蔣源 陳紅梅 易恒仲 黃軍

支氣管狹窄是常見的支氣管結(jié)核并發(fā)癥，常見癥狀為呼吸困難，嚴重時可引發(fā)呼吸衰竭或窒息性死亡[1]。遺傳、結(jié)核分枝桿菌以及抗結(jié)核分枝桿菌的免疫反應，造成成纖維細胞過度增殖、膠原纖維合成增多以及細胞外基質(zhì)沉積可導致氣道狹窄[2-3]。采取有效的措施減少或抑制成纖維細胞增殖和膠原纖維的增加是防治氣道狹窄的關鍵步驟[4]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)是NAD+依賴性脫乙酰基酶，在多種疾病的病理進展和治療中發(fā)揮復雜的功能[5-6]。本研究通過檢測結(jié)核性氣道狹窄患者的氣道增生肉芽組織中SIRT1的表達，并進一步分析沉默氣管成纖維細胞中SIRT1基因表達對轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β,TGF-β1)誘導下的細胞增殖與分化的影響，為結(jié)核性氣道狹窄的診治研究奠定基礎。

資料與方法

一、 主要材料與試劑

人原代氣管成纖維細胞購自武漢Procell公司。胎牛血清、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶和DMEM培養(yǎng)基購自美國 Gibco 公司，Lipofectamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑盒購自上?；鄯f生物科技有限公司，免疫組化染色試劑購自上海古朵生物科技有限公司，Trizol試劑盒、Prime ScriptTM RT reagent Kit試劑盒及SYBR?Premix Ex TaqTM II試劑盒購自日本Takara公司，TGF-β1購自美國PeproTech公司，免疫熒光染色試劑購自上海晶天生物科技有限公司，CCK-8 試劑盒、碘化丙啶、RIPA裂解液、BCA試劑盒、PVDF膜以及ECL發(fā)光液購自上海碧云天生物技術有限公司，抗體SIRT1、TNF-α、α-SMA以及辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔購自美國Abcam公司，抗體PCNA、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ以及β-actin購自北京中杉金橋生物有限公司。

二、 標本收集

收集我院2018年5月～2019年12月住院的40例結(jié)核性增生性氣道狹窄患者的氣道增生肉芽組織，作為結(jié)核性氣道狹窄組，同時取20例正常支氣管組織作為正常對照組。所有患者及家屬均簽署了知情同意書。病例納入標準：①經(jīng)支氣管鏡檢查與細菌學確診的結(jié)核性增生性氣道狹窄患者；②所有患者均未行抗結(jié)核治療；③正常對照組為在我院體檢健康正常者。病例排除標準：①先天性氣道狹窄以及氣道腫瘤、結(jié)締組織疾病以及其他原因所致氣道狹窄者；②耐藥結(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌及合并人類免疫缺陷病毒感染者；③灌洗液病原菌培養(yǎng)為陽性者；④合并活動性肺結(jié)核、合并結(jié)核性胸膜炎、淋巴結(jié)結(jié)核等肺外結(jié)核患者；⑤一周內(nèi)使用激素治療者。

三、 免疫組化染色

將氣道增生肉芽組織置于4%多聚甲醛中固定，采用梯度乙醇脫水，浸于二甲苯中透明，進行常規(guī)石蠟包埋，切成4 μm的石蠟切片。組織切片脫蠟至水后，滴加2%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，在高溫下進行抗原修復，采用3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶，然后滴加一抗SIRT1(1 ∶200)與TNF-α(1 ∶200)，在4℃ 孵育過夜，次日PBS 沖洗，滴加二抗(1 ∶1000)后在溫下孵育1 h，PBS 再次沖洗后，加入DAB進行染核，并使用蘇木精復染，采用中性樹膠封片，于電鏡下觀察組織中SIRT1與TNF-α陽性表達，以染成棕黃色至棕色為陽性表達。

四、 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

氣管成纖維細胞復蘇后，加入含10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)/鏈霉素(100 μg/mL)雙抗液的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。待細胞融合度達到80%時，0.25%胰蛋白酶消化細胞，進行傳代。將對數(shù)生長期的細胞按 4×103個細胞/孔的密度接種96孔板，每組設置5個復孔，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育過夜。實驗分為空白對照組、siRNA-NC組、siRNA-SIRT1組，根據(jù)Lipofectamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將siRNA-SIRT1及siRNA-NC序列轉(zhuǎn)染至細胞，在37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h 后，更換為新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h后收集細胞。

五、 實時熒光定量PCR

根據(jù)TRIzol試劑盒說明提取各處理組氣管成纖維細胞總RNA，Nanodrop測定RNA的純度和濃度。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTM RT reagent Kit將總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用SYBR?Premix Ex TaqTM II試劑盒進行qRT-PCR，檢測細胞中各基因 mRNA的表達情況，以β-actin為內(nèi)參基因。擴增條件為：95℃ 3 min，1個循環(huán)；95℃ 30 s、60℃ 30 s、58℃ 30 s，42個循環(huán)。使用2-ΔΔCt法來計算各基因mRNA的相對表達量。引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列為：SIRT1上游引物5′-CAAAGGAGCAGATTAGTAGGCG-3′，下游引物5′-CTCTGGCATGCCACTCATAGG-3′， Col-Ⅰ上游引物5′-CATGGTGACAAGGGTGAGAG-3′，下游引物5′- GGATGTTCTCGATCTGCTGG-3′，Col-Ⅲ 上游引物5′-GAATGCCGGAGAAAGAGG-3′，下游引物5′-TCTCGGGTTTCCACACGTCTC-3′，β-actin上游引物5′-ACCAACTGGGACGACATGGAG-3′ ，下游引物5′-TGGTGGTGAAGCTGTAGCC-3′。

六、 Western blot

在各處理組氣管成纖維細胞中加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒對蛋白進行定量。采用10% SDS-PAGE凝膠分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)至PVDF膜。使用5%脫脂奶粉在室溫下封閉2 h，TBST洗膜后，滴入稀釋后的一抗SIRT1(1 ∶1 000)、PCNA(1 ∶1 000)、α-SMA(1 ∶2 000)、Col-Ⅰ(1 ∶2 000)、Col-Ⅲ(1 ∶2 000)以及內(nèi)參鼠抗β-actin(1 ∶5 000)，4℃下孵育過夜。次日，TBST洗膜，然后滴入二抗，置于室溫孵育1 h，TBST再次洗膜，并滴加ECL發(fā)光液顯色曝光， Image Pro Plus分析各蛋白條帶灰度值。

七、 CCK-8

將氣管成纖維細胞密度調(diào)整至5×105/mL，取100 μl接種至96孔板，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后，進行轉(zhuǎn)染實驗，轉(zhuǎn)染48 h后，吸去上清。實驗設置空白對照組、TGF-β1 組、siRNA-NC+TGF-β1組、siRNA-SIRT1+TGF-β1組。除空白對照組外，其余每孔加入5 ng/mL TGF-β1 刺激48 h，然后更換為100 μL新鮮培養(yǎng)基，分別加入10% CCK-8試劑，放入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出，采用全自動酶標儀檢測各孔光密度(OD)值，檢測波長為450 nm。

八、 流式細胞術

將轉(zhuǎn)染48 h并用TGF-β1刺激的氣管成纖維細胞用 PBS 洗滌，預冷的75%乙醇重懸細胞，并在-20 ℃下固定24 h，PBS再次洗滌并重懸細胞，每組取 450 μl 細胞懸液，加2 μl RNase后，37 ℃下孵育 10 min，接著加500 μl 碘化丙啶(PI)，置于37 ℃下避光孵育30 min，過300目篩網(wǎng)，通過流式細胞儀檢測細胞周期分布情況。

九、免疫熒光染色

將氣管成纖維細胞以 1×104個/孔鋪于24孔板內(nèi)的無菌玻片上，培養(yǎng) 24 h 后，進行轉(zhuǎn)染48 h并用TGF-β1刺激后收集細胞，使用PBS洗滌細胞，加入4%多聚甲醛室溫固定15 min，滴加 0.5% TritonX-100 透化處理15 min，然后加入 10%山羊血清室溫封閉2 h，滴加稀釋的一抗抗體α-SMA(1 ∶150)在 4℃下孵育過夜，次日，棄去一抗使用PBS洗滌后，滴加對應的熒光二抗(1 ∶1000)，室溫避光孵育1 h，洗滌并滴加 DAPI染細胞核 10 min，再次洗滌并封片，于熒光顯微鏡下觀察α-SMA表達情況。

十、 統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、 各組支氣管組織SIRT1與TNF-α的表達測

免疫組化染色結(jié)果(見圖1)所示，結(jié)核性氣道狹窄的氣道增生肉芽組織中具有明顯的棕黃色至棕色染色，統(tǒng)計結(jié)果表明結(jié)核性氣道狹窄組中SIRT1與TNF-α陽性表達率分別為95.0%(38/40)、97.5%(39/40)，較正常對照組中SIRT1、TNF-α陽性表達率10.0%(2/20)、5.0%(1/20)明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 免疫組化染色檢測各組支氣管組織中SIRT1與TNF-α的表達(×200)

二、 各組氣管成纖維細胞SIRT1 mRNA與蛋白表達檢測

qRT-PCR和Western blot 檢測結(jié)果(見圖2、表1)所示，與空白對照組比較，siRNA-SIRT1組氣管成纖維細胞中SIRT1 mRNA和蛋白相對表達水平顯著降低(P<0.05)?？瞻讓φ战M與siRNA-NC 組SIRT1 mRNA及蛋白相對表達水平之間無顯著差異(P>0.05)。

圖2 Western blot檢測細胞SIRT1蛋白表達

表1 各組氣管成纖維細胞中SIRT1 mRNA與蛋白表達水平比較

三、 siRNA轉(zhuǎn)染后各組氣管成纖維細胞增殖水平比較

CCK-8 實驗結(jié)果(見表2)所示，與空白對照組比較，TGF-β1組的氣管成纖維細胞增殖水平顯著增加(P<0.05)。與TGF-β1組比較，siRNA-SIRT1+TGF-β1組細胞增殖水平顯著降低(P<0.05)，siRNA-NC+TGF-β1組與TGF-β1組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 各組氣管成纖維細胞吸光度值比較

四、 siRNA轉(zhuǎn)染后各組氣管成纖維細胞周期分布

流式細胞術檢測結(jié)果(見圖3、表3)所示，與空白對照組比較，TGF-β1組的氣管成纖維細胞G0/G1期細胞比例顯著增加，而S期細胞比例顯著減少(P<0.05)。siRNA-SIRT1+TGF-β1組較TGF-β1組G0/G1期細胞比例顯著減少，同時S期細胞比例顯著增加(P<0.05)，siRNA-NC+TGF-β1組各期細胞比例與TGF-β1組各期細胞比例之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

表3 各組氣管成纖維細胞周期分布比例比較

五、 siRNA轉(zhuǎn)染后各組氣管成纖維細胞α-SMA熒光染色比較

免疫熒光染色結(jié)果(見圖4)所示，TGF-β1組α- SMA 特異性免疫細胞化學陽性染色較空白對照組明顯增加。與TGF-β1組比較，siRNA-NC+TGF-β1組α-SMA 特異性免疫細胞化學陽性染色無明顯變化，而siRNA-SIRT1+TGF-β1組α-SMA 特異性免疫細胞化學染色陽性明顯減弱。

圖3 流式細胞術檢測氣管成纖維細胞周期分布情況

圖4 免疫熒光染色檢測各組氣管成纖維細胞中α-SMA表達(×200)

六、 siRNA轉(zhuǎn)染后各組氣管成纖維細胞中PCNA、TNF-α、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ蛋白表達比較

Western blot檢測結(jié)果(見圖5、表4)所示，與空白對照組比較，TGF-β1組的氣管成纖維細胞中PCNA、TNF-α、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ 的蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)。siRNA-SIRT1+TGF-β1組PCNA、TNF-α、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ 的蛋白表達水平較TGF-β1組均顯著下降(P<0.05)，而siRNA-NC+TGF-β1組與TGF-β1組各蛋白表達水平間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖5 Western blot檢測各組氣管成纖維細胞中PCNA、TNF-α、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ蛋白表達

表4 各組氣管成纖維細胞PCNA、TNF-α、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ蛋白表達水平比較

七、 siRNA轉(zhuǎn)染后各組氣管成纖維細胞中CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ mRNA表達比較

qRT-PCR檢測CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ mRNA表達水平，結(jié)果(見表5)，TGF-β1組的氣管成纖維細胞中CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ mRNA相對表達水平較空白對照組顯著升高(P<0.05)。而與TGF-β1組比較，siRNA-SIRT1+TGF-β1組CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ mRNA相對表達水平顯著下降(P<0.05)，siRNA-NC+TGF-β1組與TGF-β1組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(見表5)。

表5 各組氣管成纖維細胞CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ mRNA表達水平比較

討 論

氣道狹窄的特征是氣道直徑逐漸減小，許多原因引發(fā)的氣道感染可引起氣管或支氣管黏膜損傷從而導致異常上皮的再形成，然后正常的氣管壁組織被纖維組織所替代，致使氣道狹窄的發(fā)生[3-4]。這些原因主要包括結(jié)核病、真菌感染、細菌性氣管炎、組織胞漿菌病以及白喉，其中最常見的是結(jié)核病[7]。深入研究結(jié)核性氣道狹窄的發(fā)病機制，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點，對于結(jié)核性氣道狹窄的治療具有重大意義。

組蛋白脫乙?；?histone deacetylase ，HDAC)是一類可催化從組蛋白和非組蛋白中去除N-乙酰-L-賴氨酸氨基酸殘基中的乙?；?，并抑制組蛋白乙酰化的酶[8]。Sirtuins是高度保守的NAD依賴的Ⅲ類組蛋白脫乙酰基酶，SIRT1作為研究較為廣泛的組蛋白脫乙?；傅某蓡T，已有研究表明，SIRT1能夠調(diào)節(jié)肝、胰腺和腦組織中的氧化應激和炎癥反應[9-11]。此外，Dvir-Ginzberg等人發(fā)現(xiàn)軟骨細胞中SIRT1表達水平的升高導致軟骨特異性基因聚集蛋白聚糖、2型膠原和9型膠原表達急劇增加，而SIRT1水平降低后則顯著抑制了這些基因的表達[12]。Simic等人的研究表明乳腺癌細胞中SIRT1能夠負調(diào)節(jié)上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型，從而促進癌細胞的凋亡，抑制癌細胞擴散與轉(zhuǎn)移[13]。

本研究通過檢測結(jié)核性氣道狹窄患者的氣道增生肉芽組織中SIRT1表達發(fā)現(xiàn)，該組織中SIRT1表達異常增高。接著，通過沉默體外培養(yǎng)的氣管成纖維細胞中 SIRT1 基因的表達，檢測細胞增殖的變化情況，研究結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染了SIRT1 siRNA的氣管成纖維細胞中，細胞增殖明顯受限，G0/G1期細胞比例減少，使得細胞阻滯于S期。PCNA作為反映細胞增殖的標志物，其表達水平的升高表明細胞增殖活躍[14]。本研究結(jié)果同樣顯示，在沉默氣管成纖維細胞中SIRT1表達后，細胞中PCNA蛋白表達明顯下降。以上結(jié)果均表明，沉默SIRT1表達可抑制氣管成纖維細胞的增殖速度。

α-SMA是平滑肌細胞的標志物，研究中常用來反映成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞以及肌成纖維細胞收縮能力的改變，其表達水平升高表明膠原蛋白的合成增加[15]。CoL-Ⅰ與CoL-Ⅲ是肌細胞外間質(zhì)主要成分，膠原蛋白的表達上調(diào)會引起細胞外基質(zhì)沉積，導致組織功能受損[16]。本研究結(jié)果表明，氣管成纖維細胞在TGF-β1 誘導下α-SMA、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ表達水平均升高，而在沉默細胞中SIRT1表達后，α-SMA、CoL-Ⅰ及CoL-Ⅲ表達水平降低。此外，本研究檢測發(fā)現(xiàn)氣道增生肉芽組織中TNF-α表達增加，而沉默氣管成纖維細胞中SIRT1表達后，TNF-α表達下調(diào)。研究表明，TNF-α作為重要的細胞因子參與炎癥反應，促進成纖維細胞增殖及分化，并促進細胞外基質(zhì)合成[17]。這一結(jié)果提示沉默SIRT1能夠抑制膠原合成和細胞外基質(zhì)堆積，阻止結(jié)核性氣道狹窄的發(fā)展。

綜上所述，本研究揭示了SIRT1在結(jié)核性氣道狹窄的氣道增生肉芽組織中呈現(xiàn)高表達，而沉默氣管成纖維細胞中SIRT1表達后，可降低TGF-β1誘導下細胞增殖速度的加快，使細胞發(fā)生周期停滯，并抑制細胞的分化。但此過程中的具體作用機制還需進行深入探究，以期為結(jié)核性氣道狹窄的診治提供新思路。