楊珍福，何鵬飛，吳毅歆，何鵬搏，孔寶華,趙崇鈞，劉劍金，何月秋

（1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，昆明650201；2中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，昆明650221；3微生物菌種篩選與應(yīng)用國家地方發(fā)酵工程研究中心，昆明650217；4云南省煙草公司普洱市公司，云南普洱665000）

0 引言

植物體內(nèi)含有大量內(nèi)生細菌，它們不但可以通過與病原菌競爭空間或產(chǎn)生拮抗物質(zhì)抵御病蟲害侵襲，還可以促進植物生長，是寶貴的天然生物資源，對其進行合理利用可減輕因使用化學(xué)農(nóng)藥和化學(xué)肥料造成的環(huán)境污染問題，因而被開發(fā)成生防菌劑和生物肥料等產(chǎn)品在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用[1-3]。Gao等[4]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Em7對由核盤菌引起的油菜菌核病防效達到50%～70%；徐征等[5]發(fā)現(xiàn)一種內(nèi)生巨大芽孢桿菌的菌肥肥效對反季節(jié)鮮食玉米品質(zhì)提升效果顯著；高振峰等[6]發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細菌ZSY-1對番茄灰霉病防效良好，葉部防效可達80.33%、果實防效可達75.10%；梁志超等[7]將內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌YN2014048添加到煙草育苗基質(zhì)中制成微生物功能基質(zhì)對煙苗促生作用顯著。在內(nèi)生細菌的應(yīng)用過程中，能否在植株體內(nèi)有效定殖是其發(fā)揮防控和促生作用的前提與關(guān)鍵因素[8]。生防菌田間應(yīng)用時，由于根際定殖能力差而導(dǎo)致病害防治效果下降或防治失敗的現(xiàn)象常有發(fā)生[9]；因此，定殖能力檢測成為當前生防促生菌研究領(lǐng)域的熱點之一。隨著現(xiàn)代標記基因技術(shù)的建立與發(fā)展，綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標記法已成為深入研究生防菌在植物上的定殖、擴展和消長規(guī)律提供有效工具[10]。已有研究表明，一些具有生物防治作用的細菌通過GFP標記能在黃瓜[11]、馬鈴薯[12]、煙草[13]、西芹[14]等多種植物上成功定殖。

YN2014042（以下簡稱YN42）是從健康煙草植株中分離獲得的一株解淀粉芽孢桿菌。它具有較強的抑菌活性，對煙草黑脛病有較好的防效[15]，對多種作物的生長有促進作用[16]。為了進一步開發(fā)利用YN42，本研究用GFP基因?qū)ζ溥M行了標記，并利用平板分離法結(jié)合激光共聚焦顯微鏡對其在煙草和玉米上的定殖能力進行了初步研究；同時將YN42添加到煙草育苗基質(zhì)中制成微生物功能基質(zhì)以及用YN42對玉米進行灌根處理，研究其對煙草、玉米生長的影響，為該生防菌株和微生物肥料的開發(fā)及應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：YN42為煙草內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌，為云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院分離保存。

供試作物：煙草品種云煙97由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供、玉米品種廣玉88為云南廣大種業(yè)有限公司產(chǎn)品。

供試病原菌：13種植物病原真菌均為本實驗室分離和保存（表1）。

表1 YN42的抑菌譜

續(xù)表1

其他材料：真菌和細菌培養(yǎng)采用PDA和LB培養(yǎng)基，自然轉(zhuǎn)化生長采用GCHE和GC培養(yǎng)基[10]。質(zhì)粒pHAPII由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)沈其榮老師惠贈，帶有卡那霉素抗性基因和GFP基因。有機無機復(fù)混肥由云葉生物科技有限公司提供，漂浮育苗基質(zhì)由云南省微生物發(fā)酵工程研究中心有限公司提供，育苗盤為162孔泡沫育苗漂盤。

1.2 方法

1.2.1 YN42的GFP標記 采用Idris等[17]的兩步法轉(zhuǎn)化YN42。將轉(zhuǎn)化成功的單個GFP標記菌落，接種于100mL不含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，30℃，150 r/min，培養(yǎng)24 h，從中取10 μL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至不含卡那霉素的LB培養(yǎng)液，連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)5次后，取100 μL培養(yǎng)液，涂布于不含卡那霉素的LB平板，30℃，倒置培養(yǎng)24 h。隨機選100個標記菌株單菌落劃線接種于含20 μg/mL卡那霉素的LB平板，以抗性菌株所占百分比來計算菌株質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.2 GFP標記菌株抑菌活性檢測 以1.1材料中的13種病原真菌為試驗材料，PDA平板中心接活化的病原真菌，采用平板對峙試驗比較GFP標記菌株YN42-GFP和野生型YN42菌株對病原真菌的抑菌活性。以僅接病原真菌為空白對照，各處理重復(fù)3次，25℃培養(yǎng)。當空白對照的病原菌長滿平板時，觀察并測量接種拮抗菌的培養(yǎng)皿中拮抗帶的寬度。對比兩者的拮抗帶寬度，得出標記菌是否具有相同或者更強的拮抗能力，從而判斷其是否適合用于室內(nèi)試驗中的定殖和生物防治需求。

1.2.3 GFP標記菌定殖能力的測定

（1）GFP標記菌在煙草上定殖能力的測定

選取長勢一致的煙苗，移栽到裝有未滅菌自然土的花盆中，每株幼苗接種20 mL 1.00×107CFU/mL的YN42-GFP菌液于根圍，以清水為對照，每處理重復(fù)20次。分別于處理后第1、10、50天取煙草根、莖、葉等組織，用無菌水沖洗4次，研磨后稀釋成不同濃度，靜置3 min，取150 μL汁液涂于含20 μg/mL卡那霉素的LB平板上，30℃下黑暗培養(yǎng)48 h，在紫外投射儀照射下統(tǒng)計平板上發(fā)綠色熒光的菌落數(shù)（見公式(1)），以確定菌株在煙草植株體內(nèi)的定殖情況。在處理后第10天，切取無菌水清洗過的煙草根、莖組織，壓片法制片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察YN42-GFP在煙草體內(nèi)的定殖情況，以不接菌的煙草植株為對照。

（2）GFP標記菌在玉米上定殖能力的測定

按照煙草的接種方法在玉米幼苗根圍接種YN42-GFP，以清水處理作對照，每處理重復(fù)20次。于處理后第1天、10天、25天測定GFP標記菌株在玉米葉片上的定殖情況，其他處理同煙草。

1.2.4 YN42對作物生長的影響

（1）對煙苗生長的影響

將YN42擴大培養(yǎng)后，離心去上清，以不同添加量與育苗基質(zhì)混合制成微生物基質(zhì)，基質(zhì)處理如下：①普通基質(zhì)，即基質(zhì)中不加菌劑與農(nóng)藥，作為對照處理；②農(nóng)藥基質(zhì)，即普通基質(zhì)中含50%烯酰嗎啉可濕性粉劑1500倍液；③108CFU/g菌株基質(zhì)；④107CFU/g菌株基質(zhì)；⑤106CFU/g菌株基質(zhì)。即③、④、⑤是普通基質(zhì)中分別含1.00×108、1.00×107、1.00×106CFU/g的YN42。每種處理基質(zhì)播種一盤，每個處理3次重復(fù)，研究不同基質(zhì)對煙苗的促生長效果。播種45天后，每處理隨機取15株煙苗，測量型高（從莖基至植株最長葉片尖端間的距離）、地上部鮮重、根長和根鮮重。

（2）對玉米生長的影響

選取長勢一致玉米幼苗移栽到裝有未滅菌自然土的花盆中，每株幼苗接種20 mL 1.00×107CFU/mL的YN42菌液于根圍，以同樣濃度的LB培養(yǎng)基為對照，每處理15個重復(fù)，置于溫室培養(yǎng)30天，測量玉米型高、根長、鮮重等。

2 結(jié)果與分析

2.1 YN42的GFP標記

按照Idris等[17]提供的方法，成功獲得了GFP標記的菌株YN42-GFP。該菌株熒光明顯，在含卡那霉素的LB平板上肉眼可見淺黃綠色菌落，在紫外投射儀下發(fā)出明亮的綠色熒光。YN42-GFP經(jīng)不含卡那霉素的LB培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)5輪后涂布于不含卡那霉素的LB培養(yǎng)基上，隨機挑取100個菌落，均可以在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中正常生長，且綠色熒光明亮，說明標記菌株質(zhì)粒能穩(wěn)定表達。

2.2 GFP標記菌株抑菌活性檢測

在平板對峙試驗中，與野生型YN42菌株相比，YN42-GFP菌株對煙草黑脛病菌、玉米穗腐病禾谷鐮刀菌、水稻稻瘟病菌、番茄枯萎病菌、玉米彎孢霉葉斑病菌、煙草赤星病菌、小麥雪腐病菌、蘋果斑點病菌、三七根腐鐮刀菌、玉米小斑病菌、玉米大斑病菌、辣椒莖腐病菌、油菜核盤病菌等13種病原真菌的拮抗能力與野生型的相同（表1）。說明標記后菌株對病原菌的抑制作用未受影響，可以替代野生型菌株，用于室內(nèi)YN42生物防治和定殖研究。

圖1 YN42和YN42-GFP對病原菌的抑菌作用

2.3 GFP標記菌定殖能力的測定

2.3.1 GFP標記菌在煙草植株內(nèi)的定殖 GFP標記菌在煙草定殖試驗中，清水對照處理所有階段的組織涂布在含卡那霉素的LB平板上均無菌落生長，而用YN42-GFP處理后各組織涂布在含卡那霉素的LB平板上均有菌落生長。如圖2-A所示，用YN42-GFP菌液處理后第1天煙草各組織菌落數(shù)量：根＞莖＞葉；隨著時間的延長，莖部的菌落逐漸降低，葉片上的菌落呈現(xiàn)先增后減，根部的菌落變化幅度較小。到第50天時，煙草根、莖和葉組織中仍回收到1.89×106CFU/g、1.07×104CFU/g和0.93×103CFU/g的菌落，且各組織回收到的YN42-GFP在紫外投射儀下綠色熒光依舊明顯，說明GFP標記菌株YN42-GFP比較穩(wěn)定。移栽后的第10天，在激光共聚焦顯微鏡下，與對照煙草根系中微弱的自發(fā)熒光相比，經(jīng)過YN42-GFP處理的根表呈現(xiàn)出的綠色熒光更加強烈（圖2-D和圖2-E）；在莖組織切片中YN42-GFP主要聚集在莖的表皮和皮層部位，維管束上也有標記菌株（圖2-B和圖2-C）。煙草組織中標記菌落的回收結(jié)果和熒光顯微鏡觀察結(jié)果都表明，YN42-GFP能夠進入煙草植株內(nèi)部，并在煙草體內(nèi)傳導(dǎo)。

圖2 標記菌YN42-GFP在煙草植株內(nèi)的定殖動態(tài)和部位

2.3.2 GFP標記菌在玉米植株內(nèi)的定殖 玉米通過灌根處理后能在葉片上回收到GFP標記菌落，表明標記菌株能夠進入玉米植株內(nèi)部，并在玉米體內(nèi)傳導(dǎo)。在灌根處理后第1天、10天、25天玉米葉片中回收的GFP菌落分別為2.22×104CFU/g、2.00×105CFU/g、6.67×103CFU/g，表明玉米葉片內(nèi)的GFP菌落呈現(xiàn)先增后減。在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到經(jīng)過YN42-GFP處理的根表呈現(xiàn)出的綠色熒光更加強烈(圖3A和圖3B)；在莖組織切片中YN42-GFP主要聚集在莖的表皮和皮層部位，維管束上也有標記菌株（圖3C、D、E、F）。因此YN42-GFP能夠很好的在玉米上傳導(dǎo)和定殖。

圖3 標記菌YN42-GFP在玉米植株內(nèi)的定殖部位

2.4 對作物生長的影響

2.4.1 對煙苗生長的影響 在育苗過程中，不同育苗基質(zhì)對煙苗生長的影響差異顯著（表2），各處理煙苗的平均單株型高、地上部鮮重性狀都顯著高于對照處理。在1.00×107CFU/g的菌株基質(zhì)中煙草幼苗平均單株型高、地上部鮮重、根鮮重均最高。與普通基質(zhì)對照處理相比，1.00×107CFU/g菌株基質(zhì)中生長的幼苗單株平均型高、根長、地上部鮮重、根鮮重分別增長450.58%、34.11%、756.52%、468.42%；與50% 烯酰嗎啉可濕性粉劑1500倍液處理的基質(zhì)相比，1.00×107CFU/g菌株基質(zhì)中生長的幼苗單株平均型高、地上部鮮重、根鮮重分別增長138.23%、104.36%、25.58%。而1.00×108CFU/g的菌株基質(zhì)中煙草幼苗的根長小于普通基質(zhì)中的幼苗根長，可能是因為菌株濃度過高抑制了根的生長，導(dǎo)致處理煙苗的地上部生長也受到抑制，說明適宜濃度的菌株基質(zhì)對煙草幼苗的生長有促進作用，YN42有開發(fā)為功能性肥料的潛力。

表2 YN42對煙苗生長效果評價

2.4.2 對玉米生長的影響 玉米幼苗經(jīng)YN42菌液處理30天后，平均型高、根長、鮮重等性狀都顯著高于對照（表3），玉米長勢更粗壯（圖4）。與LB對照相比，經(jīng)YN42處理后玉米型高增加19.37%，根長增長52.04%，鮮重增加61.42%。表明YN42能促進非來源植物玉米生長。

表3 YN42促進玉米生長的效果

圖4 YN42處理的玉米幼苗

3 討論與結(jié)論

內(nèi)生菌在植株體內(nèi)有效定殖是其發(fā)揮防病和促生作用的前提與關(guān)鍵因素[18]。GFP標記技術(shù)能夠?qū)崟r、動態(tài)地研究微生物的空間定位、微生物與環(huán)境及宿主之間的互作[19]，被作為標記物廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)研究中，但GFP在菌體內(nèi)的高效表達會賦予轉(zhuǎn)化菌株額外的代謝負擔(dān)，可能影響其生理代謝活動和生物學(xué)功能[20]。本研究中標記菌株YN42-GFP與野生菌株YN42的抑菌活性無明顯差異，說明GFP蛋白表達并未對YN42的生防功能產(chǎn)生明顯的影響。拮抗菌株抑菌譜的大小是衡量其生防價值的指標之一，YN42對13種病原真菌的平板抑菌活性試驗表明其具有很好的生防潛力，但其抑菌機制還有待進一步研究。YN42菌株的成功標記為研究其在植物體內(nèi)的定殖情況奠定了良好的基礎(chǔ)，用YN42-GFP菌液對煙草和玉米進行灌根處理后在煙草和玉米葉片中均能得到回收，表明該YN42能通過根部進入寄主和非來源植物內(nèi)部，并在植物體內(nèi)傳導(dǎo)。在測定時間內(nèi)煙草各組織菌落數(shù)量分布為根＞莖＞葉，到第50天時，煙草根、莖和葉組織中回收到1.89×106CFU/g、1.07×104CFU/g和0.93×103CFU/g的菌落，高于煙草內(nèi)生細菌YN2014048的GFP標記菌在煙草上定殖測定時第50天煙草根、莖和葉組織中回收到2.53×105、4.10×102和4.44×102cfu/g的菌落[14]，說明不同菌株的定殖能力不同。從菌落的回收情況看，煙草根部菌落一直高于莖和葉，且莖、葉組織內(nèi)的菌落隨著培養(yǎng)時間的延長降低，根部的標記菌落數(shù)量相對穩(wěn)定，說明菌株在定殖位點選擇上有偏好性，這與Gao等[21]在番茄上的研究一致。

植物有益內(nèi)生細菌作為潛在的生防資源，已成為近年來生防菌劑和微生物肥料的熱點。其中解淀粉芽孢桿菌具有較好的抗逆性、定殖能力強、對自然環(huán)境安全、次生代謝產(chǎn)物多樣、抑菌譜廣、易于商品化，是開發(fā)生防菌劑的寶貴資源[22]。Chowdhury等[23]證明噴施解淀粉芽孢桿菌菌劑后幾乎不會影響根際土壤中微生物群落組成；解淀粉芽孢桿菌B9601-Y2能防治多種病害，且對多種作物生長有良好的促進作用[24-25]；解淀粉芽孢桿菌YN48對煙草黑脛病有很好的防病作用[14]，能與不同含水量的漂浮基質(zhì)混合制成微生物功能基質(zhì)，促進煙苗生長[7]。前期研究表明YN42對白菜、番茄和油菜等多種作物有顯著促生作用[16]。本研究對非來源植物玉米灌根處理，它對玉米幼苗也有顯著促生效果。將YN42添加到普通基質(zhì)，在育苗中使用1.00×107CFU/g的YN42菌株基質(zhì)對煙苗的生長有非常顯著的促生長作用，與普通基質(zhì)處理相比煙苗平均型高、地上部鮮重相比分別增長450.58%、756.52%；與農(nóng)藥50%烯酰嗎啉可濕性粉劑1500倍液基質(zhì)處理相比，煙苗平均型高、地上部鮮重分別增長138.23%、104.36%。普通基質(zhì)培育的煙苗長勢較差，可能是因為普通基質(zhì)貯藏時間偏長，其內(nèi)有對煙草生長不利的病菌，影響煙苗生長，而YN42和殺菌劑具有殺菌活性，從而使得效果更明顯。因此在育苗基質(zhì)中加入適宜濃度的YN42有助于提高肥效、減少化學(xué)肥料的使用量，但其促生長機制以及菌株在基質(zhì)中的存活時間等還有待進一步研究。

本研究成功獲得質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳的YN42的GFP標記菌株YN42-GFP，通過平板對峙試驗證明其對13種病原真菌的拮抗能力與野生型菌株相同。用YN42-GFP菌液澆灌煙草和玉米，在煙草和玉米中均能得到回收；激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，煙草和玉米的根表、莖的表皮和皮層部位、維管束上都有YN42-GFP聚集，表明YN42在寄主植物和非來源植物上都能很好的定殖。在煙草育苗中使用1.00×107CFU/g的YN42菌株基質(zhì)對煙苗的生長有非常顯著的促生長作用，澆灌非來源植物玉米亦顯著促進玉米苗生長。總之，煙草內(nèi)生細菌YN42抑菌作用強，可在煙草和玉米體內(nèi)有效定殖并對煙草和玉米有明顯促生作用，為進一步將該菌株開發(fā)成生防菌劑和微生物肥料提供了實驗依據(jù)。