劉麗霞，張路，楊麗

石家莊市中醫(yī)院，石家莊050000

胃癌是世界上最常見的消化道惡性腫瘤，其死亡人數(shù)位居消化道惡性腫瘤首位，且發(fā)病率仍呈居高不下的趨勢［1］。因此，探索胃癌發(fā)展相關機制，找尋其中關鍵基因，對靶向治療及研發(fā)藥物具有重要作用。微小RNA（miRNA）是由前體RNA 經(jīng)核糖核酸內(nèi)切酶裂解后形成的非編碼RNA，能夠參與胚胎發(fā)育、免疫應答、炎癥應激以及細胞分化等生理過程。miR-184 失活后能夠阻遏磷酸酶及張力蛋白同源的基因（PTEN），而PTEN 作為一種抑癌基因，其活性下降后使膠質(zhì)瘤細胞的增殖及分化能力增強，促進癌癥進展［2］。對于自噬在腫瘤中的具體作用目前尚有爭議［3］。Beclin1是酵母自噬相關基因（ATG）6 的同系物，位于人類染色體17q21 上，目前被廣泛認為是一種抑癌基因，參與調(diào)控自噬過程［4］。在結腸癌組織中，Beclin1失活能夠誘導噬底物P62聚集，通過NF-kβ 信號轉導通路轉導，促進結腸癌的進展［4］。微管相關蛋白1 輕鏈3B（LC3B）是ATG8 的同源基因，位于內(nèi)層自噬泡，其含量與自噬的活性呈正相關［5］，不同癌癥組織中的LC3B 表達存在較大差異［6-7］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-30a是調(diào)控自噬的關鍵基因，與Beclin1具有顯著相關性［8］，但是miR-184是否同樣具有調(diào)控自噬的功能尚不清楚，與Beclin1和LC3B的相關性尚未可知。因此，筆者對胃癌組織中miR-184、Beclin1、LC3B的表達及臨床意義進行了探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本院2018 年1 月—2020 年6 月收治胃癌患者103 例，男60 例、女43 例，年齡（58.32±9.88）歲；有淋巴結轉移者21例，無淋巴結轉移者82例；有Hp 感染者70 例，無Hp 感染者33 例；低分化9例，中分化41 例，高分化53 例；腫瘤長徑≤3 cm 者53例，腫瘤長徑＞3 cm 者50 例；TNM 分期Ⅰ期42 例、Ⅱ期48 例、Ⅲ期8 例、Ⅳ期5 例。納入標準：①符合國際抗癌聯(lián)盟及美國腫瘤聯(lián)合會胃癌的診斷準則［9］，且術后病理確診為胃癌；②患者均為首次確診，且既往無胃部手術史或放化療史；③全部患者均自愿協(xié)助參與本次研究，且臨床資料齊全。排除標準：①合并胃部間質(zhì)瘤、淋巴瘤及神經(jīng)鞘瘤等腫瘤者；②合并胃穿孔或出血者；③重度肝硬化或慢性腎功能不全者；④合并其他原發(fā)惡性腫瘤者；⑤先天免疫系統(tǒng)缺陷者。本研究由醫(yī)院倫理委員會批準實施，胃癌患者均已簽署知情同意書。

1.2 研究方法 采用熒光實時定量PCR 技術檢測miR-184、Beclin1 及LC3B 的表達。術中采集胃癌組織及其癌旁正常胃組織（距癌組織5 cm 處）放入液氮罐中暫存，術后置于-80 ℃冰箱中冷凍保存。兩種樣本各采集30 mg，將其剪碎滴加裂解液Trizol 試劑（Invitrogen 公司；批號20181226）后研磨。采用RNA抽提試劑盒（購自大連TaKaRa 公司，批號：20181223）提取總RNA，遵循操作步驟依次進行。總RNA通過逆轉錄試劑盒（購自BioRad公司，批號：20181230）逆轉錄為cDNA。通過SYBR Green Supermix Kit 試劑盒（購自BioRad 公司，批號：20181211）定量檢測miR-184、Beclin1 及LC3B 的表達量。miR-184、Beclin1 及LC3B 的 反 應條件均為42 ℃30 min、85 ℃5 min。PCR 擴增體系為：正向引物1μL、反向引物1 μL、cDNA 3.0 μL、SYBR Green Supermix Kit10 μL 以及dH2O 5.0 μL，共計20 μL。miR-184 的正向引物序列為5'-GCTAGCAGCACATAATGGTTTGTG-3'、反向引物序列為5'-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3'。Beclin1 的 正 向 引 物序列為5'-ATCCTGGACCGTGTCACCATCCAGG-3'、反向引物序列為5'-GTTGAGCTGAGTGTCCAGCTGG-3'。LC3B 的正向引物序列為5'-GAAGATGTCCGATCTATTCGAGAG-3'、反向引物序列為5'-ACTCTCATACACCTCTGAGATTGG-3'。 GAPDH 正向引物序列為5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'、反向引物序列為5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。引物序列上海吉瑪生物公司合成制作。miR-184、Beclin1 及LC3B 的PCR 反應均為40 個循環(huán)，反應條件均為預變性95 ℃30 s、變性95 ℃10 s、退火60 ℃15 s、延伸72 ℃1 min，樣本均設置3 個復孔。以相對Ct值法檢測miR-184、Beclin1及LC3B的表達量，將ΔCt 值作為結果，相對于內(nèi)參基因GAPDH 的比值為2-ΔΔCt，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩組間比較應用獨立樣本t檢驗，多組間比較應用方差分析。相關性檢驗應用Pearson 相關分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胃癌及癌旁組織miR-184、Beclin1 及LC3B 表達 胃癌組織中miR-184、Beclin1 及LC3B 的表達量較癌旁組織下降（P均＜0.05）。見表1。

表1 胃癌及癌旁組織miR-184、Beclin1及LC3B表達比較（± s）

表1 胃癌及癌旁組織miR-184、Beclin1及LC3B表達比較（± s）

組別癌組織癌旁組織n 103 103 t P miR-184 1.85±0.67 3.21±1.02 11.310＜0.05 Beclin1 0.86±0.33 1.69±0.75 10.280＜0.05 LC3B 0.61±0.28 1.77±0.56 18.803＜0.05

2.2 胃癌組織中miR-184、Beclin1 及LC3B 的表達量與臨床病理參數(shù)的關系 胃癌組織中miR-184、Beclin1及LC3B的表達與淋巴結轉移和TNM分期有關（P均＜0.05），而與患者性別、分化程度、年齡、Hp感染及腫瘤大小無關（P均＞0.05）。見表2。

2.3 胃癌組織miR-184、Beclin1 及LC3B 表達的相關性 胃癌組織miR-184表達量和Beclin1表達量呈正相關（r=0.845，P＜0.05），miR-184 表達量和LC3B表達量呈正相關（r=0.787，P＜0.05），Beclin1 表達量和LC3B表達量呈正相關（r=0.793，P＜0.05）。

3 討論

據(jù)循證醫(yī)學統(tǒng)計，飲食習慣和地域差異是胃癌起病的重要危險因素。目前，臨床治療胃癌的主要方式是以手術為主、放化療為輔的方案，但胃癌極易通過淋巴結或直接侵襲周圍臟器發(fā)生轉移，從而使患者的預后生存時間縮短。近年來，人類依靠基因測序技術對基因及其功能的研究逐步深化，基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中所起到的作用逐漸被人們熟知。既往研究表明，DNA 甲基化、外泌體、LncRNA 以及miRNA 等因素能夠阻遏或誘導原癌基因的表達，從而使細胞發(fā)生異常分裂及分化，對腫瘤的演變具有至關重要的作用［10-12］。

表2 胃癌組織中miR-184、Beclin1及LC3B的表達量與臨床病理參數(shù)的關系

miRNA 廣泛存在于真核生物中，其功能和序列具有高度保守性，通過調(diào)控多種靶基因及信號通路，參與腫瘤細胞分裂、分化及侵襲等過程。miR-184位于9 號染色體，最初在大鼠的小腦和心臟中被發(fā)現(xiàn)，能夠調(diào)控血管源性疾病中新生血管的產(chǎn)生。在青光眼、白內(nèi)障等疾病中，miR-184 通過調(diào)控免疫細胞分裂和凋亡使機體發(fā)生不同程度的氧化應激反應，導致視覺神經(jīng)細胞受損［11］。在腎細胞癌組織中，miR-184能夠結合紅細胞膜蛋白帶4.1類似物5的3，端，使其表達產(chǎn)物失活，從而調(diào)控癌癥進展［10］。研究表明，miR-184 能夠靶向結合絲氨酸/蘇氨酸激酶基因，使膠質(zhì)瘤細胞分裂受阻，同時促進膠質(zhì)瘤細胞凋亡，使其侵襲能力下降［12］。本研究表明，胃癌組織中miR-184 的表達量較癌旁組織下降，其機制可能為癌細胞內(nèi)的miR-184 自身發(fā)生甲基化，啟動子沉默，從而導致miR-184表達下調(diào)；胃癌組織中miR-184的表達與淋巴結轉移和TNM 分期有關，其機制可能為miR-184表達受阻誘導胞外信號調(diào)節(jié)激酶1活化，通過轉移翻譯其表達產(chǎn)物增加，從而使癌細胞周期縮短，分裂分化加快［12］。此外，下調(diào)的miR-184 通過激活腫瘤壞死因子-α，使血管內(nèi)皮生長因子和胰島素樣生長因子2 活化，促進癌細胞周圍形成腫瘤新生血管，增強其轉移和侵襲能力［11］。

自噬是一種高度保守的生理活動，在保障機體的正常生命活動、清理異常細胞和病原體等方面發(fā)揮關鍵作用［3］。自噬功能受損或缺陷能夠損傷線粒體并產(chǎn)生大量的分子活性氧，從而使DNA 突變及染色體異常的風險增加［6］。Beclin1是組成自噬核心復合物的重要元件，能夠結合Ⅲ型磷酸肌醇-3-激酶形成復合體，通過轉換ATG蛋白在自噬前體的位置，調(diào)控自噬的活性［13］。既往研究表明，Beclin1 在乳腺癌組織中表達缺失，而上調(diào)其表達后能夠定向破壞癌細胞，抑制其生長［14］。藥物研究表明，Beclin1 高表達的癌細胞對順鉑的敏感性較高，使癌細胞凋亡的速度明顯加快。本研究表明，胃癌組織中Beclin1的表達量較癌旁組織下降。其機制可能為癌細胞中Beclin1常呈單染色體缺失，使自身沉默子活化，導致Beclin1表達下調(diào)［15］；胃癌組織中Beclin1 的表達與淋巴結轉移和TNM 分期有關，其原因可能為Beclin1下調(diào)后能夠誘導噬底物p62不斷聚集，通過核轉錄因子信號通路的傳導使快速癌細胞異常增生及分化［15］。同時，失活的Beclin1 通過調(diào)控凋亡基因的BH3 區(qū)域，使癌細胞逃避快速凋亡程序，轉移和侵襲能力增強。

LC3 是一種重要的自噬體結構，包括Ⅰ型和Ⅱ型，主要存在于細胞質(zhì)的自噬體膜上，與自噬功能密切相關［7］。自噬啟動時LC3A 的啟動子活化，生成的LC3A 靶向結合磷脂酰乙醇胺形成LC3B，對自噬活性的判斷具有高度特異性。鄧淑文等［16］在藥物試驗中發(fā)現(xiàn)，姜黃素通過上調(diào)LC3B表達使癌細胞增殖速度降低，并抑制其分裂。在非小細胞癌組織中，中成藥物聯(lián)合鉑類藥物能夠激活LC3B，啟動自噬機制，使機體內(nèi)的自噬活動增強［17］。本研究表明，胃癌組織中LC3B的表達量較癌旁組織下降，其機制可能與癌細胞內(nèi)免疫系統(tǒng)異常導致使自噬體溶解有關，而LC3B主要存在于自噬體膜上［7］；胃癌組織中LC3B的表達與淋巴結轉移和TNM 分期有關，其原因可能為LC3B下調(diào)后使機體自噬活性降低，誘導哺乳動物雷帕霉素靶蛋白表達，激活AMP依賴的蛋白激酶，使癌細胞的分裂速度明顯加快，同時誘導癌細胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉化，從而加強癌細胞的侵襲性［5，18］。

本文相關分析顯示，miR-184和Beclin1、miR-184和LC3B、Beclin1和LC3B的表達量均呈正相關，提示miR-184、Beclin1及LC3B在胃癌中發(fā)揮的作用相似，均對胃癌的演變起到一定作用。miR-184 能夠調(diào)控PI3K/Akt信號通路，而該通路是調(diào)節(jié)自噬活性的重要途徑，Beclin1和LC3B均是自噬過程中的重要環(huán)節(jié)，這可能是miR-184、Beclin1 及LC3B 之間具有相關性的重要原因［19-20］?？傊赴┙M織中miR-184、Beclin1及LC3B的表達均降低，且與淋巴結轉移和TNM分期密切相關，能夠在一定程度上評估患者病情。