宋天歌， 張靖， 陳雪， 申世剛， 竇海洋

(1. 河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；2. 河北大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000)

小米起源于中國(guó)黃河流域，不僅是世界上最早栽培農(nóng)作物之一，還是中國(guó)主要的糧食作物之一.小米具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，被用于生產(chǎn)食品和飲品.而這些產(chǎn)品的品質(zhì)在很大程度上與其淀粉成分的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)有關(guān)[1].

淀粉主要由直鏈淀粉(amylose, AM)和支鏈淀粉(amylopectin, AP)組成,其中，線性的AM分子是由α-(1→4)糖苷鍵連接而成的；AP分子的分支度高，分子質(zhì)量大，構(gòu)成淀粉顆粒的骨架[2].在分子結(jié)構(gòu)上直鏈淀粉葡萄糖鏈上的氫鍵更廣泛，葡萄糖分子排列較整齊，食用后不容易被消化，而支鏈淀粉與酶接觸的表面積更大，更容易被分解[3].在淀粉中，AM和AP的比例對(duì)淀粉的結(jié)構(gòu)、糊化溫度、溶解性、黏度、水結(jié)合能力和退化行為有重要影響，進(jìn)而影響小米產(chǎn)品品質(zhì).食物的穩(wěn)定性、消化性等功能特性，儲(chǔ)存過(guò)程中的口感和硬度以及傳統(tǒng)淀粉類產(chǎn)品的保質(zhì)期都與淀粉退化密切相關(guān)[4].退化的淀粉被用于功能食品的開發(fā)，例如降低糖尿病和心血管疾病患病風(fēng)險(xiǎn)可以通過(guò)食用退化淀粉食品來(lái)實(shí)現(xiàn)[5].目前，雙波長(zhǎng)分光光度法和近紅外光譜法用于測(cè)定淀粉中AM和AP，但由于需要構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線或精準(zhǔn)模型，對(duì)于未知樣品的檢測(cè)有一定的局限性.因此，發(fā)展準(zhǔn)確高效的AM和AP的分離檢測(cè)技術(shù)具有重要意義.

在1987年由Wahlund和Giddings博士[6]提出了可用于分離表征大分子和納米顆粒的非對(duì)稱場(chǎng)流分離(asymmetrical flow field-flow fractionation, AF4)技術(shù).該技術(shù)可成功分離表征蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)復(fù)合物、納米級(jí)/微米級(jí)粒子、亞細(xì)胞單元和聚合物[7].AF4主要通過(guò)外加力場(chǎng)的作用，根據(jù)樣品粒徑大小的差異達(dá)到分離目的.AF4無(wú)固定相，降低了剪切力對(duì)支鏈淀粉降解的風(fēng)險(xiǎn).AF4與示差折光檢測(cè)器(differential refractive index,dRI)和多角度激光光散射檢測(cè)器(multiangle light scattering,MALS)聯(lián)用已應(yīng)用于淀粉的分離表征[8].鮮有關(guān)于AF4-MALS-dRI研究m(AM)/m(AP)比值對(duì)淀粉退化行為的報(bào)道.本文采用堿性甘油超聲法提取普通小米直鏈淀粉，改變其m(AM)/m(AP)的比值，通過(guò)AF4-MALS-dRI結(jié)合其他表征手段對(duì)3種不同m(AM)/m(AP)比值的小米淀粉的理化性質(zhì)及其退化行為進(jìn)行研究.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

普通小米和蠟質(zhì)小米(農(nóng)林科學(xué)院谷子研究所，河北省).NaOH、Na2HPO4、NaNO3、NaCl、NaH2PO4、NaN3(麥克林生化科技有限公司，上海)，C3H8O3、C2H5OH(科密歐化學(xué)試劑有限公司，天津)，HCl(北京化工廠，北京)，所用試劑均為AR級(jí).

場(chǎng)流分離系統(tǒng)(Eclipse AF4)(Wyatt公司，德國(guó))；多角度激光光散射檢測(cè)器(DAWN HELEOS Ⅱ MALS)(Wyatt公司，美國(guó))；示差折光檢測(cè)器(Agilent 1260 Infinity ⅡdRI)；液相泵(Agilent 1260)(Agilent公司，德國(guó))；電熱鼓風(fēng)干燥箱(DHG-914385-Ⅲ)(新苗醫(yī)療器械制造有限公司，上海)；超純水系統(tǒng)(Milli-Q Advantage A 10)(Millipore公司，美國(guó))；數(shù)控超聲波清洗機(jī)(KQ5200DE)(昆山超聲儀器有限公司，上海).

1.2 小米淀粉樣品的制備

普通小米淀粉和蠟質(zhì)小米淀粉根據(jù)張靖等[9]的方法進(jìn)行提取.去除小米淀粉中的AM淀粉參考Setyawati等[10]的方法.稱取2.0 g干燥且過(guò)100目(150 μm)篩的小米淀粉，加入到8.0 g質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%混合的堿性甘油(1 mol/L NaOH)中，攪拌均勻，置于70 ℃水浴200 W超聲1 h.攪拌1 h轉(zhuǎn)速為200 r/min，4 615 r/min離心10 min，倒掉液體，除去上層雜質(zhì)，將下層白色物質(zhì)，水洗3次，除去多余的甘油和NaOH.用無(wú)水乙醇洗滌沉淀，在烘箱中40 ℃烘至恒重，最終得到由堿性甘油超聲提取AM的小米淀粉.

堿性甘油超聲提取小米直鏈淀粉的反應(yīng)機(jī)理如圖1所示.由于AM和AP結(jié)構(gòu)不同[11]，AM是相對(duì)較長(zhǎng)的線性分子，其螺旋結(jié)構(gòu)具有疏水性，允許與有機(jī)分子形成疏水鍵，使AM容易從淀粉顆粒中游離出來(lái).而AP的短支鏈較多，大部分不會(huì)與有機(jī)化合物形成足夠長(zhǎng)的螺旋狀絡(luò)合物.在天然AM中[10]，每取代1個(gè)羥基，就增加2個(gè)去質(zhì)子化的甘油羥基，可以增強(qiáng)AM在水中的親水性，而取代基的隨機(jī)位置可以防止AM分子形成非極性外螺旋盤管，容易從水中沉淀出來(lái).因此，用該方法可以去除淀粉顆粒中的AM.

圖1 提取直鏈淀粉的反應(yīng)機(jī)理[10]Fig.1 Reaction mechanism of extraction of amylose

1.3 小米淀粉的退化

將普通小米淀粉、蠟質(zhì)小米淀粉和堿性甘油提取的小米淀粉按照張靖等[9]的方法進(jìn)行溶解(2.0 g/L)，在4 ℃保存7 d進(jìn)行AF4檢測(cè).將樣品溶液放置室溫，使用去離子水稀釋至0.4 g/L，渦旋并靜置5.0 min進(jìn)行檢測(cè).

1.4 小米淀粉的表征

掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy, SEM)：在5 kV的電壓下，使用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(Nova NanoSEM450美國(guó))觀察放大2 000倍后表面噴金的淀粉顆粒.

傅里葉變換紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)：用于淀粉樣品的結(jié)構(gòu)分析.通過(guò)傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet iS10美國(guó))，在4 000～400 cm-1將干燥過(guò)篩后的淀粉樣品以4 cm-1的分辨率掃描16次.

X線衍射(X-ray diffraction,XRD)：分析樣品的晶型.將不同AM/AP比值的小米淀粉均勻平鋪于X線衍射光譜儀(D8 ADVANCE德國(guó))試板中心，圖譜2θ記錄在40 kV和40 mA下5～35°掃描速率為1.5(°)/min，采樣間隔為0.02°.

差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry, DSC)：分析樣品的熱力學(xué)性質(zhì).通過(guò)差示掃描量熱儀(DSC-60日本Shimadzu公司)測(cè)定樣品.加熱速率為10 ℃/min，加熱25～200 ℃.在鋁制坩堝中稱取2.0 mg樣品，加入去離子水6.0 μL，密封并室溫放置2 h平衡，進(jìn)行DSC測(cè)試，記錄起始溫度(To)、終止溫度(Tc)、糊化焓(ΔH)、和峰值溫度(Tp).

1.5 非對(duì)稱場(chǎng)流分離技術(shù)

采用由聚碳酸酯上殼、不銹鋼滲透熔塊下板、截流量為10 ku的超濾膜、350 μm的聚酯梯形墊片組成的AF4通道對(duì)不同m(AM)/m(AP)比值的小米淀粉樣品進(jìn)行檢測(cè)，流動(dòng)相為10 mmol/L NaNO3+3 mmol/L NaN3(pH=7.00)并用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，使用0.1 μm YYLP 膜過(guò)濾器(Millipore, 德國(guó))在液相泵和AF4系統(tǒng)間進(jìn)行過(guò)濾，以確保進(jìn)入系統(tǒng)樣品無(wú)大顆粒干擾檢測(cè).以50 μL和0.4 g/L的體積和質(zhì)量濃度進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)樣流速和檢測(cè)器流速分別為0.2、1.0 mL/min，初始洗脫流速為1.2 mL/min，并以指數(shù)衰減降低到0.05 mL/min，歷時(shí)14 min，t1/2=3.0 min.數(shù)據(jù)處理軟件為ASTRA7.1.3，折光指數(shù)增量(dn/dc)為0.146 mL/g，以Berry模式[12]對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合.

2 結(jié)果與討論

2.1 小米淀粉顆粒的SEM表征

圖2為3種不同AM/AP比值的小米淀粉顆粒的SEM圖.由圖2可知，3種不同m(AM)/m(AP)比值的小米淀粉的顆粒相貌相似，顆粒直徑為3～15 μm，大小不一，表面具有凹陷，呈不規(guī)則多面體型結(jié)構(gòu)，與文獻(xiàn)中有關(guān)小米淀粉顆粒形貌的報(bào)道一致[1].利用超聲和堿性甘油處理后的小米淀粉與普通小米淀粉的顆粒形貌無(wú)明顯差異.

a.普通小米淀粉；b.蠟質(zhì)小米淀粉；c.堿性甘油處理后小米淀粉.圖2 小米淀粉的SEMFig.2 SEM images of millet starches

2.2 小米淀粉顆粒的FTIR表征

圖3為3種小米淀粉的FTIR圖譜.圖3a中3 300 cm-1附近的紅外吸收峰對(duì)應(yīng)O—H的拉伸，表明氫鍵存在于分子內(nèi)和分子間；2 925 cm-1處的紅外吸收峰，與CH2的伸縮振動(dòng)有關(guān)[13].圖3b中由于淀粉無(wú)定形區(qū)域中存在少量水在1 641 cm-1處出現(xiàn)吸收峰[14]；由于脫水葡萄糖環(huán)的C—O鍵拉伸在1 076 cm-1和997 cm-1處有吸收峰的存在[15]；淀粉葡萄糖單元中吡喃糖環(huán)的骨架模式吸收峰產(chǎn)生在760 cm-1和708 cm-1處[16]；由C—O—H振動(dòng)在1 335 cm-1處表現(xiàn)出吸收峰；α-1,4糖苷鍵的骨架(C—O—C)振動(dòng)產(chǎn)生928 cm-1處的吸收峰[17]；—CH2結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)859 cm-1處吸收峰[18].通過(guò)對(duì)比普通小米淀粉與堿性甘油處理的小米淀粉，其特征吸收峰的位置無(wú)明顯變化，證明堿性甘油處理并沒(méi)有引起官能團(tuán)的改變.

圖3 小米淀粉的FTIR圖譜Fig.3 FTIR spectra of millet starches

圖3中1 047 cm-1附近的特征吸收峰表示為淀粉顆粒中有序排列的結(jié)晶區(qū).1 022 cm-1處的特征吸收峰表現(xiàn)為無(wú)定形非結(jié)晶區(qū).定量反映淀粉顆粒中結(jié)晶區(qū)與非結(jié)晶區(qū)比例可用1 047 cm-1/1 022 cm-1處的比值表示.表1中R1047/1022為3種不同m(AM)/m(AP)比值的樣品在1 047 cm-1處和1 022 cm-1處的比值.比值越大說(shuō)明淀粉顆粒內(nèi)部結(jié)晶區(qū)大，AP的含量多；蠟質(zhì)小米的比值最大，質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%堿性甘油處理的小米淀粉的R1047/1022值高于普通小米淀粉，說(shuō)明堿性甘油處理去除了小米淀粉中部分AM.

2.3 小米淀粉顆粒的XRD表征

淀粉的結(jié)晶度與其物理性質(zhì)相關(guān).淀粉樣品的結(jié)晶度與結(jié)晶區(qū)的占比呈正相關(guān)，且其強(qiáng)度、硬度和密度隨結(jié)晶度的升高而增大，樣品尺寸穩(wěn)定性、耐熱性和耐化學(xué)性也愈好.由3種不同m(AM)/m(AP)比值的小米淀粉的XRD數(shù)據(jù)(圖4)得出3種小米淀粉是A型結(jié)構(gòu)的淀粉[19]，分別在15°、17°、18°、23°處有明顯的特征衍射峰.結(jié)果表明m(AM)/m(AP)的比值不影響淀粉的結(jié)晶類型.淀粉中結(jié)晶區(qū)占總體的比值即淀粉的相對(duì)結(jié)晶度.在XRD譜圖中在結(jié)晶區(qū)(AP)呈現(xiàn)尖峰特征，非結(jié)晶區(qū)(AM)呈現(xiàn)彌散狀態(tài).使用軟件Peakfit對(duì)整峰以及非結(jié)晶區(qū)面積進(jìn)行擬合，得到整體峰的面積(A)和非結(jié)晶區(qū)面積(Aa)，則結(jié)晶區(qū)面積(Ac)=A-Aa，可知相對(duì)結(jié)晶度=100%×Ac/A.由表1可得相對(duì)結(jié)晶度從低到高依次為普通小米淀粉、75%堿性甘油處理的小米淀粉和蠟質(zhì)小米淀粉.結(jié)果表明堿性甘油處理去除了部分AM與FTIR結(jié)果一致.

圖4 小米淀粉的XRD圖譜Fig.4 XRD patterns of millet starches

2.4 小米淀粉顆粒的DSC表征

不同直鏈/支鏈比例小米淀粉的糊化特性列于表1.結(jié)果顯示普通小米淀粉的焓值低于蠟質(zhì)小米淀粉，這是因?yàn)槠胀ㄐ∶椎矸壑兄辨湹矸鄣暮枯^高，蠟質(zhì)小米淀粉更多的能量進(jìn)行從有序狀態(tài)到無(wú)序狀態(tài)的相變過(guò)程[10].而質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%堿性甘油處理后的普通小米淀粉結(jié)晶度較高，淀粉顆粒中因其彌散離子的作用從而形成分子間隙，致密的晶體區(qū)域更容易被水分子通過(guò)[20]從而使得ΔH的值卻低于原樣品.

表1 小米淀粉的表征

2.5 小米淀粉的AF4表征

圖5是普通小米淀粉、蠟質(zhì)小米淀粉和質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%堿性甘油處理的小米淀粉的AF4-MALS-dRI分離譜圖.圖5a為AF4-dRI和Rg分布圖.tr=3～5 min為AM洗脫峰，tr=12～15 min為AP洗脫峰.與普通小米淀粉相比，蠟質(zhì)小米淀粉圖譜中的tr=3～5 min處的AF4-dRI信號(hào)較弱，說(shuō)明蠟質(zhì)小米淀粉中AM含量很低.質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%堿性甘油處理的小米淀粉的AF4-dRI信號(hào)比普通小米淀粉信號(hào)弱，說(shuō)明質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%堿性甘油提取了部分AM.從圖5b可知，蠟質(zhì)小米淀粉的AF4-MALS信號(hào)最低，而Mw和Rg無(wú)明顯差異，表明m(AM)/m(AP)比值越小，淀粉分子結(jié)構(gòu)越緊密.為了得到小米淀粉AM和AP的含量及比值使用Peakfit軟件對(duì)圖5a中AF4-dRI信號(hào)進(jìn)行分峰擬合(表1).結(jié)果表明質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%堿性甘油處理的小米淀粉的m(AM)/m(AP)的比值介于蠟質(zhì)小米淀粉和普通小米淀粉的比值之間，說(shuō)明堿性甘油可去除小米淀粉中部分的AM，與FTIR和XRD結(jié)果一致.

a.AFR-dRI分離圖譜和回轉(zhuǎn)半徑分布;b.AF4-MALS和分子量分布.圖5 不同m(AM)/m(AP)比值的小米淀粉的AF4-MALS-dRI分離譜圖、回轉(zhuǎn)半徑和分子量分布Fig.5 AF4-MALS-dRI fractograms，Rg and Mw distributions of millet starches with different m(AM)/m(AP) ratios

2.6 小米淀粉退化行為

圖6是3種不同m(AM)/m(AP)比值的小米淀粉在4 ℃儲(chǔ)存7 d的AF4-MALS-dRI洗脫圖譜.由圖6a可知，普通小米淀粉AF4-dRI信號(hào)在tr=3～5 min時(shí)輕微降低，在tr=12～15 min處略微升高.由于有退化現(xiàn)象出現(xiàn)，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加AF4-MALS信號(hào)明顯增強(qiáng)[8].在tr=12～15 min時(shí)蠟質(zhì)小米淀粉信號(hào)AF4-MALS和AF4-dRI信號(hào)無(wú)明顯變化.短期退化[21]中通過(guò)氫鍵作用使AM形成了雙螺旋結(jié)構(gòu)，通過(guò)氫鍵的作用在其富集區(qū)內(nèi)堆積生成結(jié)晶；而AP不易發(fā)生退化現(xiàn)象主要由于高度支化的分子結(jié)構(gòu)，其外層支鏈間形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)后需要經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間發(fā)生重結(jié)晶.蠟質(zhì)小米淀粉AM含量極低，因此沒(méi)有短期退化的現(xiàn)象，堿性甘油處理后的小米淀粉退化現(xiàn)象與普通小米淀粉相比較微弱，由于堿性甘油處理后的小米淀粉的AM減少.

由表1可知，m(AM)/m(AP)比值最高的普通小米淀粉儲(chǔ)存7 d后Mw增加最快，質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%堿性甘油處理的小米淀粉的Mw變化趨勢(shì)次之，蠟質(zhì)小米淀粉的Mw變化趨勢(shì)不明顯.AM的快速重結(jié)晶和AP緩慢重結(jié)晶會(huì)造成的Mw的增加，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明m(AM)/m(AP)比值高的小米淀粉的退化程度高.

a、c、e.AF4-dRI分離圖譜和回轉(zhuǎn)半徑分布;b、d、f.AF4-MALS和分子量分布.圖6 不同m(AM)/m(AP)比值的小米淀粉4 ℃儲(chǔ)存7 d的AF4-MALS-dRI分離譜Fig.6 AF4-MALS-dRI fractograms，Rg and Mw distributions of millet starches with different m(AM)/m(AP) ratios stored at 4 ℃ for 7 days

3 結(jié)論

本研究通過(guò)堿性甘油超聲法改變小米淀粉中AM的含量.研究發(fā)現(xiàn)小米淀粉中m(AM)/m(AP)比值與其退化行為呈正相關(guān).SEM掃描圖顯示3種不同比值的淀粉樣品形貌無(wú)明顯差異.FTIR結(jié)果表明堿性甘油處理沒(méi)有引起官能團(tuán)的改變.相對(duì)結(jié)晶度、結(jié)晶區(qū)與非結(jié)晶區(qū)的比值以及相變焓熱都與m(AM)/m(AP)比值呈負(fù)相關(guān)，由于結(jié)構(gòu)特征的影響質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%堿性甘油處理的小米淀粉焓值最低.實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明AF4-MALS-dRI是一種快速、高效可實(shí)現(xiàn)淀粉中不同m(AM)/m(AP)比值的檢測(cè)方法，同時(shí)該方法可以用于監(jiān)測(cè)淀粉的退化行為.