周楚人 ，郝曉峰 ，劉一涵，陳咸吉 ，肖揚(yáng)波 ，曾露芝 ，向蒙，劉甫智，李桂陽，汪啟明*，彭國平*

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128；2道地藥用植物規(guī)范化栽培與綜合利用湖南省工程實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410128；3湖南一線情農(nóng)業(yè)有限公司，邵陽 422208；4湖南省康潤農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，懷化 418013）

龍牙百合（Lilium brownie var.virdulum Baker），是我國一種珍貴的稀有和暢銷的特產(chǎn)蔬菜，是湖南長期栽培的百合地方良種，在湖南邵陽有1 800多年的種植歷史，因其鱗片肥大，形似龍牙而得名，是百合中最名貴的品種之一。它鱗莖個(gè)體肥厚、抱合緊密、結(jié)拜細(xì)嫩、顏色鮮艷、品質(zhì)優(yōu)良、營養(yǎng)豐富，具有安神寧心、補(bǔ)中益氣、養(yǎng)陰潤肺、理脾健胃等功效，有較高的營養(yǎng)價(jià)值及藥用價(jià)值［1-3］。

龍牙百合多采用無性繁殖，易造成病毒累積，嚴(yán)重危害其產(chǎn)量和品質(zhì)。目前已報(bào)道侵染百合的病毒達(dá)19種以上，最主要的為百合斑駁病毒（Lily mottle virus，LMoV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和百合無癥病毒（Lily symptomless virus，LSV）［4，5］。這3種病毒通常以其中2或3種同時(shí)侵染百合植株，給百合生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響［6-8］。研究表明，病毒侵染后的表現(xiàn)包括幼葉向下反卷扭曲、系統(tǒng)花葉、壞死斑、花葉出現(xiàn)斑點(diǎn)或花葉卷曲，植株矮化呈從簇狀，甚至無花、植株無主稈等癥狀，造成百合切花或鱗莖品質(zhì)嚴(yán)重下降。而植株一旦感染則終身攜帶，通過蚜蟲或汁液傳播，病毒傳播范圍進(jìn)一步擴(kuò)大［9-11］。

為保證龍牙百合質(zhì)量，栽培無毒種球是防控百合病毒性病害的根本措施，而有效的病毒檢測(cè)技術(shù)是確保脫毒苗真正無毒的有效措施。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料于2020年6月取自湖南省邵陽市隆回縣三閣司鎮(zhèn)（27.116415°N，110.978235°E）龍牙百合發(fā)病田，以5點(diǎn)法取樣獲得數(shù)株染病龍牙百合。

1.2 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器：實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀ABI7500、超凈工作臺(tái)BIOBAS、微量移液器Eppendorf、漩渦混勻儀Kylin-Bell、掌式離心機(jī)Kylin-Bell、熱循環(huán)儀ABI Proflex、電泳儀（上海天能科技有限公司）。

實(shí)驗(yàn)試劑：DEPC處理水（R1600）Solarbio、三氯甲烷（10006818，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、Gel-Red染 料（#41003）Biotium、RNA Loading Buffer（9168）TaKaRa、Tris-Borate-EDTA Buffer（TBE）10×Powder，pH8.3（T9122）TaKaRa、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）（FP205-02）天根、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（K1622）ThermoFisher、RNAsimple Total RNA Kit（DP419）天根。

根據(jù)NCBI Genebank（The National Center for Biotechnology Information，美國國立生物技術(shù)信息中心）中登錄的百合CMV、LMoV、LSV病毒基因序列，應(yīng)用Primerpremier 6.0軟件分別設(shè)計(jì)3種病毒的特異性引物。LMoV-99、LMoV-101、LSV-70、LSV-169、CMV-110、CMV-70由上海生工生物工程有限公司合成，具體序列見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列Table 1 Primer sequences used in experiments

1.3 龍牙百合總RNA的提取

使用Hipure HP Plant RNA MiNi Kit提取植物總RNA小提試劑盒，按說明書提取總RNA。

1.4 RT-PCR法檢測(cè)龍牙百合病害種類

利用RT-PCR法進(jìn)行龍牙百合主要病毒的檢測(cè)。采用引物L(fēng)MoV-99 R/F、LMoV-101 R/F、LSV-70 R/F、LSV-169 R/F、CMV-110 R/F、CMV-70 R/F，從總RNA提取液中分別擴(kuò)增CMV、LMoV、LSV等病毒，根據(jù)RT-PCR試劑盒操作說明，設(shè)定RT-PCR體系為：（1）體系中加入RNA（90～100 ng/uL）11μL、Random lexamer Primer 1μL，混勻離心，PCR儀上65℃反應(yīng)5 min，立即置于冰上冷卻，離心后放置冰上。（2）體系中加入5×Reaction Buffer 4μL、Ribolock RNase Inhibition 1μL、10 mM dNTP Mix 2μL、ReverlAid M-MuLV RT 1μL，混勻離心。（3）PCR儀中25℃作用5 min，然后42℃作用60 min，70℃作用5 min，終止反應(yīng)。（4）補(bǔ)加20 μL NF-H2O至40μL，獲得cDNA并做好標(biāo)記，隨后檢測(cè)。（5）在冰上配制如下反應(yīng)體系：2×Super-Real PreMix Plus 10μL，相應(yīng)上下游混合引物10 μM，cDNA 2μL、RNase-free H2O 7.4μL，混勻離心。（6）95℃預(yù)變性15 min，95℃變性10 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s。45個(gè)循壞進(jìn)行PCR，產(chǎn)物檢測(cè)溶解曲線［12，13］。

2 結(jié)果

2.1 總RNA提取結(jié)果

使用美吉生物科技有限公司提取植物總RNA小提試劑盒從龍牙百合鱗莖組織提取總RNA，用分光光度儀檢測(cè)8份龍牙百合引物總RNA提取液的濃度和純度，檢測(cè)結(jié)果如表2。其A260/A280值基本在2.0左右，表明純度高，可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

表2 百合提取RNA的純度與濃度Table 2 The purity and concentration of RNA extractedfrom Lily

2.2 病毒檢測(cè)結(jié)果

圖1 各引物RT-qPCR擴(kuò)增曲線Fig.1 RT-qPCR amplification curve of each primer

采用引物L(fēng)MoV-99 R/F、LMoV-101 R/F、LSV-70 R/F、LSV-169 R/F、CMV-110 R/F、CMV-70 R/F從總RNA提取液中分別擴(kuò)增CMV、LMoV、LSV等病毒。對(duì)RT-qPCR產(chǎn)物檢測(cè)，其擴(kuò)增曲線如圖1，溶解曲線如圖2，CT（Cycle threshold）值如表3，凝膠電泳圖如圖3。LMoV99、LMoV101引物的反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增曲線結(jié)果較好，雖然其CT值不穩(wěn)定，但都小于35，LMoV-99引物的反應(yīng)產(chǎn)物溶解曲線Tm值集中在85.5℃左右，且均為單一峰，而LMoV-99引物的反應(yīng)產(chǎn)物溶解曲線Tm值集中在84.5℃左右。部分實(shí)驗(yàn)組存在多峰現(xiàn)象，可能出現(xiàn)了非特異性擴(kuò)增。LSV-70、LSV-169、CMV-110、CMV-70引物的反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增曲線雖然CT值大部分小于35，但其溶解曲線Tm值小于80℃，且樣本間差異極大，可能是引物間發(fā)生了非特異性擴(kuò)增。

圖2 各引物RT-qPCR溶解曲線Fig.2 RT-qPCR Melting curve of each primer

凝膠電泳結(jié)果顯示，LMoV-99、LMoV-101引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的片段長度在100 bp左右，符合預(yù)期設(shè)計(jì)所能擴(kuò)增出的片段長度，而LSV-169、CMV-70引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的片段長度在50 bp以下，不符合預(yù)期片段長度，而LSV-70基本沒有獲得PCR產(chǎn)物。

表3 百合病毒cDNA的qPCR循環(huán)閾值Table 3 qPCR cycle threshold table of lily virus cDNA

續(xù)表3

圖3 龍牙百合各引物PCR結(jié)果Fig.3 PCR results of different primers of Lilium longicornis

3 討論

在采用RT-PCR檢測(cè)百合病毒的文獻(xiàn)報(bào)道中，大多數(shù)通過RT-PCR產(chǎn)物中有無病毒的特異片段來判斷被檢測(cè)的百合是否感染該病毒［14-16］。筆者在對(duì)隆回龍牙百合3種主要病毒CMV、LMoV、LSV的檢測(cè)過程中，以95℃預(yù)變性15 min，95℃變性10 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，45個(gè)循壞的PCR參數(shù)進(jìn)行RT-qPCR，但只有采用LMoV-99 R/F、LMoV-101 R/F引物進(jìn)行qPCR時(shí)，溶解曲線、擴(kuò)增曲線符合預(yù)期，CT值在15～25之間，之后進(jìn)行的普通PCR進(jìn)行凝膠電泳的結(jié)果也表明擴(kuò)增出了LMoV病毒的片段，而以LSV-70 R/F、LSV-169 R/F、CMV-110 R/F、CMV-70 R/F引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，溶解曲線紊亂，擴(kuò)增曲線顯示CT值普遍在35左右，可以認(rèn)為是引物二聚體，并沒有擴(kuò)增出CMV病毒和LSV病毒的特異片段。

4 結(jié)論

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以判斷隆回縣龍牙百合感染了百合斑駁病毒，而未感染百合無癥病毒及黃瓜花葉病毒。此外，謝晚彬等［17］對(duì)江西萬載的龍牙百合進(jìn)行主要病毒檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)萬載龍牙百合感染了百合斑駁病毒，沒有感染黃瓜花葉病毒和百合無癥病毒，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。筆者認(rèn)為可能病毒本就存在于龍牙百合種球內(nèi)，隨后在田間傳播；也有可能龍牙百合對(duì)黃瓜花葉病毒和百合無癥病毒有較高的抵抗力，而對(duì)百合斑駁病毒抵抗力較弱，易感百合斑駁病。