發(fā)提供新的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

18株待測菌株均分離自青稞白酒糟醅。馬鈴薯干腐病病原真菌青9A-2-6、青9A-5-7、青9A-5-10、青9A-4-13分離自馬鈴薯青薯9號薯塊病樣，為鐮刀菌(Fusariumspp.)，均純化保存至青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)研究所微生物實驗室4 ℃冰箱。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g,葡萄糖15 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL)，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2)。

1.1.3 主要儀器

電子天平(梅特勒—托利多儀器有限公司)；高壓蒸汽滅菌鍋(華粵企業(yè)集團有限公司)；電熱恒溫干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；全溫?fù)u瓶柜(常州金壇精達儀器制造有限公司)。

1.2 菌株活化

將保存的分離自青稞白酒糟醅的菌株從4 ℃冰箱取出，接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，備用。

1.3 活性菌株的篩選及穩(wěn)定性評價

采用平板對峙法[20]，在距直徑9 cm的培養(yǎng)皿邊緣2 cm處接種分離自青稞白酒糟醅的菌株，相對的另一側(cè)接種直徑5 mm的病原真菌，每個處理重復(fù)3次，以只接種病原真菌的處理作為對照。置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，觀察分離自青稞白酒糟醅的菌株與病原真菌之間有無抑菌帶出現(xiàn)，測量菌落直徑，計算抑菌率。計算公式如下：

抑制率(%)=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑]×100

為了確定活性菌株的穩(wěn)定性，將篩選得到的有抑菌活性的菌株進行穩(wěn)定性評價，方法同上。分別將供試拮抗菌和病原真菌對峙培養(yǎng)7 d和14 d后，測量抑菌帶寬度，計算14 d時抑菌帶寬度縮小率(VF)，比較各活性菌株的抑菌穩(wěn)定性。穩(wěn)定評價標(biāo)準(zhǔn)[21]：“--”,VF≥70%為不穩(wěn)定；“-”,50%≤VF<70%為較不穩(wěn)定；“+”,20%≤VF<50%為較穩(wěn)定；“++”,VF<20%為穩(wěn)定。計算公式如下：

VF(%)=[(7 d抑菌帶寬度值-14 d抑菌帶寬度值)/7 d抑菌寬帶值]×100

1.4 活性菌株的鑒定

1.4.1 活性菌株的生理生化特征

根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》(第九版)[22]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[23]對活性菌株分別進行葡萄糖氧化發(fā)酵，檸檬酸鹽利用，接觸酶，糖、醇類發(fā)酵，石蕊牛奶測試，明膠液化，甲基紅(M.R)，硝酸鹽還原，V-P測定以及O-硝基苯-β-D吡喃半乳糖苷酶(ONPG)測定等試驗。

1.4.2 活性菌株的分子生物學(xué)鑒定

活性菌株DNA提取根據(jù)上海生工生物工程股份有限公司的柱式細(xì)菌DNA提取試劑盒的程序操作。選擇通用的細(xì)菌16S rDNA引物F27(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA GG-3′)和P1541(5′-AAGGAGGTGGTGATCCAGCCG CA-3′)。PCR 擴增體系10×Buffer 2.5 μL，dNTP(10 mmol /L)2 μL，模板DNA 1 μL，引物各1 μL，Taq DNA聚合酶 0.2 μL，水補足至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 40 s，退火55 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 80 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司測序。將得到的16S rDNA序列在網(wǎng)站https：//www.ezbio cloud.net/上進行序列對比，用MEGA 7.0軟件，采用Neighbor-Joining方法(Bootstrap值為1 000次)，繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹[24]。

1.5 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 24.0進行分析，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑制馬鈴薯干腐病病原真菌活性菌株的篩選

2.1.1 分離自青稞白酒糟醅的菌株對病原菌青9A-2-6的抑菌活性

對18株分離自青稞白酒糟醅的菌株抑制青9A-2-6的活性進行了測定，由表1可知，菌株JZ1-4-10對病原菌青9A-2-6有較強抑菌活性，抑制率為74.12%。菌株JZ1-1-9病原菌青9A-2-6有中等強度抑菌活性，抑制率為69.22%。其他菌株對病原菌青9A-2-6沒有抑菌活性，且與菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9抑菌作用差異顯著(P<0.05)。

表1 分離自青稞白酒糟醅的菌株抑制病原菌青9A-2-6的活性

2.1.2 分離自青稞白酒糟醅的菌株對病原菌青9A-5-10的抑菌活性

對18株分離自青稞白酒糟醅的菌株抑制青9A-5-10的活性進行了測定，由表2可知，菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9對病原菌青9A-5-10有抑菌活性，抑制率分別為47.16%、41.97%。其他菌株對病原菌青9A-5-10沒有抑菌活性，且與菌株JZ1-4-10、 JZ1-1-9抑菌活性差異顯著(P<0.05)。

2.1.3 分離自青稞白酒糟醅的菌株對病原菌青9A-5-7的抑菌活性

對18株分離自青稞白酒糟醅的菌株抑制青9A-5-7的活性進行了測定，由表3可知，菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9對病原菌青9A-5-7有中等抑菌活性，抑制率分別為68.25%、60.44%。其他菌株對病原菌青9A-5-7沒有抑菌活性，且與菌株JZ1-4-10、JZ1-1-9抑菌活性差異顯著(P<0.05)。

表3 分離自青稞白酒糟醅的菌株抑制病原菌青9A-5-7的活性

2.1.4 分離自青稞白酒糟醅的菌株對病原菌青9A-4-13的抑菌活性

對18株分離自青稞白酒糟醅的菌株抑制青9A-4-13的活性進行了測定，由表4可知，菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9對病原菌青9A-4-13有中等抑菌活性，抑制率分別為62.95%、59.67%。其他菌株對病原菌青9A-4-13沒有抑菌活性，且與菌株JZ1-4-10、JZ1-1-9抑菌活性差異顯著(P<0.05)。

表4 分離自青稞白酒糟醅的菌株抑制病原菌青9A-4-13的活性

表5 分離自青稞白酒糟醅的菌株對病原菌抑菌活性的穩(wěn)定性

2.2 活性菌株的穩(wěn)定性評價

通過初篩，共篩選出2株對馬鈴薯病原真菌有抑菌作用的活性菌株，分別為菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9。為了確定它們抑菌活性的穩(wěn)定性，進行抑菌活性的穩(wěn)定性評價。如表5所示，菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9對馬鈴薯病原真菌青9A-2-6、青9A-5-7和青9A-5-10的抑菌活性穩(wěn)定性較強，穩(wěn)定性為“++”；對青9A-4-13的抑菌活性穩(wěn)定性較弱，穩(wěn)定性為“+”；青9A-2-6、青9A-5-7和青9A-5-10與青9A-4-13穩(wěn)定性差異顯著(P<0.05)。可見，菌株JZ3-1-15和JZ1-1-9對病原菌青9A-2-6、青9A-5-7和青9A-5-10的抑菌活性穩(wěn)定。

2.3 活性菌株的鑒定

2.3.1 生理生化鑒定

由表3可知，菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9均可使明膠液化，石蕊牛乳凝固，可利用蔗糖、麥芽糖及檸檬酸，有氧或無氧分子均參與分解葡萄糖，可以產(chǎn)生ONPG，而接觸酶試驗和V-P試驗均呈陰性。菌株JZ1-4-10不能利用甘露醇，甲基紅實驗呈陰性，硝酸鹽還原呈陽性。菌株JZ1-1-9還可利用甘露醇，甲基紅實驗呈陽性，硝酸鹽還原呈陰性。

表6 菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9的生理生化特征

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定

將菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9測序得到的16S rDNA序列提交至https：//www.ezbiocloud.net/，與數(shù)據(jù)庫中已知的16S rDNA序列進行比對，并下載與菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9的16S rDNA序列同源性大于95%的序列，使用MEGA 7.0軟件，根據(jù)Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。結(jié)果表明，菌株JZ1-4-10與暹羅芽孢桿菌(Bacillussiamensis)聚類同一分支，親緣關(guān)系最近，相似度高達99.58%；菌株JZ1-1-9與菌株貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)聚類同一分支，親緣關(guān)系最近，相似度高達100%。結(jié)合菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9的生理生化特征和16S rDNA序列分析結(jié)果，最終將菌株JZ1-4-10鑒定為暹羅芽孢桿菌(Bacillussiamensis)，菌株JZ1-1-9鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)。

3 討論與結(jié)論

目前，馬鈴薯干腐病貯藏病害的防治以化學(xué)藥劑為主，但是長期施用化學(xué)藥劑已造成一系列嚴(yán)重問題，生物防治手段對環(huán)境無污染，安全性高，成為解決這一問題的有效途徑。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離自青稞白酒糟醅的18株菌中有2株對馬鈴薯干腐病病原菌有較好的抑菌活性，說明來源自青稞白酒糟醅中的2株芽孢桿菌具有被開發(fā)為生物防治藥劑的潛力。

經(jīng)鑒定，菌株JZ1-1-9為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)，菌株JZ1-4-10為暹羅芽孢桿菌(Bacillussiamensis)，均屬于芽孢桿菌屬。張德峰等[25]研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌對馬鈴薯干腐病具有較好的防治效果。據(jù)報道，貝萊斯芽孢桿菌對煙草黑脛病菌、水稻條斑病菌、西瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌、草莓炭疽病菌、小麥赤霉病菌等植物病原菌有顯著的抑菌活性[26-29]。近十年來新發(fā)現(xiàn)的暹羅芽孢桿菌，具有廣譜的抑菌活性，其對火龍果炭疽病菌、棉花立枯病菌、花生白絹病菌、梨黑斑病菌等均有顯著的抑菌作用[30-31]。關(guān)于分離自青稞白酒糟醅貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)和暹羅芽孢桿菌(Bacillussiamensis)對馬鈴薯干腐病的防治未見報道，本研究為馬鈴薯干腐病的生物防治提供一種新來源。

貯藏馬鈴薯容易腐爛，這種情況在農(nóng)戶窖藏中非常普遍，是制約馬鈴薯貯藏質(zhì)量和影響窖藏收益的主要瓶頸。本研究從生物防治研究出發(fā)，對來源青稞白酒糟醅的18株菌通過平板對峙法篩選出有抑制馬鈴薯干腐病病原菌的活性菌株，證明分離自青稞白酒糟醅的菌株確實對馬鈴薯干腐病的防治有一定的作用。該研究結(jié)果有望將青稞白酒酒糟開發(fā)成一種新型、高效、低毒的微生物能源，可以為植物病害的生物防治奠定堅實的理論基礎(chǔ)。下一步將進行抑菌作用機理、靶標(biāo)位點、生防抑菌劑、以及代謝產(chǎn)物等方面的研究。