董玉瑋，張浩赟，周立輝，沙 爽，陳學(xué)紅，苗敬芝

（徐州工程學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018）

蘆筍(Asparagus officinalis L.)又稱石刁柏或者龍須菜，為百合科天門冬屬。其種植地主要分布在江蘇徐州、山東菏澤、山西運城等地，出口日本、韓國、馬來西亞、澳大利亞、新加坡等國家[1]。蘆筍具有低糖、低脂肪、高蛋白、高維生素等特點[2]，所含有的皂苷、多糖、黃酮類等活性物質(zhì)在抗癌[3-4]、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等方面具有顯著功效[5-6]。靈芝(Ganoderma lucidum)又稱為瑞草，屬靈芝菌科靈芝屬，靈芝的有效成分是多糖、三萜類、腺苷等，具有安神、增強免疫力、抗氧化、美容養(yǎng)顏等功效[7-9]。靈芝多糖是靈芝中最重要的生物活性成分，具有保健功效，應(yīng)用價值高，范圍廣[10]。

由于靈芝資源稀缺且人工栽培時間較長，限制了其藥用價值的充分利用。隨著藥食真菌發(fā)酵技術(shù)的不斷進步，可以通過液體發(fā)酵方式獲得藥食真菌活性成分。靈芝具有分解、利用纖維素和木質(zhì)素的能力[11]，一些植物例如蘆筍、牛蒡中除富含纖維素和木質(zhì)素外[12]，還含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分[13-14]，都可以作為靈芝生長的原料。因此制備蘆筍-靈芝發(fā)酵型飲料，融合植物和藥食真菌的優(yōu)勢，形成新型功能飲料，能夠進一步開發(fā)蘆筍和靈芝的價值。目前國內(nèi)外市場暢銷的飲料中，對人體健康有益的發(fā)酵飲料、藥食真菌飲料比重較小，并且藥食真菌飲料中直接采用子實體為原料的占比較大[15-16]，影響了藥食真菌營養(yǎng)和功能的發(fā)揮，同時面臨添加化學(xué)物質(zhì)過多、功效單一、消費者人群局限等問題。因此植物-藥食真菌發(fā)酵型飲料還具有很廣闊的開發(fā)和應(yīng)用空間。

該文以蘆筍為主要原料，靈芝為發(fā)酵菌種，采用液體深層發(fā)酵技術(shù)，制備蘆筍-靈芝發(fā)酵型飲料，能很好地保留靈芝的功效，同時蘆筍中的一些營養(yǎng)成分被降解，形成新的有效成分和風(fēng)味物質(zhì)，為提升蘆筍和靈芝深加工產(chǎn)品的科技含量和市場競爭力提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

綠蘆筍：由徐州山崎農(nóng)產(chǎn)品研發(fā)有限公司提供；赤靈芝菌種：實驗室保存著的高活性靈芝菌種；檸檬酸：天津市北辰方正試劑廠；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、黃原膠：河南協(xié)恒生物科技有限公司；β-環(huán)狀糊精：蘭溪市科正生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純：天津市恒興化學(xué)試劑股份有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

303-0S 恒溫培養(yǎng)箱：常州金壇三和儀器有限公司；722 可見分光光度計：上海實驗儀器商城；SW-CJ-1F紫外超凈工作臺：江蘇力辰科技儀器；HH.S 恒溫水浴鍋：上海邦西儀器有限公司；XFS-280A 高壓蒸汽滅菌鍋：上海電安有限公司；80-2 低速離心機：上海邦西儀器有限公司；HYG 搖瓶培養(yǎng)柜：上海實驗儀器商城；DGG-9076A 烘箱：上海力辰科技儀器；SRH2000-45高壓均質(zhì)機：上海申鹿均質(zhì)機有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 培養(yǎng)基配制

PDA 斜面培養(yǎng)基：土豆洗凈去皮切碎，準確稱取200 g，加適量蒸餾水煮沸，棄渣取土豆汁。加入20 g 瓊脂和20 g 葡萄糖，加水定容至1 000 mL，加熱至100 ℃，混勻后裝入試管，傾斜放置，冷卻凝固。

液體培養(yǎng)基：將蘆筍洗凈粉碎，稱取一定量置于250 mL 錐形瓶中，添加3 g 可溶性淀粉、1 g 酵母浸膏和100 mL 蒸餾水，高壓滅菌后，取出冷卻至室溫。

1.2.2.2 靈芝菌種的活化與液體發(fā)酵

將靈芝菌種在無菌操作臺內(nèi)接入PDA 斜面培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～6 d。挑選長勢好的菌種，接種在液體培養(yǎng)基中，28 ℃，120 r/min 搖床發(fā)酵培養(yǎng) 6～8 d。

1.2.2.3 穩(wěn)定、調(diào)配與均質(zhì)

將培養(yǎng)好的發(fā)酵菌液倒入液體攪拌機，攪拌10 min，混合液于4 000 r/min 離心10 min，取上清液。加入適量的穩(wěn)定劑（CMC-Na、黃原膠和β-環(huán)狀糊精），測定沉淀率，加入調(diào)味劑（蔗糖、蜂蜜和檸檬酸），將料液在25 MPa、60 ℃條件下均質(zhì)，處理后立即脫氣。

1.2.2.4 灌裝與殺菌

采用容積為100 mL 的玻璃瓶灌裝均質(zhì)后的飲料，110 ℃殺菌30 min，自然冷卻。

1.2.3 穩(wěn)定劑添加量的選擇

1.2.3.1 CMC-Na 添加量

控制黃原膠和β-環(huán)狀糊精的量不變，分別添加質(zhì)量百分比為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%的CMC-Na，混勻，靜置12 h 以上，計算沉淀率，試驗重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

1.2.3.2 黃原膠添加量

控制CMC-Na 和β-環(huán)狀糊精的量不變，分別添加質(zhì)量百分比為 0.03%、0.04%、0.05%、0.06%和0.07%的黃原膠，混勻，靜置12 h 以上，計算沉淀率，試驗重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

1.2.3.3 β-環(huán)狀糊精添加量

控制CMC-Na 和黃原膠的量不變，分別添加質(zhì)量百分比為0.20%、0.30%、0.40%、0.50%和0.60%的β-環(huán)狀糊精，混勻，靜置12 h 以上，計算沉淀率，試驗重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

1.2.3.4 沉淀率計算

將加入穩(wěn)定劑的發(fā)酵菌液放入液體攪拌機，攪拌10 min，液體于 4 000 r/min 離心 10 min，取上清液，稱取干燥離心管的質(zhì)量為m1，量取10 mL 上清液加入離心管，再次稱取質(zhì)量為m2，4 000 r/min 離心20 min，棄上清液，稱取沉淀物質(zhì)量為m3，按照公式（1）計算沉淀率[17]。

1.2.4 調(diào)配劑添加量的選擇

以蔗糖、蜂蜜和檸檬酸3 種調(diào)味劑作為單因素，進行感官評價，重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

1.2.4.1 蔗糖添加量

控制檸檬酸和蜂蜜的添加量不變，分別加入質(zhì)量百分比為2%、4%、6%、8%和10%的蔗糖量，混勻，靜置1 d，進行感官評分。

1.2.4.2 蜂蜜添加量

控制檸檬酸和蔗糖的添加量不變，分別加入質(zhì)量百分比為1%、1.5%、2%、2.5%和3%的蜂蜜量，混勻，靜置1 d，進行感官評分。

1.2.4.3 檸檬酸添加量

控制蜂蜜和蔗糖的添加量不變，分別加入質(zhì)量百分比為0.06%、0.08%、0.10%、0.12%和0.14%的檸檬酸，混勻，靜置1 d，進行感官評分。

1.2.4.4 飲料調(diào)配Box-Behnken 試驗設(shè)計

采用Design-Expert 8.07 軟件，選取3 個調(diào)味劑因素：X1蔗糖、X2蜂蜜、X3檸檬酸，選擇感官評價得分較高的3 個水平，進行響應(yīng)面試驗，因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Design factors and levels of response surface experiment

飲料感官評價標準詳見表2。邀請15 位具有一定食品感官評定基礎(chǔ)的專業(yè)人員組成評定小組[18]對飲料進行感官評定，依照指標評分，以保證結(jié)果的準確性。

表2 蘆筍-靈芝發(fā)酵飲料感官評價標準Table 2 Sensory evaluation of Asparagus officinalis-Ganoderma lucidum fermented beverage

1.2.5 飲料多糖的提取與含量檢測

1.2.5.1 提取方法

參考潘明等[19]的方法。將培養(yǎng)后的發(fā)酵液于4 000 r/min 離心10 min，取上清液置于50 ℃烘箱中烘至原體積五分之一，再加入5 倍體積95%乙醇，于4 ℃冰箱中過夜醇沉后，4 000 r/min 離心5 min，取沉淀于50 ℃烘箱烘干，得粗多糖。

1.2.5.2 含量測定

參考周濃等[20]的方法，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。稱取多糖純品1 g，加水10 mL 徹底溶解，在490 nm 波長下測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算多糖含量。

1.2.5.3 葡萄糖標準曲線的制作

準確稱取干燥至恒重的無水葡萄糖標準品0.50 g，配成濃度為0.1 mg/mL 的葡萄糖對照品儲備液，分別準確吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 置于 10 mL 比色管中，加蒸餾水補至1.0 mL，各加入5%苯酚溶液1.0 mL，混勻后快速加入5.0 mL 濃硫酸，混勻，冷卻10 min，50 ℃水浴 20 min，室溫冷卻，在 490 nm 波長下測定葡萄糖標準溶液的吸光度，得標準曲線y=0.043 9 x-0.004 1，R2=0.999 6，在 0～100 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用Design Expert 9 軟件進行試驗設(shè)計，利用Origin 9.0 軟件處理數(shù)據(jù)并作圖，所有數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 飲料穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.1.1 CMC-Na 添加量的確定

如圖 1 所示，CMC-Na 添加量在 0.05%～0.25%時，沉淀率先下降后上升，當CMC-Na 添加量為0.15%時，沉淀率達到最低，為0.110%。關(guān)仁梅等[21]研究藍莓紅豆復(fù)合飲料發(fā)現(xiàn)，0.05%～0.15%的CMC-Na能夠很好地發(fā)揮其穩(wěn)定性和風(fēng)味優(yōu)勢，與本試驗結(jié)果基本一致。

圖1 不同CMC-Na 添加量對發(fā)酵液沉淀率的影響Fig.1 Effects of different CMC-Na additions on sedimentation rates of fermentation broth

2.1.2 黃原膠添加量的確定

如圖2 所示，黃原膠添加量在0.03%～0.07%時，沉淀率值先下降后升高，當黃原膠添加量為0.05%時，沉淀率值達到最低，為0.101%。代邵娟等[22]研究發(fā)現(xiàn)，對大櫻桃蘋果發(fā)酵飲料穩(wěn)定性影響最大的是黃原膠，當添加量為0.08%時，穩(wěn)定性最好，與本試驗結(jié)果基本一致。

圖2 不同黃原膠添加量對發(fā)酵液沉淀率的影響Fig.2 Effects of different xanthan gum additions on sedimentation rates of fermentation broth

2.1.3 β-環(huán)狀糊精添加量的確定

如圖3 所示，β-環(huán)狀糊精添加量在0.2%～0.6%時，沉淀率先下降后上升。當β-環(huán)狀糊精添加量為0.4%時，沉淀率達到最低，為0.107%。β-環(huán)狀糊精不僅能夠作為穩(wěn)定劑，還可一定程度遮蓋飲料的苦澀味，張蕾等[23]研究荷葉露保健飲料發(fā)現(xiàn)，當β-環(huán)狀糊精用量為0.4%時，效果最佳，與本試驗結(jié)果基本一致。

圖3 不同β-環(huán)狀糊精添加量對發(fā)酵液沉淀率的影響Fig.3 Effects of different β-dextrin additions on sedimentation rates of fermentation broth

根據(jù)上述結(jié)果，穩(wěn)定劑添加量選擇CMC-Na 為0.15%，黃原膠為0.05%，β-環(huán)狀糊精為0.4%，此時測得的沉淀率值為0.098%。

2.2 飲料調(diào)配試驗結(jié)果

2.2.1 蔗糖添加量的確定

添加最佳比例的穩(wěn)定劑后，加入蔗糖，發(fā)酵型飲料感官評分見圖4。如圖4 所示，蔗糖添加量在2%～10%時，發(fā)酵型飲料的感官評分先增加后減小。當添加量低于2%或者高于10%時，飲料口味偏淡或過甜，風(fēng)味不佳，評分很低。當蔗糖添加量為4%時，甜度適中，獲得最高感官評分，95 分。

2.2.2 蜂蜜添加量的確定

圖4 不同蔗糖添加量對飲料感官評分的影響Fig.4 Effects of different sucrose additions on sensory scores of beverage

添加最佳比例的穩(wěn)定劑后，加入蜂蜜，發(fā)酵型飲料感官評分見圖5。如圖5 所示，蜂蜜添加量在1%～3%時，發(fā)酵型飲料的感官評分先增大后減小。當添加量低于1.0%或者高于3.0%時，口味淡或液體黏稠，風(fēng)味不佳，評分很低。當蜂蜜添加量為2%時，飲料黏稠度適中，獲得最高感官評分，96 分。

圖5 不同蜂蜜添加量對飲料感官評分的影響Fig.5 Effects of different honey additions on sensory scores of beverage

2.2.3 檸檬酸添加量的確定

添加最佳比例的穩(wěn)定劑后，加入檸檬酸，發(fā)酵型飲料感官評分見圖6。如圖6 所示，檸檬酸添加量在0.06%～0.14%時，發(fā)酵型飲料的感官評分先增大后減小。當添加量低于0.06%或者高于0.14%時，口味淡或偏酸，風(fēng)味不佳，評分低。當檸檬酸添加量為0.10%時，酸度適中，獲得最高感官評分，95 分。

圖6 不同檸檬酸添加量對飲料感官評分的影響Fig.6 Effects of different citric acid additions on sensory scores of beverage

2.3 調(diào)味劑響應(yīng)面試驗結(jié)果

以蘆筍-靈芝發(fā)酵型飲料感官評分為響應(yīng)值，選取蔗糖、蜂蜜和檸檬酸添加量為主要因素進行響應(yīng)面試驗設(shè)計，試驗方案與結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計和結(jié)果Table 3 Response surface experimental design and results

2.4 回歸模型的構(gòu)建與驗證

通過響應(yīng)面軟件獲得表4 數(shù)據(jù)，然后觀察所得數(shù)據(jù)結(jié)果，分析、計算，再對 X1、X2、X3各因素回歸擬合，最后可得到感官評分（Y）回歸方程式（見式2）。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

回歸模型P＜0.01，達到了極顯著水平，失擬項P＞0.05，不顯著，即試驗無失擬因素存在，能充分反映實際情況；決定系數(shù)R2=0.996，說明實際結(jié)果與模型預(yù)測結(jié)果的一致性良好說明結(jié)果有98.97%受試驗因素影響。該模型擬合程度好，可以用該模型對蘆筍-靈芝發(fā)酵型飲料制備工藝進行分析和預(yù)測。由回歸方程和方差分析可知，模型中X2、X3對飲料感官評分的影響極顯著（P＜0.01），X1對飲料感官評分的影響為顯著（P＜0.05）。各因素對飲料感官評分影響的主次順序為X2＞X3＞X1，即蜂蜜＞檸檬酸＞蔗糖。

2.5 兩因素間交互作用分析

圖7 表示各影響因素兩兩作用對蘆筍-靈芝發(fā)酵型飲料感官評分的影響。在所選范圍內(nèi)各影響因素的相互作用存在極大值，既是響應(yīng)面的最高點，同時也是等高線最小橢圓的中心點。由表4 數(shù)據(jù)分析可知，檸檬酸單獨作用及其和蔗糖交互作用都會對飲料口感產(chǎn)生極顯著影響（P＜0.01），蔗糖單獨作用及其和蜂蜜交互作用會對飲料口感產(chǎn)生顯著影響（P＜0.05）。蔗糖、檸檬酸、蜂蜜都能改變飲料風(fēng)味，其本質(zhì)是改變飲料的酸度和甜度。飲料的風(fēng)味能夠極大地影響消費者的口感，適合的甜度與酸度能夠讓飲料酸甜可口，從而獲得更高的感官評價。

圖7 兩因素間交互作用響應(yīng)面分析圖和等高線圖Fig.7 Response surface analysis and contour maps of interaction effects between every two factors

2.6 最佳條件優(yōu)化及驗證

回歸模型確定的最佳制備工藝為：蔗糖添加量4.3%，蜂蜜添加量2.06%，檸檬酸添加量0.10%，感官評分的預(yù)測最大值達96.23 分。對此優(yōu)化條件進行驗證，考慮實際操作，選擇蔗糖添加量4.15%，檸檬酸添加量0.10%，蜂蜜添加量2.09%的條件下進行3 次驗證試驗，得到的感官評分平均值為95 分，與預(yù)測結(jié)果基本相符，回歸模型的預(yù)測性能較好，可用于蘆筍-靈芝發(fā)酵型飲料制備工藝。最佳工藝條件為：穩(wěn)定劑CMC-Na 0.15%，黃原膠0.05%，β-環(huán)狀糊精0.4%，調(diào)味劑蜂蜜2.09%，檸檬酸0.10%，蔗糖4.15%，檢測此時飲料多糖含量為3.262 mg/mL。

3 結(jié)論

（1）單因素試驗表明：CMC-Na 添加量0.15%，黃原膠添加量0.05%，β-環(huán)狀糊精添加量0.4%時，蘆筍-靈芝發(fā)酵液的穩(wěn)定性最好，沉淀率達到最低，為0.098%。

（2）響應(yīng)面試驗得出調(diào)味劑兩兩交互影響最大的是檸檬酸和蔗糖添加量。蘆筍-靈芝發(fā)酵型飲料的最佳工藝條件為：蜂蜜2.09%，檸檬酸0.10%和蔗糖4.15%，該工藝條件下制備的飲料口感最好，感官評分為95 分，此時飲料多糖含量為3.262 mg/mL。