李亞梅　賓雨飛　夏伯候　羅弘杉　徐佳　張鵬　龔云　廖端芳　林麗美

〔摘要〕 目的 研究補血益母丸干預氣血兩虛模型小鼠內源性代謝物的變化，尋找與治療氣血兩虛相關的代謝生物標志物，探討補血益母丸對氣血兩虛模型的調節(jié)作用及可能機制。方法 采用眼眶放血和腹腔注射環(huán)磷酰胺建立氣血兩虛小鼠模型，造模成功后將動物分為模型組、乳酸亞鐵組、四物湯組、補血益母丸低劑量組和補血益母丸高劑量組，借助氣相色譜質譜聯用（GC-MS）技術，對小鼠血清樣本代謝物進行檢測，采用主成分分析法（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）篩選差異代謝物。應用ELISA法檢測小鼠血清中促紅細胞生成素（EPO）、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白介素2（IL-2）的含量。結果 對照組、模型組和補血益母丸治療組血清樣本能夠得到很好的區(qū)分，共鑒定出14種潛在生物標志物，補血益母丸給藥后氣血兩虛小鼠的內源性代謝物水平發(fā)生不同程度的回調。與正常組相比，模型組小鼠血清中TNF-α明顯升高（P<0.01），IL-2、EPO和GM-CFS明顯降低（P<0.01）。與模型組相比，補血益母丸低、高劑量組小鼠血清中TNF-α含量明顯降低（P<0.05，P<0.01）; IL-2、GM-CFS及EPO含量明顯升高（P<0.05，P<0.01）。結論 補血益母丸可以使氣血兩虛小鼠的異常代謝有所恢復，其治療作用可能與機體內14個差異代謝物及3條相關代謝通路的調節(jié)有關。

〔關鍵詞〕 補血益母丸;氣血兩虛;氣質聯用;代謝組學

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.01.010

〔Abstract〕 Objective To study the changes of endogenous metabolites of Buxue Yimu Pill in mice with qi-blood deficiency， find related metabolic biomarkers， and explore the effects and mechanism of Buxue Yimu Pill on qi-blood deficiency model. Methods The qi-blood deficiency mouse model was established by orbital exsanguination and intraperitoneal injection of cyclophosphamide. After successful modeling， the animals were divided into model group， ferrous lactate group， Siwu Decoction group， low-dose group and high-dose group of Buxue Yimu Pill. The serum metabolites of mice were measured by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. Principal component analysis （PCA） and orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DAa） were used to screen the different metabolites. The content of erythropoietin （EPO）， granulocyte macrophage colony stimulating factor （GM-CSF）， tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-2 （IL-2） in mouse serum was detected by ELISA. Rseults The serum samples of the control group， model group and high-dose of Buxue Yimu Pill group could be well distinguished. A total of 14 potential biomarkers were identified. The levels of endogenous metabolites restored in varying degrees after the treatment of Buxue Yimu Pill. Compared with the control group， the serum levels of TNF-α in the model group significantly increased （P<0.01）， while the levels of IL-2， EPO and GM-CFS in the model group significantly decreased （P<0.01）. Compared with the model group， the serum levels of TNF-α in the mice with low and high dose of Buxue Yimu Pill were significantly reduced （P<0.05， P<0.01）， while the levels of IL-2， GM-CFS and EPO were significantly increased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Buxue Yimu Pill can restore the abnormal metabolism of qi-blood deficiency mice， and its therapeutic effect may be related to the regulation of 14 metabolites and 3 related metabolic pathways in the organism.

〔Keywords〕 Buxue Yimu Pill; qi-blood deficiency; gas chromatography-mass spectrometry; metabolomics

氣血兩虛證是一種整體的、綜合的病證，多因失血過多或久病過勞或年老體衰等導致氣、血功能或臟腑組織的機能活動減退[1]。血虛證多見于機體骨髓造血功能減退、造血微環(huán)境變化、胸腺及脾臟細胞過度凋亡等;氣虛證多見機體免疫功能下降，引起免疫器官、免疫細胞、免疫分子等不同水平的功能損傷。氣血互生互用，氣推動血運行，血方可滋養(yǎng)全身。若機體血虛不足，則氣缺乏血的供養(yǎng)而出現氣虛癥狀;若未及時干預，將發(fā)展為氣血兩虛證[2]。

補血益母丸為株洲千金藥業(yè)獨家研制產品，由當歸、黃芪、阿膠、益母草和陳皮5味中草藥組成，具有祛瘀生新、補益氣血的雙重功效。方中當歸性溫，味甘辛，歸肝、心、脾經，擅補血活血，為君藥;黃芪性溫，味甘，歸脾、胃、腎經，擅補中氣、益元氣而通調血脈;阿膠味甘，性平，歸肺、腎、肝經，擅滋陰補血止血，為補血要藥，二者配合能增進益氣補血之功，為臣藥;陳皮性溫，味辛苦，具有溫胃散寒、理氣健脾的功效;益母草性微寒，味辛苦，歸心、肝、膀胱經，活血調經，與陳皮共為佐藥[3]。

代謝組學是一門新興學科，與蛋白質組學、轉錄組學相比，具有其特殊優(yōu)勢。首先，代謝組學放大了基因和蛋白的微小變化，從而使檢測更加容易;其次，代謝組學不需要建立全基因測序庫且代謝產物的種類遠遠低于基因和蛋白，從而減少了工作量;最重要的一點，代謝組學是最接近表型的研究方法，通過代謝產物分析可以系統地反映機體的病理生理狀態(tài)[4-5]。

中藥具有多成分、多靶點的特點，運用代謝組學方法可以系統地研究中藥作用于機體后內源性代謝產物的變化，為研究該藥的作用機制提供堅實的佐證基礎[6]?；贕C-MS為分析手段的代謝組學，對生物體體液、組織提取物等進行系統分析，找出相關的差異代謝物，闡述相關的代謝路徑，對機體整體的狀況和功能做出評價，從而探討其應用于疾病診斷的可行性[7-8]。目前，代謝組學技術多用于中藥復方，既能夠從整體觀角度考察中藥復方的療效，又能從生物標志物及代謝通路層面考察中藥復方的作用機制[9]。

本研究采用氣質聯用（GC-MS）技術對各組小鼠血清樣本進行測定，采用主成分分析法（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）來篩選差異性代謝物。應用ELISA法檢測小鼠血清中EPO、GM-CSF、TNF-α和IL-2的含量，尋找與治療氣血兩虛有關的代謝生物標志物，探討補血益母丸對氣血兩虛模型小鼠的調節(jié)作用及其可能機制。

1 材料

1.1? 動物

昆明小鼠[動物許可證編號：SCKK（湘）2016-0002]，雄性，體質量18～22 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。所有小鼠均自由飲食飲水，適應性喂養(yǎng)1周，稱取體質量。

1.2? 藥物

補血益母丸（批號20181205，規(guī)格：12 g×10袋，湖南株洲千金藥業(yè)股份有限公司）;環(huán)磷酰胺（批號18091225，規(guī)格：0.2 g/瓶，江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司）;四物湯（白芍10 g，川芎10 g，當歸10 g，生地黃10 g），購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院三九顆粒藥房;乳酸亞鐵口服液（批號20180815，規(guī)格：10 mL×10支，石家莊宇惠制藥有限公司）。

環(huán)磷酰胺配制成濃度為10 mg/mL的溶液，四物湯沖劑配制成濃度為0.8 g/mL的溶液，補血益母丸配制成91 mg/mL和364 mg/mL的混懸液。

1.3? 主要試劑及儀器

甲醇、無水乙醇（100092683）、二甲苯（10023418）國藥集團化學試劑有限公司;甲氧胺（BCBP2843V）、吡啶（STBF7305V）、蘋果酸（04027AEV）、N，O-雙（三甲基硅烷基）、乙酰胺（BSTFA，BCBR2690V）均購自Sigma公司;EPO ELISA試劑盒（E-EL-M0027c）、GM-CSF ELISA試劑盒（E-EL-M0032c）購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;IL-2高敏ELISA試劑盒（70-EK202HS-96）、TNF-α高敏ELISA試劑盒（70-EK282HS-96）購自杭州聯科生物技術股份有限公司;GC-MS-QP2010氣相色譜-質譜聯用儀（日本島津公司）;DC-24型24位氮吹儀（上海安譜實驗科技有限公司）;5415R高速冷凍離心機（Eppendorf公司）;多功能酶標儀（5 L×800，Bio Tek）、水平搖床（TS-1）（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）;Vortex QL-901渦旋振蕩器（德國維根實驗通用設備公司）;BSA6202S-CW電子天平（德國賽多利斯公司）。

2 方法

2.1? 氣血兩虛小鼠模型的建立和干預方法

根據預實驗結果和參考方曉艷等[10]和袁拯忠等[11]方法建立氣血兩虛小鼠模型，除正常對照組小鼠外，其余小鼠均用于模型建立，分別在第1、3、5、7、9天，每只小鼠予眼眶采血0.3～0.5 mL;第2、4、6、8天，每只小鼠（注射前需禁食不禁水12 h）經腹腔注射環(huán)磷酰胺80、40、40、40 mg/kg，正常對照組腹腔注射相同體積的生理鹽水。于第9天末次眼眶采血后送至湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院門診檢驗科完成血常規(guī)檢測分析。

將50只已造模好的小鼠隨機分為模型組、乳酸亞鐵組（西藥陽性藥物）、四物湯組（中藥陽性藥物）、補血益母丸低劑量組和補血益母丸高劑量組，每組10只。補血益母丸人用量為24 g/d，乳酸亞鐵口服液人用量為30～60 mL/d，四物湯人用劑量為40 g/d，根據人-小鼠體表面積劑量換算得到小鼠給藥劑量。正常對照組與模型組給予10 mL/kg生理鹽水灌胃;乳酸亞鐵組10 mL/kg（等效劑量的2倍）灌胃;四物湯組12 g/kg（等效劑量的2倍）的劑量灌胃;補血益母丸低、高劑量組分別給予1.82 g/kg（等效劑量的1/2）和7.28 g/kg（等效劑量的2倍）的劑量灌胃。連續(xù)灌胃10 d。

給藥結束后，摘除小鼠眼球取血，全血存于1.5 mL

EP管中，靜置3 h后于4 ℃，13 000 r/min離心15 min，取上清分清至新的EP管中，-80 ℃保存，備用。

2.2? GC-MS法分析血清樣本代謝物

2.2.1? 樣品前處理? 取不同組別小鼠血清100 μL混合均勻，作為質控樣本（QC）。將凍存于-80 ℃的血清于4 ℃冰箱解凍3 h;向血清中加入50 μL蘋果酸（內標，1 mg/mL），渦旋混勻30 s，加入450 μL甲醇除去蛋白，渦旋混合，靜置8 min后13 000 r/min離心10 min，取上清液，氮氣吹干。

向殘渣中加入50 μL甲氧胺-吡啶（20 mg/mL），置于70 ℃預先加熱好的水浴鍋內反應1 h;再加入100 μL BSTFA，混勻，繼續(xù)70 ℃下反應1 h，室溫下放置2 h，樣品于13 000 r/min離心8 min，取上清100 μL至250 μL內插管，放入進樣瓶用于GC-MS檢測[12]。

2.2.2? GC-MS數據采集? 參照周亞敏等實驗條件[13]，具體設置為：氣相-質譜色譜聯用儀上采集數據，色譜柱為DB-5MS石英毛細管柱（0.25 mm×30 mm，0.25 μm）;進樣量1 μL;載氣為氦氣（99.999%），流速為1.0 mL/min;分流比10∶1;柱溫在70 ℃保持4 min后，以20 ℃/min的速度升溫至110 ℃，再以8 ℃/min的速度升溫至270 ℃，并保持5 min。進樣口溫度為280 ℃，電子轟擊離子源溫度為200 ℃;溶劑延遲時間為6.5 min;質譜掃描范圍m/z 35～550。

2.2.3? 數據分析? 將GC-MS實驗結果轉化為化合物的保留時間和相對峰面積信息，進行PCA、OPLS-DA，以上分析采用SMICA 14.0軟件處理;采用SPSS 21.0軟件處理，實驗數據t檢驗分析和單因素方差分析（one-way ANOVA）顯著性水平設為P<0.05;生物標志物處理用KEGG數據庫。

2.3? ELISA法檢測血清造血因子和免疫因子的含量

按照ELISA試劑盒說明書，分別檢測血清中IL-2、TNF-α、EPO以及GM-CSF的含量。將存于-80 ℃的血清逐級解凍，倍比稀釋法配制標準品溶液并加入相應的孔中，按順序將樣本（每孔100 μL）加入到樣本孔中，37 ℃恒溫孵育90 min;棄去液體，甩干;每孔加入100 μL的生物素化抗體稀釋液，37 ℃孵育1 h;甩干液體，洗板3次;每孔加入100 μL的酶結合物稀釋液，37 ℃孵育30 min;甩干液體，洗板5次;每孔加入90 μL的底物溶液，37 ℃孵育15 min;每孔加入50 μL的反應終止液，終止反應;于酶標儀上測其450 nm下每孔的吸光度值，記錄結果。

3 結果

3.1? GC-MS分析血清代謝物

3.1.1? GC-MS圖譜與代謝物質指認? 對正常組、模型組、補血益母丸給藥組和陽性藥物組的小鼠血清樣本進行GC-MS分析，得到總離子流色譜圖（圖1）。經過系統對總離子流色譜圖進行噪聲處理、基線校正等處理后，共得到100個變量峰，對其中相似度大于80%的39個化合物進行了鑒別。見表1。

3.1.2? 多元變量數據分析? 在PCA模型中，發(fā)現正常組和模型組兩組具有一定分離度，進一步對兩者進行分類處理，類別間的數學模型（OPLS-DA），建立的模型解釋能力參數R2Y、預測能力參數Q2分別為0.75、0.59，說明該模型的區(qū)分程度和預測程度都較好。在OPLS-DA模型中，得分圖顯示兩組樣本間分類明顯（圖2A），為防止模型過擬合，對兩組數據進行模型驗證（200次），模型預測參數R2小于0.4，Q2小于-0.05，表明模型可靠（圖2B），這對后期代謝物分析準確性提供依據。為了更好地對正常組、模型組、補血益母丸給藥組和陽性藥物組的小鼠血清代謝譜進行分型，我們采用PLS-DA和OPLS-DA方法對得到的38個變量數據進行分析。從圖2C、2D可知，補血益母丸給藥組和陽性藥物組均在模型組和正常組之間，由此說明，經藥物治療后，3組小鼠血清代謝物水平趨向于正常發(fā)展，同時也發(fā)現，相比于陽性藥物組，補血益母丸給藥組在代謝物水平恢復能力上較強于陽性西藥組和陽性中藥組，陽性西藥組向正常組恢復效果較好。

3.1.3? 潛在代謝標志物確定? 在分析正常組和模型組時，兩者分別在y軸的作用兩側，說明兩者具有明顯的代謝差異（圖2B）。因此，為探究兩者差異物，需要在PLS-DA模型進行關鍵變量分析，即通過VIP值來篩選差異代謝物，VIP>1的變量被認為對分類起著關鍵作用，見圖3。對篩選的差異代謝物進行顯著性檢驗，同時符合VIP>1且P<0.05的6個變量被認為與血虛有潛在關聯，并利用KEGG、HMDB等數據庫對變量結構鑒定并用標準品驗證（表2），從表2可知，與正常組相比，模型組小鼠血清中的纈氨酸、尿素、甘氨酸、2-丁烯二酸、脯氨酸、十六酸、亞油酸、十八酸、花生四烯酸水平均顯著下調，而3-羥基丁酸、異亮氨酸、蘇氨酸、果糖、葡萄糖含量顯著上調。這14種物質被確定為氣血兩虛小鼠血清潛在代謝標志物。

3.1.4? 潛在生物標記物層次聚類分析? 層次聚類分析獲得潛在生物標志物的熱力圖，如圖4所示。從該熱圖能夠直觀顯示出14種潛在生物標志物在各組之間的含量變化。從圖中可以看出，正常組和模型組中潛在生物標志物含量水平能夠明顯區(qū)分，補血益母丸高劑量組和模型組中潛在生物標志物含量水平也有較好區(qū)分。

3.1.5? 代謝通路分析? 將所篩選得到的潛在生物標志物輸入MetaboAnalyst網站中進行通路分析，以Impact值大于0.1選為潛在相關代謝通路，結果顯示這些生物標志物共涉及到3條主要通路，分別是Linoleic acid metabolism（亞油酸代謝），Glycine， serine and threoine metabolism（甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝），Arginine and Proline metabolism（精氨酸與脯氨酸代謝），結果如圖5所示，由此可知，經環(huán)磷酰胺造模后，小鼠機體發(fā)生紊亂，主要集中于脂肪酸代謝和氨基酸代謝。

3.2? 血清中炎癥因子和免疫因子含量

與正常組相比，模型組小鼠血清中TNF-α明顯升高（P<0.01）;與模型組相比，補血益母丸低、高劑量組小鼠血清中TNF-α含量明顯降低（P<0.05，P<0.01）。與正常組相比，模型組小鼠血清中IL-2、EPO和GM-CFS明顯降低（P<0.01）;與模型組相比，補血益母丸低、高劑量組小鼠血清中IL-2、EPO和GM-CFS均有一定的上升（P<0.05，P<0.01）。見圖6。

4 討論

氣血兩虛證涉及機體多種變化，研究[14-15]表明主要集中于體內神經-內分泌-免疫網絡系統，傳統藥理學研究通常只對單一或少數幾個因素進行研究，缺乏整體性和綜合性。代謝組學是一門新興學科，是系統生物學研究中不可或缺的[16]，采用一種全景式研究理念，客觀認識機體生理和病理變化實質，系統化地描述機體全局性代謝網絡[17]。本研究采用GC-MS聯合模式識別和統計分析方法，對氣血兩虛小鼠的血液內源性代謝物進行初步探索。

經分析得到了較好的分類模式，分析正常組與模型組、模型組與補血益母丸給藥組之間的內在差異物，得到14個差異標志物，包括5種氨基酸（甘氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、纈氨酸、異亮氨酸）、5種脂肪酸及其代謝產物（亞油酸、硬脂酸、花生四烯酸、棕櫚反油酸、3-羥基丁酸），2種糖類（果糖、葡萄糖），1種三羧酸循環(huán)中的重要中間產物（2-丁烯二酸）和尿素。

氨基酸是構成蛋白質的基本單位，對機體免疫系統有著重要作用[18]。甘氨酸和脯氨酸為非必需氨基酸，可調節(jié)血清中鐵離子含量，促進血清中蛋白質合成[19]。血虛模型小鼠的肝臟會嚴重受損，體內紅細胞發(fā)生溶血，血紅蛋白含量下降，促使其合成加快，甘氨酸和脯氨酸代謝加強，消耗增加，含量顯著降低。此外，甘氨酸抗肝損傷會大量消耗，含量進一步降低。纈氨酸是一種支鏈必需氨基酸和生糖氨基酸[20]，可調節(jié)血糖含量、修復組織，為機體供能。血虛狀態(tài)時，纈氨酸可給肌肉提供額外能量，防止肌肉衰弱，故模型組血清中纈氨酸含量顯著下降。蘇氨酸和異亮氨酸為必需氨基酸，前者主要維持機體蛋白平衡，后者是生糖兼生酮氨基酸，促進血紅蛋白形成，氣血兩虛小鼠血紅蛋白合成量降低，蘇氨酸和異亮氨酸參加相關代謝降低，因此，其在血中含量增加[21]。尿素是蛋白質的最終代謝產物，血虛時，小鼠體內氨基酸代謝受到抑制，使血清尿素含量顯著下降。給予補血益母丸治療后，小鼠血清中代謝物向正常組靠攏，說明補血益母丸治療氣血兩虛可能與調節(jié)氨基酸代謝相關，通過調節(jié)機體免疫力調節(jié)氣血。

差異代謝物中有5種脂肪酸及其代謝產物。血虛時，血糖下降，為補充機體所需能量，機體動用脂肪在肝臟產生酮體3-羥基丁酸，進入血液給機體供能;此時，脂類代謝代償性增強，亞油酸參與脂肪分解和新陳代謝，因此，血虛小鼠血中亞油酸含量降低[22]?；ㄉ南┧峥山档脱吼ざ取⒄{節(jié)血細胞功能[23]，在血虛狀態(tài)下，小鼠體內花生四烯酸含量降低，外周血常規(guī)紊亂，血細胞功能降低。經補血益母丸治療后，血虛小鼠血清中脂肪酸也向正常組小鼠靠攏，說明補血益母丸可通過調節(jié)脂肪酸類物質發(fā)揮抗氣血兩虛作用。

造模后，機體內紅細胞發(fā)生溶血，血液中氧含量顯著下降，糖酵解與糖異生代謝加強，使得糖類物質含量上升，經補血益母丸干預后，相關能量代謝加強，機體血液中氧含量恢復正常，進而緩解血虛狀態(tài)。

TNF-α是介導炎性反應的主要細胞因子，參與造血和免疫調節(jié)[24]。IL-2是具有廣泛生物活性的細胞因子，在機體免疫反應中發(fā)揮雙向免疫調節(jié)作用[25]。而EPO和GM-CSF均為集落刺激因子，能興奮骨髓造血功能[1]。本研究表明補血益母丸可有效下調氣血兩虛小鼠血清中TNF-α含量，上調血清中IL-2的量，發(fā)揮抗炎和免疫調節(jié)作用。補血益母丸能促進血清EPO和GM-CSF的生成，改善骨髓造血情況而達到治療氣血虛的效果。

以GC-MS代謝組學技術結合代謝通路調控分析在小鼠血清中潛在的生物標志物，這些代謝物的變化參與了機體的脂肪酸代謝、氨基酸代謝、能量代謝等，經補血益母丸治療后，其中部分代謝物水平向正常組靠攏。因此，推測補血益母丸主要通過改善肝功能、抗氧化損傷、增強血細胞功能、調節(jié)機體免疫和抑制細胞凋亡等途徑改善血虛。

綜上所述，補血益母丸可通過改善氣血兩虛小鼠脂肪酸、氨基酸和能量代謝，同時，提高小鼠免疫功能來發(fā)揮治療氣血兩虛證的作用。

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