徐娟娟，劉鑫，賀丹，逯久幸，栗燕

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林與藝術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

牡丹(Paeoniasuffruticosa)屬多年生落葉灌木，其花朵碩大、花型繁多、花色艷麗，具有較高的觀賞價值，迄今已有1 650多年的栽培歷史[1]，實(shí)現(xiàn)牡丹連年盆栽種植，一直是家庭養(yǎng)花愛好者追求的目標(biāo)。然而,牡丹盆栽種植后常常出現(xiàn)植株矮小、花蕾敗育的現(xiàn)象，觀賞價值大大降低，這已成為盆栽牡丹產(chǎn)業(yè)化發(fā)展中的瓶頸問題。已有研究表明,牡丹盆栽種植后，由于根域受到限制，葉片光合速率降低，蔗糖供應(yīng)不足，從而導(dǎo)致盆栽植株生長發(fā)育不良[2]。蔗糖在植物體內(nèi)運(yùn)輸有共質(zhì)體與質(zhì)外體2種途徑，共質(zhì)體途徑通過胞間連絲運(yùn)輸蔗糖，質(zhì)外體途徑則需要借助于蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[3]。目前已知的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有SUT(sucrose transporters)、SWEET(sugars will eventually be exported transporters)和ANN(Annexins)。SUT負(fù)責(zé)將蔗糖裝載至源葉的韌皮部，以及將蔗糖卸載至如貯藏根、塊莖、果實(shí)、發(fā)育中的組織等庫組織的細(xì)胞中[4]，SWEET將細(xì)胞內(nèi)的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)至質(zhì)外體[5]，而ANN是新近發(fā)現(xiàn)的與蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白。WANG等[6]首次發(fā)現(xiàn),擬南芥AtANN1和AtANN2參與蔗糖從韌皮部向根尖的運(yùn)輸過程。在無糖條件下培養(yǎng)的ANN突變體幼苗，與野生型相比，根冠中含有淀粉粒的柱狀細(xì)胞層數(shù)減少，周圍無邊界狀細(xì)胞，淀粉含量減少，但這種缺陷通過添加蔗糖可以修復(fù)，表明ANN1和ANN2可能參與蔗糖從韌皮部向根尖轉(zhuǎn)運(yùn)。GUILHERME等[7]在‘Beauregard’和‘Tanzania’甘薯中發(fā)現(xiàn)了包括ANN在內(nèi)的5個與根系發(fā)育和蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的基因，ANN基因在這2種甘薯的葉片、不同天數(shù)的根中均有表達(dá)，說明該基因可能參與了甘薯根部蔗糖的轉(zhuǎn)運(yùn)?；谀档ぴ耘嗌砼c分子生物學(xué)課題組前期對PsSUT1[8]、PsSUT2[9]、PsSWEETs[10]的研究，從‘洛陽紅’牡丹盛花期花瓣的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，篩選出一個可能調(diào)控開花相關(guān)的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因ANN[11]，并對其生物信息學(xué)及表達(dá)特性進(jìn)行分析，為后續(xù)驗(yàn)證該基因功能，探尋盆栽牡丹生長發(fā)育不良的機(jī)理，改善牡丹生長發(fā)育狀況提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料取自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)第三生活區(qū)盆栽牡丹，品種為‘鳳丹’砧‘洛陽紅’。以盛花期的花瓣為材料進(jìn)行PsANN1基因的克隆，以盛花期的根、莖、葉、花和小風(fēng)鈴期(2019年3月17日)、圓桃期(2019年3月27日)、盛花期(2019年4月9日)、謝花期(2019年4月15日)的花瓣為材料進(jìn)行PsANN1基因的表達(dá)分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA的合成 參照李永華改良CTAB法[12]提取‘鳳丹’砧‘洛陽紅’盛花期根、莖、葉、花和小風(fēng)鈴期、圓桃期、盛花期、謝花期的花瓣總RNA。檢測合格后使用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)合成cDNA第一條鏈，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2PsANN1基因的克隆及鑒定 據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組測序獲得的序列利用 Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)一對特異性擴(kuò)增引物PsANN1-F:5’-ATGGCTACAATCATTGCCCCTC-3’和PsANN1-R：5’- TTAGTCCCCAAGCAAAGTGAGG-3’，送至鄭州尚亞生物技術(shù)有限公司合成。以1.2.1方法反轉(zhuǎn)錄獲得的盛花期花瓣cDNA為模板，使用1.1×T3 Super PCR Mix(擎科生物科技(鄭州)有限公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為25 μL：cDNA (100 ng·μL-1) 1 μL，1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL，上、下游引物各1 μL。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共 35個循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳后，使用DNA純化回收試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)對目的片段進(jìn)行回收與純化，并將純化后的目的片段與pMD18-T克隆載體連接(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)，PCR篩選陽性菌株，送至鄭州擎科生物公司測序。

1.2.3PsANN1基因生物信息學(xué)分析、進(jìn)化樹構(gòu)建 利用DNAMAN軟件把克隆得到的核苷酸序列通過推導(dǎo)得到氨基酸序列。使用NCBI基于氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域分析(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，并篩選同源序列(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)。使用ProtScale在線分析PsANN1蛋白的理化性質(zhì)，預(yù)測其親水性和疏水性(https://web.expasy.org/protscale/)。利用SOPMA預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)，利用SWISS-MODEL預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)(https://swissmodel.expasy.org/interactive)。使用 DNAMAN對氨基酸序列進(jìn)行多序列比較，利用在線軟件MEME進(jìn)行氨基酸保守基序分析(基序最大發(fā)現(xiàn)值設(shè)為5，其他參數(shù)均設(shè)為默認(rèn)值)(http://meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi)，并利用 MEGA7.0 (鄰接法)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4PsANN1基因表達(dá) 根據(jù)克隆測得的PsANN1序列設(shè)計(jì)qRT-PCR特異性引物(qPCR-PsANN1-F:5’-GGAGCCTTGATTACCGAGTG-3’,qPCR-PsANN1-R:5’-CAATGCCTTGTCCTTGATAG-3’),并以牡丹泛素延伸蛋白Ubiquitin(Ubiq)基因?yàn)閮?nèi)參[13](Ubiq-F:5’-AGCCCATATTCAGGAGGTGT-3’,Ubiq-R:5’-GCAATCTCAGGTACAAGGGG-3’),以1.2.1中得到的‘鳳丹’砧‘洛陽紅’盛花期的根、莖、葉、花，以及小風(fēng)鈴期、圓桃期、盛花期、謝花期的花瓣的cDNA為模板，使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)(寶生物工程(大連)有限公司)，在熒光定量分析儀QuantStudio 5(美國Thermo Fisher Scientific公司)上進(jìn)行PsANN1基因在組織特異性和不同花期花瓣中表達(dá)水平的測定。擴(kuò)增體系20 μL：cDNA (100 ng·μL-1) 2 μL，TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL，ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL，上、下游引物各0.8 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。所有處理均設(shè)3次重復(fù)。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；95 ℃ 變性15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃變性1 s。使用 2-ΔΔCt方法和SPSS 19.0軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹PsANN1基因的克隆及推導(dǎo)的氨基酸序列

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中已知ANN基因序列設(shè)計(jì)特異引物，以盛花期花瓣cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)體積分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測到特異擴(kuò)增條帶(圖1)。測序結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物長度為939 bp，編碼312個氨基酸(圖2)。DNAMAN軟件分析結(jié)果表明，此擴(kuò)增序列包含完整開放閱讀框(open reading frame，ORF)，將該基因命名為PsANN1，GeneBank登錄號為MK550694。

注：M:DL 2 000標(biāo)記；泳道1：無樣品；泳道2:為PsANN1基因擴(kuò)增產(chǎn)物。Note:M:DL 2 000 DNA Marker;Lane 1:No sample;Lane 2:PsANN1 gene amplification product.圖1 PsANN1基因RT-PCR擴(kuò)增Fig.1 RT-PCR amplification of PsANN1 gene

圖2 PsANN1基因的ORF序列與推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 ORF sequence and deduced amino acid sequence of PsANN1 gene

2.2 牡丹PsANN1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)

利用NCBI中的ExPASy ProtPra在線軟件對PsANN1基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析。分析表明，該蛋白分子式為C1566H2550N456O474S6，相對分子質(zhì)量35.54 kD，等電點(diǎn)8.20。該蛋白中Ala(10.6%)和Leu(10.3%)含量相對較多，Met(0.6%)和Trp(0.6%)含量相對較少?？偟膸ж?fù)電荷殘基Asp+Glu數(shù)目為48，帶正電荷殘基Arg+Lys 數(shù)目為50。由圖3可知，分值為負(fù)的氨基酸明顯多于分值為正的氨基酸，且平均親水系數(shù)-0.395，因此可推測該蛋白為親水性蛋白。

圖3 PsANN1蛋白的疏水性預(yù)測Fig.3 Hydrophobicity prediction of PsANN1 protein

2.3 牡丹PsANN1蛋白二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)及功能結(jié)構(gòu)域的預(yù)測

利用SOPMA對PsANN1蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，通過預(yù)測結(jié)果可知，該蛋白主要由 α-螺旋(70.83%)、無規(guī)卷曲(20.19%)、擴(kuò)展鏈(6.73%)、β-轉(zhuǎn)角(2.24%)組成(圖4)。使用SWISS-MODEL對PsANN1蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(圖5)，PsANN1蛋白與黃麻(Corchoruscapsularis)、野草莓、月季的ANN蛋白三級結(jié)構(gòu)高度相似。通過NCBI軟件分析該蛋白的功能結(jié)構(gòu)域(圖6)，結(jié)果表明，該蛋白包含4個重復(fù)的 Annexin 保守結(jié)構(gòu)域，其中第2和第3個基本結(jié)構(gòu)單位有一定的缺失和突變。

圖4 PsANN1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Prediction of the secondary structure of PsANN1 protein

注：A.牡丹；B.黃麻；C.野草莓；D.月季。Note:A.Paeonia suffruticosa；B.Corchorus capsularis；C.Fragaria vesca subsp.vesca；D.Rosa chinensis.圖5 PsANN1蛋白及其同源蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Tertiary structure analysis of PsANN1 and other homologous proteins

圖6 PsANN1基因ORF序列的功能結(jié)構(gòu)域Fig.6 The functional domain of the ORF sequence of PsANN1 gene

2.4 牡丹PsANN1基因的氨基酸序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

使用DNAMAN軟件將PsANN1編碼氨基酸的序列，與其他植物ANN基因的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對。結(jié)果顯示，牡丹PsANN1編碼的氨基酸序列與黃麻(OMP03638.1)、野草莓(XP_004307132.1)、可可(Theobromacacao.XP_017984838.1)、月季(XP_024176879.1)、石榴(Punicagranatum.OWM90035.1)、歐洲栓皮櫟(Quercussuber.XP_023879336.1)、榴蓮(Duriozibethinus.XP_022764810.1)的同源性分別為78.14%、77.17%、76.85%、75.88%、75.56%、74.92%、74.60%。

通過MEME在線軟件對以上植物ANN基因的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，共鑒定出5個相同的保守區(qū)域(圖7)，其中保守區(qū)域1內(nèi)存在annexin repeat Ⅰ，保守區(qū)域3內(nèi)存在annexin repeat Ⅱ，保守區(qū)域4內(nèi)存在annexin repeat Ⅲ，保守區(qū)域5內(nèi)存在annexin repeat Ⅳ，annexin repeat Ⅰ～Ⅳ是膜聯(lián)蛋白基因典型的4個重復(fù)保守結(jié)構(gòu)域，由此可確定，從‘鳳丹’砧‘洛陽紅’牡丹中克隆獲得的序列為ANN基因。

為了進(jìn)一步研究PsANN1蛋白與其他ANN類蛋白的親緣關(guān)系，構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖8-A)，結(jié)果表明，在這8個ANN的進(jìn)化關(guān)系中，牡丹與月季和野草莓親緣關(guān)系較近(圖8-B)。錦葵科(Malvaceae)的榴蓮(Duriozibethinus)與可可(Theobromacacao)的ANN基因聚為一束，薔薇科(Rosaceae)的月季與野草莓的ANN基因聚為一束，這與他們之間的親緣關(guān)系較近有關(guān)。

注：方框1、2、3、4、5為保守區(qū)域；紅色下劃線部分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ為4個annexin repeats。Note:The box1,2,3,4,and 5 are the conserved domain;the red underlined parts Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,and Ⅳ are 4 annexin repeats.圖7 牡丹PsANN1氨基酸與其他植物ANN氨基酸序列比對及保守區(qū)域。Fig.7 Amino acid sequence alignment and conserved regions of PsANN1 amino acid of peony.and ANN amino acid of other plants

2.5 牡丹PsANN1基因在不同組織及不同花期花瓣中的相對表達(dá)量分析

對PsANN1在盛花期‘洛陽紅’牡丹不同組織部位樣品進(jìn)行qRT-PCR檢測，結(jié)果表明,以根部的表達(dá)量為參照，PsANN1在花瓣中的表達(dá)量最高，是根部表達(dá)量的24.95倍，差異達(dá)顯著水平，在莖中的表達(dá)量為根的3.46倍，在葉片的表達(dá)量極低，僅為根的0.003倍，差異達(dá)顯著水平(圖9-A)。以PsANN1基因在‘洛陽紅’牡丹小風(fēng)鈴期花瓣中的表達(dá)量為參照，圓桃期、盛花期和謝花期的PsANN1基因表達(dá)量分別是小風(fēng)鈴期的26.66倍、149.47倍和9.26倍，差異均達(dá)顯著水平，且表達(dá)量從小風(fēng)鈴期至盛花期迅速增加，盛花期的表達(dá)量最高(圖9-B)。

注：A:系統(tǒng)進(jìn)化樹；B：氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域。Note:A:Phylogenetic tree;B:Conserved domain of amino acid sequence.圖8 植物PsANN1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.8 Phylogenetic tree of plant PsANN1 gene

圖9 PsANN1基因在‘洛陽紅’牡丹不同組織部位和不同花期花瓣中的相對表達(dá)量Fig.9 Relative expression of PsANN1 gene in different tissue parts of ‘Luoyanghong’ tree peony and petals of different flowering stages

3 結(jié)論與討論

自1989年首次從番茄(Lycopersiconesculentum)中克隆出ANN基因以來[14]，陸續(xù)從蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)[15]、普通小麥(Triticumaestivum)[16]、玉米(Zeamays)[17]等多種植物中分離出來。根據(jù)FENG等[18]、JAMI等[19]、HOSHINO等[20]的研究，植物膜聯(lián)蛋白的相對分子質(zhì)量通常在32～42 kD之間。本試驗(yàn)從‘鳳丹’砧盛花期‘洛陽紅’牡丹花瓣中克隆得到了膜聯(lián)蛋白基因PsANN1，其CDS區(qū)長939 bp，編碼312個氨基酸，相對分子質(zhì)量為35.54 kD。將PsANN1編碼的氨基酸序列與其他植物ANN基因的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對以及保守結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)PsANN1基因編碼的氨基酸序列與黃麻同源性最高，達(dá)78.14%，膜聯(lián)蛋白4個重復(fù)保守結(jié)構(gòu)域存在于鑒定出的5個相同保守區(qū)域中。對PsANN1蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域的預(yù)測，可知該蛋白主要由 α-螺旋組成，與黃麻、野草莓、月季的ANN蛋白的三級結(jié)構(gòu)高度相似，包含4個重復(fù)的 Annexin 保守結(jié)構(gòu)域，其中第2和第3個基本結(jié)構(gòu)單位有一定的缺失和突變，這一結(jié)果與花生(Arachishypogaea)[21]、芥菜(Brassicajuncea)[22]中克隆得到的膜聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域一致，符合植物膜聯(lián)蛋白的進(jìn)化特點(diǎn)。

已有研究表明,ANN基因在不同植物的不同組織均有表達(dá)，但表達(dá)情況不盡相同?；ㄉ鶤hAnn1在根、莖、葉中均有表達(dá)，莖的表達(dá)量最高，根的表達(dá)量最低[21]；苦蕎(Fagopyrumtataricum)FtANX1在根、莖、葉、花及未成熟的果實(shí)中均有表達(dá)，在未成熟的果實(shí)中表達(dá)量最多，在葉中的表達(dá)量最少[23]；擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtANN1在所有部位均有表達(dá)且在莖中表達(dá)量最高[24]。本研究中qRT-PCR結(jié)果顯示，PsANN1基因在‘洛陽紅’牡丹根、莖、葉、花中均有表達(dá)，但在花中表達(dá)量最多，莖中次之，葉片中最少，表明PsANN1基因主要在‘洛陽紅’牡丹的花器官(庫器官)中發(fā)揮重要作用，這與苦蕎中ANN基因的表達(dá)量結(jié)果相似，與花生ANN基因的表達(dá)量結(jié)果不一致，可能與物種間的遺傳差異有關(guān)。ANN基因在同一植物組織部位的不同發(fā)育時期的也有表達(dá)，棉花(Gossypiumhirsutum)GhAnn3、GhAnn4和GhAnn5基因主要在棉纖維伸長期表達(dá)[25]；GhFAnn1和GhFAnnx在纖維發(fā)育的不同時期均有表達(dá)，且表達(dá)量均很高[26]；草莓(Fragaria×ananassa)ANN基因隨著果實(shí)發(fā)育成熟，表達(dá)量逐漸增加[27]。PsANN1基因在開花的不同時期中，隨著花瓣的伸長與增大，自小風(fēng)鈴期至盛花期表達(dá)量迅速增加，盛花期表達(dá)量最多，推測PsANN1基因在‘洛陽紅’牡丹從小風(fēng)鈴期到盛花期的開花轉(zhuǎn)變中具有重要調(diào)節(jié)作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證該推測，還需采用基因敲除或構(gòu)建超表達(dá)載體等手段，轉(zhuǎn)化模式植物，進(jìn)一步驗(yàn)證該基因的功能。