毛夢菌，吳佳俊，高 倩

(衢州市衢江區(qū)畜牧獸醫(yī)站，浙江 衢州 324022)

哺乳動物卵巢中含有大量的腔前卵泡，但是在發(fā)育到有腔卵泡前大約有99.9%的卵泡都走向閉鎖、退化，這無疑是動物繁殖領(lǐng)域內(nèi)巨大的浪費。卵母細(xì)胞是體外受精、胚胎移植、動物克隆和轉(zhuǎn)基因等胚胎生物技術(shù)研究和開發(fā)不可或缺的材料，然而卵母細(xì)胞來源十分匱乏成為其發(fā)展的一個制約性因素，無疑腔前卵泡的體外培養(yǎng)技術(shù)為其提供了一個有效途徑。褪黑素(MT)在生殖調(diào)控中具有重要作用，在人排卵前卵泡液中發(fā)現(xiàn)了高水平的褪黑素，提示褪黑素有可能直接參與卵泡的生殖調(diào)控。

1 材料與方法

1.1試驗材料 豬卵巢從北京市郊區(qū)屠宰場采集，經(jīng)滅菌生理鹽水洗滌后，在裝有37℃添有雙抗的滅菌生理鹽水的保溫瓶中2 h內(nèi)運回實驗室。

1.2主要化學(xué)試劑 DMEM/F12粉末(GIBICO)，F(xiàn)BS(Sigma)，抗壞血酸(Ascorbic acid，Sigma)，ITS(Gibico)，青霉素鈉(Penicillin G，Sigma)，鏈霉素(Streptomycin sulfate,Sigma)，促卵泡激素(FSH，Sigma)。

1.3主要儀器、耗材 恒溫CO2培養(yǎng)箱(Thermo)，超凈工作臺(SW-CJ-IF)，體視顯微鏡(Olympus)，倒置顯微鏡(Olympus IX-50)，96孔培養(yǎng)板(Corning Incorporated，3599)，PCR儀，離心機(jī)以及萬級凈化實驗室。

1.4試劑配制方法 DMEM/F12培養(yǎng)液的配制見表1。

表1 DMEM/F12的成分及配制方法

將上述成分分別加入500 mL滅菌Milli-Q超純水中，充分溶解后，調(diào)節(jié)pH為7.2-7.4，定容至1000 mL。溶液配制好后，用0.22 μm濾膜過濾滅菌，并用250 mL高壓滅菌玻璃瓶分裝，4℃保存。

雙抗(Penicillin Streptomycin)100×儲備液：青霉素10,000 U/mL、鏈霉素10,000 μg/mL,分裝于無菌EP管中，200 μL/管，-20 ℃凍存。

ITS(胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒酸)100×儲備液：各個成分濃度(g/L):胰島素1.00，轉(zhuǎn)鐵蛋白0.55，亞硒酸鈉0.00067，氨基乙醇0.20；原裝10 mL/瓶，分裝于無菌EP管中，200 μL/管，4 ℃避光保存。

FSH儲備液：取1 mg FSH溶解于10 mL超純水中，配成0.1 mg/mL母液，用0.22 μm微孔濾膜濾菌后分裝到0.5 mL離心管中，-20 ℃保存。

MT儲備液：在分析天平上準(zhǔn)確稱量0.2339 g MT粉末，溶解于1 mL的DMSO中，得到0.1 M的母液。分裝到0.5 mL離心管中，-20 ℃避光保存。

1.5腔前卵泡的分離和選擇

1.5.1腔前卵泡的分離液和收集液 腔前卵泡的分離液和收集液為添加1% FBS的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液，并在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中平衡4 h。

1.5.2腔前卵泡的分離 挑選表面無黃體且無大卵泡的中等大小的豬卵巢，用含雙抗的37 ℃的生理鹽水沖洗干凈，并放置于37 ℃的卵泡分離液中。用滅菌的刀片將卵巢皮質(zhì)切削成薄片(0.5 mm),用卵泡分離液清洗干凈后用無菌鑷子夾持放置于一次性塑料培養(yǎng)皿中的卵泡分離液中，用裝有針頭的1 mL注射器在體視鏡下分離卵泡。

1.5.3腔前卵泡的選擇和藻酸鹽膠球三維包裹處理 分離的卵泡收集于卵泡收集液中，用收集液洗滌后，挑選直徑在200-400 μm的健康卵泡(卵泡卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞完全被基底膜、膜細(xì)胞和基質(zhì)組織包圍)，進(jìn)行藻酸鹽的三維包裹處理后進(jìn)行培養(yǎng)(圖1A)。

1.6腔前卵泡的培養(yǎng) 基礎(chǔ)培養(yǎng)液為DMEM/F12，添加7.5% FBS、10 mU FSH、1%ITS、100 μg/mL L-AA以及不同濃度的MT，培養(yǎng)液用前在二氧化碳培養(yǎng)箱中至少平衡4 h。培養(yǎng)條件為37.5 ℃、5% CO2。采用96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL培養(yǎng)液。將挑選好的腔前卵泡隨機(jī)分組到不同的試驗組中，每孔一個卵泡，培養(yǎng)4 d，每48 h半量換液一次。

1.7各項指標(biāo)判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.7.1卵泡直徑測量 測量培養(yǎng)前卵泡直徑(第0 d)，以后每隔一天測量一次直徑(即第2 d、第4 d)，由于分離的腔前卵泡的形態(tài)并非總是呈標(biāo)準(zhǔn)的圓形，所以以基底膜外緣為準(zhǔn)，選擇測量最長距離(長徑)和與之相垂直的最短距離(短徑)，取平均值。

1.7.2卵泡細(xì)胞凋亡檢測 將培養(yǎng)第4 d的卵泡取出，在于37 ℃恒溫箱中平衡4 h的PBS液中清洗2次，在另外一份PBS液中于體視鏡下用1 mL注射器針頭對卵泡進(jìn)行破壞，將卵泡破碎物收集在1 mL離心管中，在4 ℃恒溫離心機(jī)中1 500 r/min轉(zhuǎn)動2 min。用Trizol裂解后提取總RNA后對與細(xì)胞凋亡相關(guān)的Bcl-2、Bax和Bim等三個基因進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA進(jìn)行半定量PCR。PCR體系為：1 μL cDNA、0.5 μL上下游引物、10.5 μL ddH2O、12.5 μL 2×PCR Master mix。PCR程序為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 15 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，72 ℃ 10 min，共進(jìn)行30次循環(huán)。PCR結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外燈下進(jìn)行觀察，比較各組的細(xì)胞凋亡情況。

1.8試驗分組及測定指標(biāo)

1.8.1生長發(fā)育測定 比較在體外培養(yǎng)的豬腔前卵泡在不同濃度褪黑素(0、10-11M、10-9M、10-7M)的培養(yǎng)液中，對于卵泡生長發(fā)育情況的影響。

1.8.2基因表達(dá)測定 比較在體外培養(yǎng)的豬腔前卵泡在不同濃度褪黑素(0、10-11M、10-9M、10-7M)的培養(yǎng)液中，于培養(yǎng)的第4 d取樣，提取總RNA后進(jìn)行RT-PCR，通過比較與細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因(Bcl-2、Bax和Bim)的表達(dá)情況，以及不同濃度下褪黑素對細(xì)胞凋亡情況的影響。

1.9統(tǒng)計分析 試驗所得數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。以P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1MT對體外培養(yǎng)豬腔前卵泡生長的影響 由表1可見，在開始對豬腔前卵泡進(jìn)行培養(yǎng)前各處理組間差異不顯著(P>0.05)；在培養(yǎng)4 d的過程中，卵泡持續(xù)增長，卵泡的直徑隨培養(yǎng)時間的增加而逐漸增大。在培養(yǎng)的第2 d、第4 d的卵泡的平均直徑各組間差異也不顯著(P>0.05),說明各組間的處理對卵泡的體外生長直徑的增長影響不大。

圖1 不同階段豬腔前卵泡

表1 MT對豬腔前卵泡體外生長發(fā)育的影響

3.2MT對體外培養(yǎng)豬腔前卵泡細(xì)胞凋亡的影響 Bcl-2被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡蛋白家族中最重要的調(diào)控蛋白，和Bax、Bad、Bak等共同組成了Bcl-2蛋白家族。Bax能允許一些離子和小分子如細(xì)胞色素C等穿過線粒體膜，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，從而引起細(xì)胞凋亡，而Bcl-2的作用正好相反，它能封閉Bax形成孔道的活性，使一些小分子不能自由通透，從而保護(hù)細(xì)胞凋亡。因此可以用Bcl-2/Bax值來比較細(xì)胞凋亡情況。從圖1可見添加褪黑素組Bcl-2/Bax值都變大，表明MT的添加具有明顯的抗凋亡作用，其中10-9M的效果最好。Bim是Bcl-2家族中BH3-only亞家族的成員，是一種重要的凋亡調(diào)節(jié)蛋白，一定的凋亡刺激能通過各種信號途徑激活Bim分子，活化的Bim分子通過與Bcl-2/Bax的相互作用激活Bax，引起線粒體途徑的細(xì)胞凋亡。由圖1可知，在添加MT的處理組中Bim的表達(dá)量都有所下降，其中10-9M的表達(dá)量下降最多，同樣說明了添加MT可以有效的降低卵泡細(xì)胞的凋亡水平，并且添加10-9M的濃度更為合適。

圖2 凋亡相關(guān)基因RT-PCR實驗結(jié)果

3 討論

3.1MT對腔前卵泡體外生長的影響 腔前卵泡的生長包括兩方面的內(nèi)容，一是卵母細(xì)胞的體積的增大，二是卵母細(xì)胞周圍顆粒細(xì)胞的迅速增殖和分化。腔前卵泡的生長發(fā)育受體內(nèi)多種生長因子和激素的調(diào)控。研究表明，在人的排卵前卵泡液中褪黑素濃度水平是血清中的3倍[1]。在卵巢中還存在著褪黑素合成的前體物質(zhì)以及其合成過程中的兩種關(guān)鍵酶NAT和HIOMT，這說明卵巢可能會合成褪黑素釋放到卵泡液中。褪黑素可以在卵泡發(fā)育的不同階段影響性腺激素的生成，Adriaens等研究表明鼠的腔前卵泡在含褪黑素(100 μm)培養(yǎng)液中培養(yǎng)12 d后增加了雄激素和孕激素的生成量[2]。同樣的，在豬有腔卵泡的培養(yǎng)中MT(100 ng/mL)可以刺激孕激素和雄激素的產(chǎn)生，但雌激素的水平不變[3]。在豬卵母細(xì)胞體外成熟體系中添加10 ng/mL MT可以明顯降低ROS的含量，促進(jìn)卵母細(xì)胞的核成熟和胞質(zhì)成熟。MT對卵泡生長和發(fā)育的調(diào)控可能是通過影響膜細(xì)胞的類固醇激素的生成和作為體內(nèi)的ROS清除劑起作用的。

本實驗的結(jié)果表明，培養(yǎng)前的卵泡直徑各組間差異不顯著(P>0.05)，培養(yǎng)的第2 d、第4 d，卵泡的平均直徑各組間差異也不顯著(P>0.05)，說明各處理組對卵泡體外培養(yǎng)直徑增長的影響差異不大。一方面可以說明褪黑素在卵泡生長發(fā)育中的作用可能不是通過促進(jìn)卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的增殖分化而表現(xiàn)的，它與性腺激素的形成相關(guān)。另一方面可以說明在體外培養(yǎng)條件下褪黑素濃度為10-11M、10-9M、10-7M時對腔前卵泡的直徑增長影響不大，有可能是位于卵泡發(fā)育的早期，卵泡對MT的敏感性反應(yīng)比較滯后導(dǎo)致的，其在體外促細(xì)胞生長方面作用還有待進(jìn)一步研究。

3.2MT對體外培養(yǎng)腔前卵泡細(xì)胞凋亡的影響 在卵泡的發(fā)育過程中，卵母細(xì)胞和周圍的顆粒細(xì)胞相互影響，共同生長。顆粒細(xì)胞的增殖、分化，卵母細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)的成熟都對卵泡的發(fā)育有著重要作用。卵泡內(nèi)細(xì)胞的大量凋亡將會影響卵泡的正常發(fā)育過程。

細(xì)胞凋亡受到機(jī)體嚴(yán)密的調(diào)控，Bcl-2基因家族是最重要的細(xì)胞凋亡調(diào)控基因，其同源蛋白可分為：凋亡抑制蛋白包括Bcl-2、Bcl-XL等和凋亡誘導(dǎo)蛋白包括Bax、Bcl-XS等。Bcl-2可以阻止線粒體細(xì)胞色素C的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用，而Bax的作用恰好相反，其可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。Bim是Bcl-2家族中僅含有一個BH3結(jié)構(gòu)域的蛋白，具有助凋亡活性。

在細(xì)胞凋亡中通常與機(jī)體周圍環(huán)境中的活性氧有關(guān)，褪黑素是一種極強(qiáng)的抗氧化劑，但是對于不同的細(xì)胞，褪黑素具有不同的功效，在腫瘤細(xì)胞、癌癥細(xì)胞等中MT會促進(jìn)其凋亡；在神經(jīng)細(xì)胞中的凋亡則會被其抑制。研究表明，MT可以使人B淋巴母細(xì)胞瘤細(xì)胞RAMOS-1線粒體膜去極化胞內(nèi)鈣濃度升高而導(dǎo)致凋亡[4]；MT可以促進(jìn)成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化[5]。

由圖1 可知，10-11、10-9、10-7M濃度的褪黑素均能在一定程度上降低細(xì)胞的凋亡水平，其中10-9M濃度的MT抑制細(xì)胞凋亡水平的程度最大，效果最明顯。

4 結(jié)論

在本實驗研究濃度范圍內(nèi)，褪黑素對于體外培養(yǎng)豬腔前卵泡的生長沒有顯著影響。在體外培養(yǎng)體系中添加褪黑素具有抑制卵泡細(xì)胞凋亡的作用，其中10-9M濃度的MT抗凋亡效果最明顯。