傅科鶴 范莉莉 陳慧穎

摘要：纖維素是自然界中分布最廣泛的一種生物質(zhì)能源，篩選能夠高效降解纖維素的菌株對于開發(fā)利用這類物質(zhì)具有重要意義。從土壤中分離純化獲得一株高產(chǎn)纖維素酶的菌株TW063-3，通過形態(tài)學結(jié)合分子生物學鑒定得出，該菌株為草酸青霉。通過單因素優(yōu)化試驗尋找最佳培養(yǎng)條件，然后通過正交試驗確定關(guān)鍵因子的最佳參數(shù)。篩選得出最佳培養(yǎng)條件：15 g/L羧甲基纖維素鈉+2 g/L硝酸銨，pH值為3.0，200 r/min培養(yǎng)6 d。在最佳培養(yǎng)條件下，酶活性比優(yōu)化前提高了34.1%，達到524.4 U/mL。研究結(jié)果可為生物降解纖維素酶提供一定的理論及應用價值。

關(guān)鍵詞：纖維素酶;草酸青霉;培養(yǎng)基優(yōu)化

纖維素酶能夠?qū)⒆匀唤缰凶钬S富的生物質(zhì)能源——纖維素類物質(zhì)分解成可溶性單糖，從而為大批量生產(chǎn)生物燃料乙醇提供廉價原料[1]。經(jīng)過50多年的研究發(fā)現(xiàn)，纖維素酶已經(jīng)成為第四大工業(yè)酶種[2]，在生物能開發(fā)、食品、畜牧業(yè)及工農(nóng)業(yè)廢棄物回收等多個領(lǐng)域都具有遠大的應用前景[3]。

已有研究發(fā)現(xiàn)，自然界中能分解纖維素的生物類群主要是細菌與真菌[4]。絲狀真菌是產(chǎn)纖維素酶非常重要的一大類群，能夠產(chǎn)生多種胞外纖維素酶[5]。里氏木霉是研究得較為清楚的產(chǎn)纖維素酶菌株，但是其生長量相對較小，產(chǎn)酶量不能滿足工業(yè)中轉(zhuǎn)化纖維素的需求[6]。許多研究發(fā)現(xiàn)，青霉菌具有胞內(nèi)分泌組分齊全、纖維素酶活性高、易培養(yǎng)和生長速度快的優(yōu)勢[7]，而且青霉源纖維素酶能產(chǎn)生比木霉源纖維素酶較多的β-葡萄糖苷酶[8]。

本研究從海灘邊土壤篩選獲得一株高產(chǎn)纖維素酶的青霉菌株，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，旨在提高該菌株的纖維素酶產(chǎn)量，研究成果可為今后工業(yè)化應用纖維素酶提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 剛果紅篩選培養(yǎng)基 培養(yǎng)基配方為10 g/L羧甲基纖維素鈉，0.2 g/L剛果紅，2 g/L K2HPO4·3H2O，0.01 g/L FeSO4·7H2O，0.5 g/L MgSO4·7H2O，0.5 g/L KCl，14 g/L瓊脂。

1.1.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基 培養(yǎng)基配方為10 g/L羧甲基纖維素鈉，3 g/L蛋白胨，0.5 g/L酵母粉，4 g/L （NH4）2SO4，2 g/L K2HPO4·3H2O，0.3 g/L CaCl2，0.5 g/L MgSO4·7H2O，2 g/L吐溫-80。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與處理 土壤樣品從海洋和森林中采集，取5點采樣，混合為1個樣品。在樣品中加入適量純凈水后，加玻璃珠打散，取上層液體，稀釋后涂板篩選。

1.2.2 纖維素酶活性的測定 采用DNS（3，5-二硝基水楊酸）法測定纖維素酶活性。對照（CK）處理方法：取1 mL菌液，煮沸（100 ℃、5 min）滅活后用冷水冷卻5 min，之后加入1 mL 1%羧甲基纖維素鈉溶液和3 mL DNS，混合均勻后沸水（100 ℃、5 min）水浴，再用冷水冷卻5 min，然后在波長（λ）為540 nm的紫外-可見分光光度計中測吸光度。

酶活性的測定：取1 mL菌液，加入1 mL 1%羧甲基纖維素鈉溶液，混合均勻后在37 ℃水浴鍋中水浴30 min，煮沸（100 ℃、5 min）滅活后用冷水冷卻 5 min，再加入3 mL DNS溶液，混合均勻后沸水（100 ℃、5 min）水浴，再用冷水冷卻5 min。每組測定吸光度前用其對應的CK清零后再測定540 nm處的吸光度，每瓶設(shè)3次重復。酶活性單位的定義：催化產(chǎn)生1 μg葡萄糖的酶量為1 U[9]。

酶活性（U/mL）=D540 nm×n×1 000/K。

式中：n為稀釋倍數(shù);K為標準曲線斜率。

1.2.3 高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選 將菌株活化后接種至剛果紅初篩平板上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待初篩獲得的高產(chǎn)漆酶菌株活化產(chǎn)孢后，用3層擦鏡紙過濾獲得孢子，稀釋至1×104 個/mL，在每瓶培養(yǎng)基（250 mL三角瓶裝量50 mL）中接入1 mL孢子懸液，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)5 d后測定酶活性。

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

1.2.4.1 碳源的優(yōu)化 對經(jīng)搖瓶復篩得到的最佳菌株進行培養(yǎng)基的優(yōu)化，其中發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源分別取10 g/L羧甲基纖維素鈉、10%葡萄糖、10%淀粉、10%蔗糖進行篩選，其余條件不變，發(fā)酵5 d后測定酶活性，確定最佳碳源。

1.2.4.2 氮源的優(yōu)化 將發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源改為最適碳源，分別取2 g/L硝酸鈉、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、蛋白胨進行初始發(fā)酵培養(yǎng)基最適氮源的篩選，其余條件不變，發(fā)酵5 d后，測定酶活性，確定最佳氮源。

1.2.4.3 pH值的優(yōu)化 取最適碳源和氮源，pH值分別設(shè)為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，其余條件不變，發(fā)酵5 d后，測定酶活性，確定最佳pH值。

1.2.4.4 發(fā)酵培養(yǎng)時間的優(yōu)化 選擇優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，從培養(yǎng)2 d開始，每天測定1次纖維素酶活性，確定最佳培養(yǎng)時間。

1.2.4.5 正交優(yōu)化 依據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇碳源、氮源、pH值和生長時間，設(shè)計4因素4水平正交試驗[10]，采用 L16（44）正交表。

1.2.5 菌種的鑒定

1.2.5.1 形態(tài)學的鑒定 將菌種TW063-3活化后，接1小塊菌餅到CYA平板上，于28 ℃培養(yǎng)3 d產(chǎn)孢后，挑取少量帶孢子的菌絲置于載玻片上，顯微觀察并拍照。

1.2.5.2 分子生物學鑒定 DNA提取參照生工生物工程（上海）股份有限公司（Sangon Biotech）DneasyPlant Mini Kit（50）的試劑盒。采用真菌18S rDNA通用引物ITS1f（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS4R（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴增ITS（內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）序列，PCR擴增程序：94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，33個循環(huán);72 ℃10 min。經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司測序后通過MEGA 7構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選

本研究共分離純化164株菌株，通過初篩獲得6株纖維素酶活性最高的菌株（圖1）。復篩結(jié)果表明，菌株TW063-3（P=8.73e-10<0.01）的纖維素酶活性最高，為268.2 U/mL。因此，選取TW063-3進行后續(xù)研究。

2.2 高產(chǎn)纖維素酶菌株的分類鑒定

2.2.1 形態(tài)學鑒定 菌株活化后接種于CYA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d產(chǎn)孢后，挑取菌絲進行顯微觀察，結(jié)果見圖2。觀察發(fā)現(xiàn)，菌落呈灰綠色，邊緣為白色，多分生孢分散形成許多小菌落（圖2-A）;分生孢子梗多次分枝后出現(xiàn)多簇對稱或不對稱的小梗，形如掃帚，具有隔膜且多個分支。分生孢子大多為球形和橢圓形，生長時為藍綠色（圖2-B～圖2-D），因此初步鑒定TW063-3為青霉菌。

2.2.2 分子生物學鑒定 TW063-3序列通過NCBI

BLAST進行序列比對，通過MEGA 7的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。由圖3可以看出，TW063-3與草酸青霉的同源性都為99%，可靠性為100%。綜合形態(tài)學鑒定結(jié)果，確定TW063-3為草酸青霉（NCBI登錄號：MT020385）。

2.3 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.3.1 最佳碳源 如圖4所示，以羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）為碳源時，纖維素酶活性最高，為33015 U/mL（P=0.016 7<0.05）。而葡萄糖和淀粉2種碳源產(chǎn)酶活性差異不顯著。因此選擇羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）作為最佳碳源。

2.3.2 最佳氮源 如圖5所示，以硝酸銨為氮源的酶活性與除蛋白胨外其他3種氮源的差異不顯著，但是其生長量（P=0.004 24<0.01）比其他3種氮源高（圖6）。因此，選擇硝酸銨作為最佳氮源。

2.3.3 最適pH值 pH值為3.5時，酶活性顯著低于其他4種pH值（P=0.000 154<0.01），pH值為4.0的酶活性與pH值4.5、5.0時差異顯著，pH值為4.5、5.0、5.5的酶活性差異不顯著，其中pH值為5.0時酶活性最高。因此，選則pH值5.0為產(chǎn)酶的最佳pH值，酶活性為300.9 U/mL（圖7）。

2.3.4 最佳培養(yǎng)時間 確定該菌株最佳培養(yǎng)基后，從培養(yǎng)2 d開始，每天測定1次菌株所產(chǎn)纖維素酶活性，培養(yǎng)7 d結(jié)束。如圖8所示，TW063-3菌株在培養(yǎng)4 d時酶活性最高，在培養(yǎng)5 d時酶活性下降，但是培養(yǎng)6 d又開始上升，在培養(yǎng)7 d開始小幅度下降。而培養(yǎng)4 d與培養(yǎng)6 d的酶活性差異不顯著，培養(yǎng)6 d與培養(yǎng)3 d的酶活性差異不顯著，培養(yǎng) 2 d 與培養(yǎng)7 d的酶活性差異不顯著，培養(yǎng)4 d的酶活性為300.42 U/mL，高于培養(yǎng)6 d的酶活性。因此， 選擇培養(yǎng) 4 d 作為 TW063-3 產(chǎn)纖維素酶的最

佳培養(yǎng)時間。

2.3.5 正交優(yōu)化 依據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇羧甲基纖維素鈉（A，設(shè)5、10、15、20 g/L 4個水平）、硝酸銨（B，設(shè)2、4、6、8 g/L 4個水平）、pH值（C，設(shè)3、4、5、6 4個水平）和培養(yǎng)時間（D，設(shè)3、4、5、6 4個水平）設(shè)計4因素4水平正交試驗，采用 L16（44） 型正交設(shè)計。正交試驗結(jié)果的極差分析表明，影響酶活性的4個因素排序為培養(yǎng)時間（D）>pH值（C）>碳源（A）>氮源（B），對于A因素，由于k3>k1>k4>k2，所以取A3，同理，B因素取B1，C因素取C1，D因素取D4，其最優(yōu)組合為A3B1C1D4（表1），即產(chǎn)纖維素酶最佳培養(yǎng)基組合為15 g/L羧甲基纖維素鈉+2 g/L硝酸銨，pH值為3.0，培養(yǎng)時間為6 d。

由于正交極差分析表中培養(yǎng)組合為A1B4C1D4的酶活性最高，因此選取A1B4C1D4、A3B1C1D4的培養(yǎng)條件進行驗證試驗。結(jié)果表明，組合A3B1C1D4的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的TW063-3產(chǎn)生的纖維素酶活性高達524.4 U/mL。由此，確定培養(yǎng)條件的最佳組合為A3B1C1D4。

3 結(jié)論

纖維素是自然界中分布最廣、產(chǎn)量最大的多糖類物質(zhì)，由于其多糖結(jié)合的高聚合性及復雜性，導致這類最豐富的資源一直無法得到充分開發(fā)利用。

近幾十年來，相關(guān)研究熱點一直集中于如何充分開發(fā)利用這類資源[11-12]，而篩選1株高產(chǎn)纖維素酶的菌株是纖維素資源充分開發(fā)利用的基礎(chǔ)工作，相關(guān)成果將為纖維素的利用奠定理論依據(jù)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，細菌、放線菌與真菌等多種生物都能夠分泌豐富的纖維素復合酶體系為分解利用纖維素提供能量[13]。其中真菌纖維素酶由于種類全、活性高、作用底物廣等特點被廣泛開發(fā)成商業(yè)化的酶系[14]。

本研究從廈門海灘邊土壤中分離出的1株能夠高效分解纖維素的絲狀真菌TW063-3，通過一系列形態(tài)學分析及分子生物學鑒定，確定該菌株為青霉屬真菌。通過單因素優(yōu)化結(jié)合正交試驗設(shè)計，確定該菌株最佳產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)條件為15 g/L羧甲基纖維素鈉+2 g/L硝酸銨，pH值為3.0，轉(zhuǎn)速為200 r/min，培養(yǎng)時間為6 d。優(yōu)化后的酶活性比優(yōu)化前提高了34.1%，達到524.4 U/mL。研究成果為進一步研究纖維素酶降解機制及工業(yè)化發(fā)酵產(chǎn)酶提供一定的理論基礎(chǔ)。

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