南方周末特約撰稿　湯波

人猴嵌合胚胎。

★一個國際小組首次在實驗室成功培育出“半人半猴”嵌合胚胎，盡管胚胎發(fā)育到二十天就被終止，但這項研究打開了人與非人類嵌合體的潘多拉盒子，開發(fā)人-非人嵌合體也許只是時間問題。

將人類干細胞放入猴子的胚胎會發(fā)生什么？　近日，中國、美國和西班牙的一個國際聯(lián)合研究小組進行了這種嘗試，將人類誘導(dǎo)多能干細胞植入食蟹猴胚胎中，首次在實驗室成功培育出“半人半猴”嵌合胚胎，證明人類干細胞可在食蟹猴胚胎中分化。研究人員希望這項研究將來用于人類胚胎發(fā)育和異種器官移植等研究。2021年4月15日，該研究成果發(fā)表在國際著名學(xué)術(shù)期刊《細胞》上，引發(fā)廣泛關(guān)注。

人豬嵌合胚胎在先

來自昆明理工大學(xué)、美國索爾克（Salk）生物研究所、美國得克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心和西班牙加泰羅尼亞大學(xué)圣安東尼奧·穆爾西亞分校的研究人員，參與了此項研究。

美國索爾克生物研究所胡安·卡洛斯·伊斯皮蘇阿·貝爾蒙特（Juan Carlos Izpisua Belmon-te）博士領(lǐng)導(dǎo)了此項國際合作研究。早在2017年，胡安·卡洛斯團隊首次嘗試將大鼠誘導(dǎo)多能干細胞植入小鼠早期胚胎中，培育出大鼠與小鼠嵌合胚胎。在此之前，小鼠胚胎已通過基因編輯敲除了控制胰臟等器官發(fā)育的關(guān)鍵基因，如果沒有其他處理，這些小鼠胚胎相關(guān)器官一般不能正常發(fā)育，甚至很難存活。不過研究人員發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小鼠胚胎植入大鼠干細胞之后，這種大鼠-小鼠嵌合胚胎不僅能在小鼠子宮中正常發(fā)育，小鼠原本不能發(fā)育的胰臟等器官竟然能正常發(fā)育。原來這些大鼠干細胞填補了小鼠胰臟細胞的“空位”，幫助小鼠發(fā)育出含有大鼠細胞的嵌合胰臟，其大小也與大鼠胰臟差不多。

更引發(fā)關(guān)注的是，胡安·卡洛斯團隊將人誘導(dǎo)多能干細胞植入了豬的早期胚胎，首次培育出人豬嵌合胚胎，這些嵌合胚胎植入代孕母豬子宮后又發(fā)育了3到4周時間。與普通胚胎相比，這些嵌合胚胎在母豬體內(nèi)的發(fā)育情況沒有顯著差異。不過，人類細胞在豬胚胎中的嵌合率非常之低，每個嵌合胚胎中能檢測到的人類細胞平均不到10個，每10萬個豬細胞中大約只有一個人類細胞。這種細胞比例很難用于后續(xù)的基礎(chǔ)研究，更談不上異種組織和器官開發(fā)了。

進一步分析發(fā)現(xiàn)，人類細胞難以嵌入豬胚胎中的主要原因是兩個物種間的進化距離較遠，一般認為物種間進化距離越近，其嵌合胚胎越容易形成。人與嚙齒類動物以及人與有蹄類動物的進化距離均超過了9000萬年，而人與猴子進化距離大概在3000萬-4000萬年之間。值得一提的是，大鼠和小鼠的進化距離只有2100萬年，之前大鼠和小鼠間的嵌合體已證明異種組織和器官移植的應(yīng)用潛能。因此，胡安·卡洛斯博士等人認為采用靈長類動物胚胎可能更容易獲得物種間嵌合胚胎，從而開展后續(xù)研究。

人猴嵌合胚胎更有前途

不過，國際上開展靈長類動物分子生物學(xué)研究并不多，一方面成本較高，另一方面容易受到各種限制。因此，胡安·卡洛斯博士開始尋找合作者，正好發(fā)表在《細胞》雜志上的人豬嵌合胚胎研究論文的第一作者吳軍博士來自中國。

昆明理工大學(xué)的季維智院士、譚韜教授和牛昱宇教授等人在靈長類動物胚胎體外培養(yǎng)、基因編輯和干細胞等領(lǐng)域取得了一系列國際領(lǐng)先的研究成果。不過，由于成本和動物福利等問題，人豬嵌合胚胎的體內(nèi)發(fā)育方式并不適合在猴子身上推廣。2019年11月，季維智院士、譚韜教授與胡安·卡洛斯團隊合作，通過改進人體外胚胎培養(yǎng)方案，開發(fā)出一種猴子胚胎體外培養(yǎng)系統(tǒng)，使得胚胎可在體外發(fā)育到20天，體外胚胎呈現(xiàn)出了與體內(nèi)發(fā)育胚胎高度一致的形態(tài)學(xué)與基因表達特征，包括靈長類動物胚胎早期發(fā)育的主要事件，為后續(xù)人猴嵌合胚胎研究奠定了重要基礎(chǔ)。該研究成果發(fā)表在《科學(xué)》雜志上，牛昱宇教授為共同第一作者之一，吳軍為作者之一，而季維智院士、譚韜教授與胡安·卡洛斯博士則為共同通訊作者。

在剛剛發(fā)表的人猴胚胎研究論文中，這五位科學(xué)家并列為共同通訊作者。

在人猴嵌合胚胎研究中，研究人員采取了人豬嵌合胚胎類似的技術(shù)路線，不過進行了一些重要改進。除了采用2019年建立的猴子胚胎體外培養(yǎng)系統(tǒng)之外，研究人員還通過加入促進干細胞分化的化合物組合，對人誘導(dǎo)多能干細胞進行了改進，使其具有更高的嵌合能力。

研究人員首先通過人工授精等技術(shù)在體外培養(yǎng)食蟹猴胚胎至囊胚階段，然后通過顯微注射方法，將篩選獲得具有較高嵌合能力的人多能干細胞注入食蟹猴囊胚中，隨后在所有第七天的食蟹猴囊胚中，都能觀察到提前標記過的人多能干細胞，證明該人多能干細胞系在食蟹猴胚胎中也具有較強的嵌合能力。

接下來，人猴嵌合囊胚開始附著于培養(yǎng)皿上進一步發(fā)育，附著率與普通食蟹猴囊胚沒有顯著差異。隨著時間的推移，能觀察到人多能干細胞的人猴嵌合胚胎占比逐漸減少。在受精后第9天，約有一半胚胎含有人多能干細胞，到13天，人猴嵌合胚胎只占三分之一。注射人多能干細胞的猴子胚胎發(fā)育比率略低于非注射胚胎的發(fā)育比率，到受精后第15天，發(fā)育比率更是急劇下降。

有意思的是，從受精后第13天開始，人猴嵌合胚胎中人類細胞傾向于聚集在一起，并與猴胚胎的上胚層逐漸分離。人多能干細胞更傾向于分化成上胚層細胞和下胚層細胞，滋養(yǎng)層細胞則非常少。在上胚層中，人類細胞占比最高是到受精后第15天的7%，而下胚層到受精后第19天，人類細胞最高可占到的5%，而從受精后第11天開始，滋養(yǎng)層中基本檢測不到人類細胞，不過人類細胞在人猴嵌合胚胎的發(fā)育程度和比例要比人豬嵌合胚胎高得多。

基因表達分析表明，人猴嵌合胚胎中的猴干細胞基本按照原有路徑進行分化，形成不同類型的特定細胞，而其中的人類細胞雖然也能分化成幾種主要種系細胞類型，不過這些細胞更傾向于“抱團”，而且人類干細胞在嵌合胚胎中的發(fā)育進程顯著慢于正常發(fā)育的人和食蟹猴胚胎。另外，人猴嵌合胚胎中的猴干細胞和人干細胞的基因表達也是相互影響的，如相對于人類胚胎，嵌合胚胎中人上胚層樣細胞的基因轉(zhuǎn)錄表達圖譜更接近嵌合胚胎中的猴上胚層細胞，反之亦然。

仍然面臨倫理爭議

研究人員在實驗設(shè)計、實際操作等環(huán)節(jié)均充分考慮了倫理因素，比如遵照相關(guān)國家的規(guī)定、進行廣泛的倫理咨詢和審查以及將嵌合胚胎限定在早期20天之內(nèi)。不過，由于人類和食蟹猴同屬于靈長類動物，進化距離較近，因此人猴嵌合胚胎研究仍然在國際上面臨一定的倫理爭議。

胡安·卡洛斯教授對媒體表示，他的團隊無意嘗試用這種“半人半猴”的嵌合胚胎來創(chuàng)造動物，不過仍然有人認為，嵌合胚胎離嵌合體只有一步之遙。牛津大學(xué)惠康倫理與人文中心聯(lián)合主任朱利安·薩弗勒斯庫（Julian Savulescu）教授對媒體表示，盡管人猴嵌合胚胎發(fā)育到20天就終止了，但是這項研究打開了人與非人類嵌合體的潘多拉盒子，成功開發(fā)人-非人嵌合體也許只是時間問題。

人猴嵌合胚胎能不能進一步發(fā)育成人猴嵌合體呢？　技術(shù)上應(yīng)該沒有問題。據(jù)2019年12月《蛋白與細胞》雜志的報道，中國科學(xué)院動物研究所干細胞與生殖生物學(xué)國家重點實驗室的研究人員將食蟹猴的誘導(dǎo)多能干細胞移植到豬早期胚胎中，獲得猴豬嵌合胚胎。他們還將四千多枚嵌合胚胎移植到母豬子宮內(nèi)，最后產(chǎn)下10只豬崽?？茖W(xué)家通過綠色熒光蛋白進行追蹤，其中有兩只是豬猴嵌合體，它們的大部分器官如心臟、肝臟等都含有獼猴的細胞，比例在千分之一到萬分之一之間，不過這些豬都在一周內(nèi)死亡。這是首次培育出猴豬嵌合體，證明嵌合胚胎有可能發(fā)育成嵌合體。

《細胞》雜志在同一期還刊發(fā)了斯坦福大學(xué)亨利·格里利（Henry Greely）教授和杜克大學(xué)妮塔·法拉哈尼（Nita Farahany）教授的評論文章。兩位生物倫理學(xué)家在文章中指出，不能排除有人培育人猴嵌合體的可能，呼吁研討如何設(shè)定科學(xué)家在這一領(lǐng)域的研究邊界。

《自然》雜志在報道這一新聞時指出，預(yù)計下個月，國際干細胞研究學(xué)會將出臺修訂后的干細胞研究指南，將明確禁止培育人-非人靈長類動物嵌合體，并監(jiān)督人與非人靈長類動物嵌合胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育方面的研究。從2015年開始，美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）宣布暫停人與動物嵌合研究進行聯(lián)邦經(jīng)費資助，目前正在等待國際干細胞研究學(xué)會相關(guān)指南出臺，以決定是否修改經(jīng)費禁令。

盡管面臨倫理爭議，不過研究人員認為，人猴嵌合胚胎模型的效率要顯著優(yōu)于人鼠嵌合胚胎和人豬嵌合胚胎。在嚴格遵守倫理規(guī)范的基礎(chǔ)上，人猴嵌合胚胎有望在再生醫(yī)學(xué)、異種移植組織和器官等方面發(fā)揮積極作用。