于 威 李俊樂 滕麗微，2 劉振生，2*

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040；2.國家林業(yè)和草原局野生動(dòng)物保護(hù)學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱，150040)

動(dòng)物的胃腸道中寄居著多種菌群，數(shù)量龐大，各個(gè)菌群之間有復(fù)雜且動(dòng)態(tài)的變化，通過對(duì)宿主利害的分類，將其分為益生菌、有害菌和條件致病菌[1-2]。在長期的進(jìn)化過程中，腸道菌群與宿主之間具有互惠互利的關(guān)系，宿主可為菌群提供生境、水分、食物等，而菌群及其代謝產(chǎn)物又為宿主的代謝與免疫提供協(xié)助作用[3]，腸道菌群的結(jié)構(gòu)及多樣性與多種外界因素有關(guān)，如食性[4]、年齡[5]、季節(jié)[6]、飼養(yǎng)方式[7]及海拔[8]等因素。袁欣等[9]認(rèn)為腸道菌群間的性別二態(tài)性是有性類固醇水平的差異所驅(qū)動(dòng)，其對(duì)腸道黏膜完整性及通透性產(chǎn)生不同影響，結(jié)合腸道性激素受體及調(diào)節(jié)β-葡萄糖醛酸酶劑膽汁酸水平產(chǎn)生作用而進(jìn)一步對(duì)腸道菌群的多樣性產(chǎn)生影響。腸道微生物對(duì)于宿主極其重要，參與著宿主的消化吸收、免疫及新陳代謝等功能，其多樣性的降低會(huì)對(duì)宿主產(chǎn)生不利影響[10]。如羅伊氏乳酸桿菌(Lactobacillusreuteri)SL001對(duì)小鼠腸道菌群多樣性及結(jié)構(gòu)產(chǎn)生有利影響，從而對(duì)小鼠整體產(chǎn)生積極作用[11]；不同脂肪源會(huì)對(duì)卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)腸道菌群的群落結(jié)構(gòu)、豐富度及多樣性產(chǎn)生影響，對(duì)卵形鯧鲹腸道微生物菌群具有顯著影響[12]；不同年齡段大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)不同性別之間腸道菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異，與不同地點(diǎn)的喂食方式有關(guān)[13]；高脂飲食對(duì)于小鼠不同性別腸道菌群結(jié)構(gòu)影響也是不同的，其與小鼠雌雄之間體內(nèi)激素水平的不同有直接的關(guān)系[14]?？偠灾?，在同一地區(qū)，物種在性別上腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性可能與多種因素有關(guān)。

馬鹿(Cervuselaphus)是北方森林草原型動(dòng)物，其棲息生境極為多樣，食性很廣且不同地區(qū)的食性也不同，分布廣泛，主要集中于歐亞大陸和北美大陸的山麓西部，中國分布8種，分別為阿拉善亞種(C.e.alashanicus)、塔里木亞種(C.e.yarkandensis)、天山亞種(C.e.songaricus)、阿爾泰亞種(C.e.sibiricus)、東北亞種(C.e.xanthopygus)、甘肅亞種(C.e.kansue-nsis)、四川亞種(C.e.macneilli)和西藏亞種(C.e.wallichii)8個(gè)亞種，為國家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物[15]。國內(nèi)對(duì)馬鹿的研究甚廣，涉及到生境[16-17]、食性[18]、家域及性別比[19-20]和分子生態(tài)及營養(yǎng)[21]等，對(duì)于馬鹿腸道菌群結(jié)構(gòu)少有研究。本研究通過高通量測序技術(shù)對(duì)阿拉善馬鹿雌雄冬季腸道菌群結(jié)構(gòu)的研究，分析了其雌雄間冬季腸道菌群的結(jié)構(gòu)及差異，并為后續(xù)研究馬鹿腸道菌群的雌雄二態(tài)性提供了借鑒。

1 研究地概況

賀蘭山脈位于寧夏回族自治區(qū)與內(nèi)蒙古自治區(qū)交界處，北起巴彥敖包，南至毛土坑敖包及青銅峽(105°49′—106°42′E，38°21′—39°22′N)。賀蘭山南北長220 km，東西寬20—40 km，山體西側(cè)地勢(shì)和緩，沒入阿拉善高原。賀蘭山地區(qū)是季風(fēng)氣候和非季風(fēng)氣候的分界線，垂直氣候帶較為明顯，具有氣候干燥，夏季炎熱，冬季嚴(yán)寒，雨雪稀少，風(fēng)大沙多，蒸發(fā)強(qiáng)烈的特點(diǎn)。此地區(qū)動(dòng)植物資源豐富，植物有云杉(Piceaasperata)、山楊(Populusdavidiana)、白樺(Betulaplatyphylla)等665種；動(dòng)物有馬鹿、盤羊(Ovisammon)、石貂(Martesfoina)、藍(lán)馬雞(Crossoptilonauritum)等180余種。

2 材料與方法

2.1 樣品采集

2017年2—4月初在賀蘭山地區(qū)采集野生阿拉善馬鹿群體的糞便樣本78份。為防止采集糞便時(shí)交叉感染，每采集1個(gè)樣本，換1副PE手套。并將樣本放入95%的無水乙醇中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后放入冰箱保存。

2.2 個(gè)體與性別鑒定

本實(shí)驗(yàn)使用QIAGEN QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit試劑盒提取DNA。將提好的DNA留取1份放置于-80℃冰箱凍存。對(duì)樣本DNA進(jìn)行擴(kuò)增，先用高度多態(tài)的微衛(wèi)星引物，進(jìn)行個(gè)體識(shí)別，排出3對(duì)重復(fù)個(gè)體。然后用SRY基因擴(kuò)增，產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的為雄性，無擴(kuò)增產(chǎn)物的為雌性。

最終選取20份DNA質(zhì)量較高的糞便樣品，進(jìn)行后續(xù)分析。并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果將樣品分為雄性(WIM)組，分別為WA1、WA2、WA3、WA4、WA5、WN1、WN2、WN3、WN4、WN5；雌性(WIF)組，分別為 WA6、WA7、WA8、WA9、WA10、WN6、WN7、WN8、WN9、WN10。

2.3 高通量測序

在Miseq 2×300 bp平臺(tái)上，利用高通量測序技術(shù)，對(duì)20份阿拉善馬鹿樣品進(jìn)行16S rRNA的V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，將具有高度相似性(97%)的有效序列進(jìn)行OUT劃分，繪制韋恩圖。與數(shù)據(jù)庫對(duì)比，同時(shí)進(jìn)行物種分類分析，得到樣品所含菌群。Alpha 多樣性：通過Ace、Chao1、Shannon和Simpson 4個(gè)指標(biāo)來衡量菌群豐富度，通過稀釋曲線來驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)樣品數(shù)量的合理性。Ace和Chao1值越大，說明群落的豐富度越高，Shannon值越大菌群的豐富度越高，Simpson值越大，菌群的豐富度越低。NMDS分析法，適用于樣本中無法獲得精確度的數(shù)據(jù)，是將多維空間的樣品降低到低維空間進(jìn)行分析。在多維空間上通過點(diǎn)的形式，表示樣品之間的差異度。UniFrac的heatmap圖，可直接通過顏色來表示樣品間的相似度，顏色越藍(lán)表示樣品間的相似性越低，顏色越紅表示樣品間的相似性越高。LEfSe分析法，通過線性判別得到樣品中具有重要作用的菌群。

3 結(jié)果與分析

3.1 樣品中有效序列和OTU數(shù)目

此次研究通過高通量測序技術(shù)對(duì)20份樣品便進(jìn)行16S rRNA測序。共獲得有效序列1 564 112條，平均每個(gè)樣品中含有78 205條有效序列，其中雌性834 113，雄性含有72 999。基于相似度>97%的原則，將獲得的有效tags序列進(jìn)行聚類，共獲得7 817個(gè)OTUs，平均每個(gè)樣品含有390個(gè)OTUs。其中，有效序列數(shù)量最高的是WA4有109 045條有效序列，最低的是WN7有47 184條有效序列，二者相差61 861條。韋恩圖中重疊部分為所有樣品共有的OUT數(shù)目，由圖1可知20個(gè)樣品中共有4 254個(gè)OTUs。

3.2 Alpha多樣性分析

本研究通過對(duì)20份樣品的Alpha多樣性分析指數(shù)進(jìn)行豐富度和多樣性比較。從圖2可以看出，隨著測試深度的不斷加深，稀釋曲線從不斷上升，直至趨于平緩，說明樣品的測序深度比較合理。

Alpha多樣性分析指數(shù)分析結(jié)果說明(表1)，樣品菌群的豐富度和多樣性都相對(duì)較高。20份樣品中菌群豐富度指數(shù)中雌性相對(duì)較高為WA1(Ace 3 028.42，Chao1 2 580.29)，較低為WA3(Ace 2 106.89，Chao1 2 011.40)；雄性相對(duì)較高為WN9(Ace 2 901.85，Chao1 2 899.49)，相對(duì)較低為WN6(Ace 1 973.08，Chao1 1 744.33)。樣品中雌性和雄性Shannon指數(shù)相對(duì)較高分別為WN3(5.75)和WN8(5.85)，相對(duì)較低的分別為WA5(4.27)和WN6(4.63)。樣品雌性和雄性中Simpson指數(shù)相對(duì)較高的分別為WA5(0.06)和WA10(0.04)，相對(duì)較低的分別為WN3(0.01)和WN8(0.01)。樣品的覆蓋度都在99.17%以上，說明測序結(jié)果足以充分地反映了樣品的真實(shí)情況。

表1 雌性和雄性馬鹿腸道微生物多樣性指數(shù)

3.3 物種注釋

在門水平和屬水平上對(duì)樣品進(jìn)行物種注釋，20個(gè)樣品共獲得25個(gè)菌門，278個(gè)菌屬。在門水平上，雌性和雄性含量最高的5個(gè)菌門為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、放線菌門(Actinobacteria)。其中，雌和雄各菌門的含量分別為：厚壁菌門(54.47%±17.25%，49.47%±15.21%)，擬桿菌門(8.38%±4.21%，10.31%±7.19%)；變形菌門(54.41%±13.99%，5.89%±3.42%)；疣微菌門(12.98%±2.24%，14.21%±1.50)；放線菌門含量分別為(17.48%±2.91%，4.77%±0.43%)(圖3)。

在屬水平上，雌性和雄性含量最高的5個(gè)菌屬為孢桿菌屬(Sporobacter)、擬桿菌屬(Bacteroides)、梭菌屬系列(ClostridiumIV、ClostridiumXIV)、羅氏菌屬(Roseburia)。其中，雌和雄各菌屬的含量分別為：孢桿菌屬含量為(6.79%±3.99%，7.97%±3.71%)，擬桿菌屬(3.87%±2.25%，4.42%±1.13%)，梭菌屬系列(3.61%±1.42%，3.70%±1.21%)，ClostridiumXIVa(3.49%±2.39%，3.74%±0.68%)，羅氏菌屬(2.65%±1.88%，3.35%±1.79%)。

3.4 NMDS分析和基于UniFrac的heatmap圖

從UniFrac的heatmap圖中雄性組的組間相似性相對(duì)較低，雌性組的組間相似性相對(duì)較高。從NMDS圖中可以看出雌性和雄性阿拉善馬鹿腸道菌群的門水平和屬水平兩組菌群組成均有明顯的分離現(xiàn)象(圖5，圖6)。

3.5 LEfSe(Linear Discriminant Analysis Effect Size)分析法

通過檢測性別因素對(duì)阿拉善馬鹿腸道菌群影響的差異程度(P=0.03)，說明性別因素具有顯著性差異。再利用線性判別可以得到，冬季組起到重要作用的菌群包括甲基桿菌科(Methylobacteriaceae)和諾卡氏菌科(Nocardioidaceae)(圖7)。

4 討論

高通量測序技術(shù)在微生物的分離及擴(kuò)增上有著良好的應(yīng)用[22]，尤其在腸道菌群多樣性及結(jié)構(gòu)上的研究有廣泛應(yīng)用。已有研究表明，海南特種野豬(Susscrofa)的腸道菌群存在著性別差異，且雄性腸道菌群較雌性更為豐富[23]；高脂肪飲食對(duì)小鼠腸道菌群的影響也具有性別差異[14]；性別對(duì)人類嬰兒腸道菌群在科水平上構(gòu)成具有影響[24]；這可能由性別對(duì)動(dòng)物造成的激素水平差異所導(dǎo)致[9]。這說明性別因素可能會(huì)造成動(dòng)物雌雄腸道菌群的差異。

本文通過16S rRNA高通量測序技術(shù)對(duì)阿拉善馬鹿雌雄冬季腸道菌群的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，阿拉善馬鹿雌雄腸道菌群的豐富度及多樣性都很豐富且存在差異，其中雌性較雄性腸道菌群多樣性更為豐富。在門水平上，雄性的腸道優(yōu)勢(shì)菌群為厚壁菌門和疣微菌門，而雌性的腸道優(yōu)勢(shì)菌群為厚壁菌門和變形菌門，無論是雌性還是雄性，厚壁菌門都是馬鹿腸道菌群中最豐富的菌種，在腸道中主要功能是分解纖維素，以供宿主使用，其與變形菌門的數(shù)量比例可能是造成肥胖的原因，對(duì)纖維素的食用也是造成厚壁菌門積累的原因[25]。說明對(duì)于阿拉善馬鹿，無論是雌性還是雄性，冬季對(duì)于高纖維食物的食用都是較高的，而高纖維食物都是易于獲取的。雌性較雄性馬鹿而言，變形菌門的豐富度較高，據(jù)以往研究所知，變形菌門是大熊貓的腸道優(yōu)勢(shì)菌群，在對(duì)木質(zhì)素的消化中起著重要的作用，對(duì)于腸道健康也有著至關(guān)重要的作用[26-28]，這可能與阿拉善馬鹿雌雄體型造成的食性差異所致，雌性較雄性的體型要更矮小，對(duì)于灌木根部的啃食相對(duì)頻繁，導(dǎo)致雌性馬鹿對(duì)木質(zhì)素的攝取較多，使雌性馬鹿變形菌門的豐富度較高。在屬水平上，雌雄馬鹿腸道優(yōu)勢(shì)菌屬都為芽孢桿菌和擬桿菌屬，但在豐度上存在差異。腸道菌群構(gòu)成的性別差異廣泛存在于各個(gè)物種中[29]，我們結(jié)合NMDS分析法可以得出雌雄馬鹿的腸道菌群在門屬水平上都存在分離，其雌雄腸道菌群組成上存在差異，說明馬鹿腸道菌群組成受性別影響。通過LEfSe分析法我們得到性別因素對(duì)阿拉善馬鹿腸道菌群的影響存在顯著差異(P<0.05)，得到甲基桿菌科和諾卡氏菌科在冬季腸道菌群中起到主要作用，甲基桿菌科廣泛存在自然環(huán)境中，既能獨(dú)立存在于土壤和水中，也分布于植物的葉、莖及根中，其能促進(jìn)植物根瘤及葉的生長[30]，在冬季寒冷缺乏食物的環(huán)境下，雌雄馬鹿可采食灌木的干葉和根莖，因而成為冬季的腸道菌群的主要構(gòu)成。諾卡氏菌科廣泛存在于水生環(huán)境及土壤中[31]，這是由于植物雪下根部潮濕，有諾卡氏菌的分布，而造成其在馬鹿冬季腸道菌群的主要構(gòu)成。

本研究為阿拉善馬鹿雌雄腸道菌群未來的深入研究提供了基礎(chǔ)，并建議未來對(duì)阿拉善馬鹿腸道菌群的性別差異應(yīng)更密切關(guān)注菌群組成與功能的關(guān)系及性激素的影響，這將對(duì)性別因素對(duì)阿拉善馬鹿腸道菌群的影響原因有更深入的認(rèn)識(shí)。