張 健，鄭景輝，高程海，林 瑜，李學(xué)堅(jiān)，馮玉燕，鄭雪瑩，銀江林

廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧 530200

茴香酸(Anisic acid)化學(xué)名為對(duì)甲氧基苯甲酸(4-Methoxybenzoic acid，CAS：100-09-4)，是多種食品香料和工業(yè)香精的主要原料[1-2]，是化妝品的良好抑菌劑[3-4]，可用作腦功能改善藥茴拉西坦、抗心律失常藥乙胺碘呋酮等多種藥物的中間體[5-7]，有抗肝毒活性[8]和抗腫瘤活性[9]，是一種高附加值天然芳香族香料，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

當(dāng)前工業(yè)生產(chǎn)茴香酸主要采用化學(xué)法，以對(duì)甲基苯酚、對(duì)羥基苯甲酸為原料合成而得?；瘜W(xué)法存在生產(chǎn)成本較高、工藝條件苛刻、副產(chǎn)物較多、容易產(chǎn)生污染等問(wèn)題[10-12]。因此迫切需要尋找一種經(jīng)濟(jì)環(huán)保的制備方法。微生物轉(zhuǎn)化法具有高效專一、反應(yīng)條件溫和、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于食品加工、生物制藥及化妝品研發(fā)等領(lǐng)域[13-16]，利用該法制備茴香酸具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于微生物轉(zhuǎn)化法制備茴香酸的研究尚處實(shí)驗(yàn)室階段，主要聚焦在以反式茴腦或茴香油為底物轉(zhuǎn)化合成茴香酸，研究?jī)?nèi)容包括菌株篩選[17-19]、發(fā)酵條件優(yōu)化[20-21]和代謝相關(guān)基因或途徑的探索[22-24]等。有關(guān)研究表明，通過(guò)單因素法結(jié)合正交試驗(yàn)法優(yōu)化發(fā)酵條件后，假單胞菌BT-13[20]、霉菌ZZ-1[18]的茴香酸摩爾生成率分別提高了92.8%、107.38%。通過(guò)單因素法結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件后，伯克霍爾德氏菌WGB31[21]的茴香酸摩爾生成率提高了199.5%。蔣瓊等[24]通過(guò)構(gòu)建重組菌使茴香酸濃度提高了約4倍。目前已報(bào)道的產(chǎn)茴香酸的微生物資源較少，這些菌株的原始產(chǎn)酸能力普遍較低，優(yōu)化發(fā)酵條件或者構(gòu)建重組菌在一定程度上提高了其茴香酸生產(chǎn)能力，但與工業(yè)生產(chǎn)還有很大距離。目前只發(fā)現(xiàn)粟桂嬌等[20]進(jìn)行了5 L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐的放大試驗(yàn)。因此，繼續(xù)挖掘微生物資源、優(yōu)化發(fā)酵條件以及進(jìn)一步探索放大試驗(yàn)以獲得更好的茴香酸產(chǎn)率顯得尤為重要。本研究以課題組保藏的以反式茴腦為唯一碳源相對(duì)高產(chǎn)茴香酸的假單胞菌Pseudomonassp. NT2為出發(fā)菌株，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化菌株的發(fā)酵條件，以期進(jìn)一步提高茴香酸產(chǎn)量，為工業(yè)化生產(chǎn)茴香酸奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1菌種

假單胞菌NT2(Pseudomonassp.)為本課題組篩選保藏，能夠以反式茴腦為唯一碳源生產(chǎn)茴香酸。

1.1.2主要試劑

標(biāo)準(zhǔn)品反式茴香腦(HPLC≥99%)、茴香酸(HPLC≥99%)購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；底物反式茴香腦(99%)購(gòu)于Macklin；乙腈和甲醇(色譜純)購(gòu)于Thermo Fisher Scientific；無(wú)水乙醇(分析純)購(gòu)于天津市富宇精細(xì)化工有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純的國(guó)產(chǎn)試劑。

1.1.3培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 10.0， 酵母粉 5.0，NaCl 10.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(改良M9培養(yǎng)基，g/L)：Na2HPO4·12.0，H2O 17.14，KH2PO43.0，NH4Cl 1.0， NaCl 0.5，MgSO4·7H2O 1.0，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，CaCl20.02，pH 7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱(精宏，上海)、Waters e2695型高效液相色譜儀(Waters，美國(guó))、SW-CJ-2F型超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰，江蘇)、HVA-110型全自動(dòng)滅菌鍋(Hirayama，日本)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1種子液制備

挑取菌株NT2接種于50 mL/250 mL的LB液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h作為種子液。

1.3.2初始發(fā)酵工藝

將種子液按1%的接種量加入到50 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min發(fā)酵15 h，加入1%反式茴腦，繼續(xù)發(fā)酵36 h獲轉(zhuǎn)化液。用2倍體積無(wú)水乙醇萃取轉(zhuǎn)化液，取適量萃取轉(zhuǎn)化液用無(wú)水乙醇稀釋，通過(guò)高效液相色譜法檢測(cè)其中反式茴腦、茴香酸濃度。轉(zhuǎn)化液中茴香酸濃度1.96 g/L，摩爾生成率21.8%，反式茴腦降解率45.41%。

1.3.3茴香酸和反式茴腦標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品，配置濃度為1.173 6 mg/mL、0.978 0 mg/mL、0.782 4 mg/mL、0.586 8 mg/mL和0.195 6 mg/mL的反式茴腦溶液，1.086 mg/mL、0.868 8 mg/mL、0.651 6 mg/mL、0.434 4 mg/mL和0.108 6 mg/mL的茴香酸溶液。參考粟桂嬌[25]方法，選擇Agilent 反相C18柱(4.6×250 mm，5 μm)，采用等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，流動(dòng)相為乙腈∶水∶冰乙酸=70∶30∶0.02(V/V/V)，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。以物質(zhì)濃度為縱坐標(biāo)，峰面積為橫坐標(biāo)，制作反式茴腦、茴香酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸方程。

1.3.4計(jì)算公式

茴香酸摩爾生成率/%=

反式茴腦降解率/%=

1.3.5菌株NT2降解反式茴腦生產(chǎn)茴香酸發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)

考察碳源種類(lèi)(葡萄糖、果糖、檸檬酸鈉、麥芽糖、甘油、無(wú)水乙醇)，碳源濃度(0.5 g/L、1 g/L、2 g/L、5 g/L、10 g/L和20 g/L)，氮源種類(lèi)(牛肉膏、蛋白胨、尿素、氯化銨、硝酸鉀、硫酸銨)，氮源濃度(0.5 g/L、1 g/L、2 g/L、5 g/L、10 g/L和15 g/L)，底物反式茴腦添加量(0.5%、1%、1.5%、2%和2.5%)，接種量(1%、2%、4%、6%、8%和10%)，發(fā)酵溫度(26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃和34 ℃)，初始pH(6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)，裝液量(10 mL/250 mL、30 mL/250 mL、50 mL/250 mL和70 mL/250 mL)對(duì)茴香酸生成量、反式茴腦降解率的影響。試驗(yàn)按上述順序進(jìn)行且每個(gè)因素考察建立在前一因素取最優(yōu)值的基礎(chǔ)上。每個(gè)處理做3個(gè)平行。

1.3.6Plackett-Burman試驗(yàn)篩選影響茴香酸濃度的因素

Plackett-Burman是一種以不完全平衡塊為原理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，能從眾多變量中有效篩選出最重要的因素。結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以茴香酸濃度為響應(yīng)值，試驗(yàn)運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)7個(gè)因素(檸檬酸鈉濃度、氯化銨濃度、反式茴腦添加量、發(fā)酵溫度、接種量、初始pH和裝液量)設(shè)計(jì)N=12的二水平因子的Plackett-Burman試驗(yàn)(見(jiàn)表1)，以95%水平(P<0.05)為顯著因素，從中篩選出對(duì)茴香酸濃度影響較大的主要因素。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平

1.3.7最陡爬坡試驗(yàn)確定因素的最優(yōu)值范圍

對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出的3個(gè)最顯著影響因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，確定因素的最優(yōu)值范圍，確定試驗(yàn)中心點(diǎn)。

1.3.8Box-Behnken試驗(yàn)和響應(yīng)面分析

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)確定的范圍，利用Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對(duì)此3因素進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用Design Expert 8.06軟件對(duì)響應(yīng)面分析法試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，分析和預(yù)測(cè)顯著因素最佳值。

1.3.9預(yù)測(cè)驗(yàn)證試驗(yàn)

結(jié)合單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析獲得最佳發(fā)酵條件預(yù)測(cè)方案，對(duì)預(yù)測(cè)方案進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，每次測(cè)3個(gè)平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 茴香酸和反式茴腦標(biāo)準(zhǔn)曲線

茴香酸、反式茴腦濃度與高效液相檢測(cè)的峰面積x之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性回歸方程見(jiàn)圖1。

圖1 茴香酸、反式茴腦標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1碳源種類(lèi)及濃度優(yōu)化

碳源是微生物生長(zhǎng)的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)影響微生物的新陳代謝。本實(shí)驗(yàn)初始培養(yǎng)基為不含碳源的改良M9培養(yǎng)基，添加適量的合適碳源能夠滿足菌體生長(zhǎng)，有利于反式茴腦轉(zhuǎn)化生成茴香酸。考察了6種碳源(添加量均為10 g/L)，結(jié)果如圖2A所示。

添加檸檬酸鈉時(shí)，轉(zhuǎn)化液中茴香酸濃度最大(2.18 g/L)，優(yōu)于其它實(shí)驗(yàn)組；反式茴腦降解率較無(wú)碳源對(duì)照組(初始發(fā)酵工藝)降低了9.41%，即減少了反式茴腦用于菌體生長(zhǎng)的消耗，故選取檸檬酸鈉作為最佳碳源，對(duì)添加量進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖2B。添加量為0.5 g/L～10 g/L，茴香酸濃度隨檸檬酸鈉添加量的增加呈上升趨勢(shì)，在10 g/L時(shí)達(dá)到最高值。繼續(xù)增加檸檬酸鈉添加量到20 g/L，反式茴腦幾乎不被菌株降解，無(wú)茴香酸累積，這可能是因?yàn)樘荚催^(guò)剩阻礙了菌株對(duì)反式茴腦的轉(zhuǎn)化。因此，選擇檸檬酸鈉濃度10 g/L作為下一步優(yōu)化的基礎(chǔ)。

2.2.2氮源種類(lèi)及濃度優(yōu)化

考察了6種不同氮源(初始添加量均為1 g/L)對(duì)菌株轉(zhuǎn)化合成茴香酸的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2C。不同的氮源種類(lèi)對(duì)轉(zhuǎn)化效果有顯著影響。以氯化銨作為氮源時(shí)，茴香酸累積濃度最大，反式茴腦降解率最高，其次為硝酸鉀，牛肉膏效果最差。因此，氮源選擇氯化銨。氯化銨濃度對(duì)發(fā)酵的影響見(jiàn)圖2D，當(dāng)濃度為0.5 g/L～1 g/L時(shí)，茴香酸濃度呈上升趨勢(shì)，繼續(xù)增加氯化銨的濃度，茴香酸累積濃度明顯下降，當(dāng)氯化銨添加量超過(guò)10 g/L時(shí)，茴香酸幾乎不再累積，這可能是因?yàn)楦邼舛鹊穆然@抑制了菌體對(duì)反式茴腦的轉(zhuǎn)化。濃度范圍在1.0 g/L～2.0 g/L時(shí)反式茴腦降解率差別不大，結(jié)合茴香酸生成量，選取氯化銨濃度1.0 g/L進(jìn)行下一步條件優(yōu)化。

2.2.3底物反式茴腦添加量?jī)?yōu)化

底物反式茴腦添加量?jī)?yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖3A。當(dāng)添加量為0.5%時(shí)，反式茴腦降解程度最高，但茴香酸累積濃度最低，這可能是由于部分反式茴腦被菌體消耗用于生長(zhǎng)，未能有效轉(zhuǎn)化為茴香酸。當(dāng)添加量為1.0%時(shí)，茴香酸累積濃度3.50 g/L，反式茴腦降解率48.32%，轉(zhuǎn)化效果較好。繼續(xù)提高底物添加量，茴香酸的累積增幅不大，反式茴腦降解率變低。因此，以加入1%的底物量最為合適。

2.2.4發(fā)酵溫度優(yōu)化

發(fā)酵溫度優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖3B，26 ℃～34 ℃范圍內(nèi)，茴香酸濃度、反式茴腦降解率升降幅度不大，其中茴香酸濃度呈現(xiàn)先升后降。30 ℃時(shí)，茴香酸濃度最高(3.56 g/L)，28 ℃和34 ℃時(shí)反式茴腦降解率都比較高(～70%)，但茴香酸濃度比30 ℃時(shí)低，故選擇30 ℃作為轉(zhuǎn)化的最適溫度。

2.2.5菌株接種量?jī)?yōu)化

由圖3C可知，隨接種量增加，茴香酸濃度先升高后急劇降低，以4%的接種量為最佳，此時(shí)茴香酸濃度達(dá)到5.8 g/L，同時(shí)反式茴腦降解率也達(dá)到最高值(86.49%)。接種量影響菌體在發(fā)酵液中的生長(zhǎng)速度，接種量過(guò)低菌體生長(zhǎng)過(guò)緩，過(guò)高則競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)導(dǎo)致加速死亡，均不利于反式茴腦的轉(zhuǎn)化利用，因此本實(shí)驗(yàn)選擇4%的接種量進(jìn)行下一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.2.6初始pH優(yōu)化

培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株NT2產(chǎn)茴香酸有顯著影響，pH過(guò)高或過(guò)低對(duì)菌體生長(zhǎng)和酶活性均會(huì)造成抑制(圖3D)。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為7.0時(shí)，茴香酸濃度和反式茴腦降解率均達(dá)到最高，分別為6.63 g/L和85.19%。因此本實(shí)驗(yàn)選擇pH 7.0進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2.7裝液量?jī)?yōu)化

裝液量主要影響菌株的供氧，從圖3E可知，裝液量過(guò)高或過(guò)低均不利于菌體生長(zhǎng)。裝液量為30 mL/250 mL時(shí)，茴香酸濃度達(dá)到最高(6.41 g/L)、反式茴腦降解率也達(dá)到最高(88.87%)，因此，裝液量選擇30 mL/250 mL為宜。

圖3 底物添加量、溫度、接種量、pH及裝液量對(duì)反式茴腦降解率及茴香酸產(chǎn)量的影響

2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)篩選結(jié)果

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果如表2所示。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行模型顯著性分析，回歸模型P值為0.014 7<0.05，表示該模型顯著；R2=0.955 2，表明該模型可解釋95.52%的數(shù)據(jù)，說(shuō)明該回歸模型擬合度較好。因素顯著性分析如表3所示，在所有因素中，氯化銨濃度、初始pH和裝液量的P值均小于0.05，即對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響大于95%，prob>F值<0.05，說(shuō)明這3個(gè)因素均為模型顯著因素。在這3個(gè)因素的主效應(yīng)中，由貢獻(xiàn)度可知重要性排序?yàn)槌跏紁H>氯化銨濃度>裝液量，其中初始pH和裝液量為正向效應(yīng)、氯化銨濃度為負(fù)效應(yīng)。因此選擇這3個(gè)因素進(jìn)行下一步的最陡爬坡試驗(yàn)。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 基于Plackett-Burman試驗(yàn)方差分析

2.4 最陡爬坡試驗(yàn)確定因素最優(yōu)范圍

響應(yīng)面試驗(yàn)的設(shè)計(jì)要求逼近最佳值區(qū)域才能建立有意義的擬合方程，因此在響應(yīng)面試驗(yàn)之前，需利用最陡爬坡試驗(yàn)來(lái)逼近最優(yōu)值區(qū)域。在Plackett-Burman試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)氯化銨濃度、初始pH和裝液量這3個(gè)顯著因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)合實(shí)際，根據(jù)效應(yīng)正負(fù)設(shè)計(jì)步長(zhǎng)方向，即氯化銨濃度的值逐漸減少、初始pH和裝液量的值逐漸增大，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如表4所示。從表4中可知，當(dāng)氯化銨濃度為1.0 g/L，初始pH為7.5，裝液量為40 mL/250 mL時(shí)，發(fā)酵液中茴香酸累積濃度最高。因此，選第4組試驗(yàn)條件作為下一步Box-Behnken試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與分析

2.5.1Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，以氯化銨濃度、初始pH和裝液量為響應(yīng)因子，茴香酸濃度為響應(yīng)值，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。每組結(jié)果重復(fù)測(cè)3個(gè)平行。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.5.2響應(yīng)面優(yōu)化分析

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)Box-Behnken結(jié)果進(jìn)行模型建立與方差分析，結(jié)果見(jiàn)表6。對(duì)3個(gè)顯著因素進(jìn)行回歸擬合后，得到如下多元二次響應(yīng)面回歸模型：

表6 回歸模型及方差分析

Y=7.01+1.07A+0.29B+0.47C+1.06AB+0.73AC-0.43BC-2.09A2-0.44B2-0.79C2

各因素交互作用的響應(yīng)面圖及等高線圖如圖4所示。響應(yīng)面的坡度表示因素對(duì)茴香酸濃度的影響大小，坡度越大表示影響越大，等高線的橢圓程度表示兩因素交互作用對(duì)茴香酸濃度影響的顯著性，橢圓程度越大表示影響越顯著。由圖4可知，A1和B1響應(yīng)面整體坡度較C1的大，其中氯化銨濃度0.5 g/L～1.5 g/L范圍內(nèi)，茴香酸濃度先升后降，曲面坡度最大，說(shuō)明氯化銨濃度對(duì)茴香酸濃度的影響最大，其次是裝液量，最后是初始pH。由等高線情況可知，等高線橢圓程度由大到小為A2>B2>C2，說(shuō)明氯化銨濃度和初始pH的交互作用最大，對(duì)茴香酸濃度的影響最顯著，其次是氯化銨濃度和裝液量的交互作用，最后是初始pH和裝液量的交互作用。

(A) 氯化銨濃度及初始pH對(duì)茴香酸濃度的影響

(B) 氯化銨濃度及裝液量對(duì)茴香酸濃度的影響

(C) 裝液量和初始pH對(duì)茴香酸濃度的影響

2.5.3最佳發(fā)酵條件驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)響應(yīng)面分析,獲得3個(gè)顯著因素的最優(yōu)值為：氯化銨1.26 g/L, 初始pH 7.9，裝液量41.6 mL/250 mL，此時(shí)預(yù)測(cè)茴香酸濃度最高為7.48 g/L。為確認(rèn)響應(yīng)面結(jié)果的可靠性，根據(jù)上述條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),考慮到實(shí)際操作，將裝液量調(diào)整為42 mL/250 mL。在最優(yōu)條件下，菌株NT2發(fā)酵液中茴香酸累積濃度為7.24 g/L，逼近方程預(yù)測(cè)值，表明該模型可靠，具有實(shí)際意義。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果證明，假單胞菌Pseudomonassp. NT2為生產(chǎn)茴香酸的潛力菌株。經(jīng)單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman和Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)，可知氯化銨濃度、初始pH和裝液量是該菌株生產(chǎn)茴香酸的3個(gè)顯著影響因素。優(yōu)化后獲得最佳發(fā)酵條件為：檸檬酸鈉10 g/L，氯化銨1.26 g/L，底物反式茴腦加入量1%，發(fā)酵溫度30 ℃，接種量4%，初始pH 7.9，裝液量42 mL/250 mL。優(yōu)化后，茴香酸生成量可達(dá)7.24 g/L，為原始發(fā)酵工藝時(shí)的3.5倍，是已報(bào)道的較高產(chǎn)率菌株BT-13[25](3.49 g/L)的2倍。茴香酸摩爾生成率為80.72%，反式茴腦降解率為89.81%，分別提高了270.28%、97.78%，說(shuō)明發(fā)酵工藝得到了有效優(yōu)化。本研究豐富了產(chǎn)茴香酸微生物資源，為微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)茴香酸的工業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。