許 皓，劉建榮，王力欣，欒 楊，任 飛，王 崢，丁尚紅

吉林特研生物技術(shù)有限責(zé)任公司, 吉林長(zhǎng)春 130122

肺炎克雷伯氏菌既是一種可以引起多種動(dòng)物患病的條件性致病菌，又是一種人獸共患病病原。在自然界、人和動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在。當(dāng)水貂換毛抵抗力下降或本菌大量增殖時(shí)，會(huì)引起水貂發(fā)病甚至爆發(fā)性流行。肺炎克雷伯氏菌為革蘭氏染色陰性，臨床新分離的菌株有較厚的莢膜，多數(shù)菌株有菌毛，無(wú)鞭毛和芽孢；營(yíng)養(yǎng)要求不高，兼性厭氧；在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)成黏液狀大菌落，容易相互融合，易拉成絲。近年養(yǎng)殖環(huán)境污染嚴(yán)重、養(yǎng)殖密度大導(dǎo)致本病發(fā)病率逐年上升，山東省、遼寧省等地本病例較多，常常導(dǎo)致水貂呼吸困難及其他化膿性炎癥，發(fā)病率高，死亡率低，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本文對(duì)2013 ～2016 年不同省份病料的采集，進(jìn)行了細(xì)菌分離鑒定和相關(guān)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明肺炎克雷伯氏菌K2 是最流行的血清型，是導(dǎo)致養(yǎng)殖場(chǎng)大規(guī)模死亡的原因。

1 材料

1.1 菌株

肺炎克雷伯氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC700603 均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

900 只18 ～20 日齡SPF 級(jí)ICR 小鼠）購(gòu)自長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 試劑

胰蛋白大豆瓊脂、胰蛋白大豆肉湯購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；PCR 反應(yīng)預(yù)混液Ex Taq ? 購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；綠膿桿菌分型血清購(gòu)自日本生研株式會(huì)社；生化鑒定管、藥敏片購(gòu)自杭州濱河微生物試劑有限公司。

1.4 主要儀器

超凈工作臺(tái)購(gòu)自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備公司；空氣恒溫?fù)u床購(gòu)自上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PCR 儀購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；電熱恒溫水槽購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；隔水式培養(yǎng)箱購(gòu)自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；光學(xué)正置顯微鏡購(gòu)自卡爾蔡司公司。

2 方法

2.1 病料采集與細(xì)菌分離

423 份病料樣品來(lái)自2013 ～2016 年山東省、河北省、黑龍江省、吉林省的82 個(gè)水貂群，包括大、中、小型養(yǎng)殖場(chǎng)和各種類型的農(nóng)村散養(yǎng)戶。發(fā)病水貂多表現(xiàn)為呼吸困難、鼻孔流血、突發(fā)性死亡等癥狀。采集患病水貂肺組織，用無(wú)菌剪刀在肺組織剪開(kāi)一個(gè)切口，將接種環(huán)深入切口內(nèi)取樣，劃線接種于TSA 平板，37 ℃培養(yǎng)18 ～24 h 后觀察，挑取各種優(yōu)勢(shì)菌落傳代純化。

2.2 細(xì)菌培養(yǎng)

細(xì)菌的分離培養(yǎng)與菌落、菌體形態(tài)觀察。將采集的肺臟病料組織劃線接種于TSA 平板上，37 ℃培養(yǎng)18 ～24 h 后挑取疑似菌落進(jìn)行傳代純化，再培養(yǎng)18 ～24 h 后觀察菌落形態(tài)。同時(shí)，分別挑取3 ～5 個(gè)單菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，觀察菌體形態(tài)特征。

2.3 細(xì)菌PCR 鑒定

2.3.1 PCR 引物

采用通用引物擴(kuò)增16SrRNA 基因，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。按文獻(xiàn)（Lin et al., 2014）和(Turton et al., 2010)報(bào)道的肺炎克雷伯氏菌血清型特異性引物序列，合成引物，對(duì)疑似的肺炎克雷伯氏菌菌株進(jìn)行PCR 鑒定及分型。本實(shí)驗(yàn)所用PCR 引物詳見(jiàn)表1。

2.3.2 模板的制備

用擴(kuò)增的純化菌液，取1 mL 加入1.5 mL 離心管中，以10 000 r/min 離心10 min，棄上清液，加入100 μL ddH20 混勻，置沸水中煮沸15 min，再以12 000r/min 離心15 min，取上清液即為模板。

2.3.3 PCR 擴(kuò)增

細(xì)菌分離鑒定PCR 反應(yīng)體系（40 μL）：PCR 反應(yīng)預(yù)混液Ex Taq ?20 μL，無(wú)菌水18 μL，10 pmol/L 上、下游引物各0.5 μL，細(xì)菌基因組模板1 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃變性5 min；30 個(gè)循環(huán)，94 ℃變性40 s、56 ℃退火50 s、72 ℃延伸90 s，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸10 min，降溫至4 ℃保存。肺炎克雷伯氏菌分型PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：PCR 反應(yīng)預(yù)混液Ex Taq ?12.5 μL，無(wú)菌水10.5 μL，10 pmol/L 上、下游引物各0.5 μL，細(xì)菌基因組模板1 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃變性3 min；30 個(gè)循環(huán)，94 ℃變性40 s、59 ℃退火40 s、72 ℃延伸60 s，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸10 min，后降溫至4 ℃保存。

PCR 產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上120 V 電泳分離25 min，核酸染料染色，凝膠成像系統(tǒng)照相后觀察分析。肺炎克雷伯氏菌的PCR 產(chǎn)物，由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，并對(duì)測(cè)序結(jié)果應(yīng)用在線生物學(xué)軟件Standard Nucleotide BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索比對(duì)分析。

表1 本試驗(yàn)所用PCR 引物

2.4 肺炎克雷伯氏菌的小鼠毒力試驗(yàn)

對(duì)35 株K2 型肺炎克雷伯氏菌進(jìn)行了小鼠半數(shù)致死劑量（50% Lethal Dose, LD50）的測(cè)定。

2.5 生化鑒定

采用細(xì)菌生化鑒定管對(duì)純培養(yǎng)物進(jìn)行生化鑒定，接種后的發(fā)酵管置于隔水式培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18 ～24 h，統(tǒng)計(jì)生化試驗(yàn)結(jié)果。

2.6 藥敏試驗(yàn)

按照K-B 紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)及結(jié)果的判斷。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌的形態(tài)與培養(yǎng)特性

肺炎克雷伯氏菌在培養(yǎng)基上形成淺白色半透明，圓形凸起，邊緣齊整的光滑型菌落，挑取時(shí)牽拉成絲。革蘭染色鏡檢，分離菌株為革蘭氏陰性桿菌，莢膜明顯，無(wú)芽孢，菌體兩端頓圓，單個(gè)散在，少數(shù)菌體兩兩相連，中等大小粗短桿菌（見(jiàn)圖1）。

3.2 PCR 鑒定結(jié)果

對(duì)分離菌株16SrRNA 基因進(jìn)行擴(kuò)增，均擴(kuò)增出大小為1 445 bp 的DNA 條帶（見(jiàn)圖2）。將分離菌株所測(cè)16SrRNA 基因序列與GenBank 中已收錄核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性檢索，經(jīng)比對(duì)后確定菌株為肺炎克雷伯氏菌，與登錄號(hào)為CP054268.1 的肺炎克雷伯氏菌16SrRNA 序列同源性為99%。

圖1 肺炎克雷伯氏菌菌落形態(tài)及鏡下形態(tài)

3.3 肺炎克雷伯氏菌分離鑒定及分型結(jié)果

通過(guò)PCR 分型方法對(duì)68 株肺炎克雷伯氏菌進(jìn)行了血清型鑒定，擴(kuò)增出641 bp 的片段（見(jiàn)圖3）。將分離菌株所測(cè)基因序列與GenBank 中已收錄核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性檢索，經(jīng)比對(duì)后確定菌株為K2型肺炎克雷伯氏菌，與登錄號(hào)為AB362367.1 的K2型肺炎克雷伯氏菌序列同源性為99%。

3.4 K2 型肺炎克雷伯氏菌的小鼠毒力試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Reed-Muench 法計(jì)算35 株菌株的小鼠半數(shù)致死劑量（LD50）（見(jiàn)表2），結(jié)果表明，35 株K2 型肺炎克雷伯氏菌的LD50介于0.9×102～2.0×108CFU，其中有一株菌株在小鼠毒力試驗(yàn)中表現(xiàn)為超強(qiáng)毒株，其LD50為0.9×102CFU。根據(jù)對(duì)35 株肺炎克雷伯氏菌的小鼠毒力試驗(yàn)結(jié)果，篩選出小鼠毒力試驗(yàn)中表現(xiàn)毒力最強(qiáng)的4 株肺炎克雷伯氏菌，分別為5 號(hào)菌株、14 號(hào)菌株、20 號(hào)菌株、27 號(hào)菌株，進(jìn)行后續(xù)生化試驗(yàn)及藥敏試驗(yàn)。

3.5 生化鑒定

生化試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表3）表明，4 株K2 型肺炎克雷伯氏菌株的氧化酶、硫化氫H2S、鳥(niǎo)氨酸、甲基紅、動(dòng)力試驗(yàn)鑒定結(jié)果均為陰性；靛基質(zhì)、尿素、山梨醇、側(cè)金盞花醇、木糖試驗(yàn)鑒定結(jié)果均為陽(yáng)性；苯丙氨酸、賴氨酸、枸櫞酸鹽試驗(yàn)結(jié)果存在差異，同一血清型的不同菌株之間也存在明顯差異。

3.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果（表4）表明，4 株肺炎克雷伯氏菌強(qiáng)毒菌株對(duì)氧氟沙星、阿米卡星為敏感或介于中間；對(duì)強(qiáng)力霉素、環(huán)丙沙星、阿莫西林、氨芐西林、鏈霉素、林可霉素、新霉素、多粘菌素B 均耐藥；對(duì)諾氟沙星、慶大霉素、青霉素G、四環(huán)素均為耐藥或介于中間。

表2 K2 型肺炎克雷伯氏菌的小鼠毒力試驗(yàn)結(jié)果

表3 肺炎克雷伯氏菌生化鑒定結(jié)果

表4 4 株肺炎克雷伯氏菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

肺炎克雷伯氏菌對(duì)水貂的致病力往往是致死性的，造成水貂嚴(yán)重的出血性肺炎。有報(bào)道對(duì)6 個(gè)地區(qū)18 個(gè)規(guī)?；?dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查及對(duì)送檢的病料樣品進(jìn)行病原學(xué)檢查，67.2 %～81.5%的被檢病料樣品中存在肺炎克雷伯氏菌，同時(shí)肺炎克雷伯氏菌引起水貂發(fā)病的報(bào)道也逐漸增多。近年來(lái)，我國(guó)山東、河北、黑龍江、吉林等主要的水貂養(yǎng)殖地區(qū)持續(xù)暴發(fā)流行水貂出血性肺炎，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，已經(jīng)成為危害我國(guó)水貂養(yǎng)殖業(yè)的重大傳染病之一。根據(jù)莢膜多糖（K抗原）分型，可將肺炎克雷伯菌分為82 個(gè)K 血清型，相比其他血清型，K1、K2、K54 和K57 型為強(qiáng)毒力菌株，其中以K2 型的毒力最強(qiáng)。本研究對(duì)山東省等四個(gè)省份開(kāi)展了大規(guī)模水貂肺炎克雷伯氏菌分離鑒定及PCR 血清型分型，分離到35 株K2 型肺炎克雷伯氏菌，進(jìn)一步表明K2 型是主要的血清型。通過(guò)小鼠毒力試驗(yàn)選出3 株毒力較強(qiáng)的菌株，1 株超強(qiáng)的菌株，并對(duì)這4 株菌株進(jìn)行了生化試驗(yàn)及藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明肺炎克雷伯氏菌一種血清型4 個(gè)菌株的氧化酶、硫化氫H2S、鳥(niǎo)氨酸、甲基紅、動(dòng)力試驗(yàn)鑒定結(jié)果均為陰性；靛基質(zhì)、尿素、山梨醇、側(cè)金盞花醇、木糖試驗(yàn)鑒定結(jié)果均為陽(yáng)性；苯丙氨酸、賴氨酸、枸櫞酸鹽試驗(yàn)結(jié)果存在差異，同一血清型的不同菌株之間也存在明顯差異；藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，4 株肺炎克雷伯氏菌強(qiáng)毒菌株對(duì)氧氟沙星、阿米卡星為敏感或介于中間；對(duì)強(qiáng)力霉素、環(huán)丙沙星等8 種抗生素均耐藥；對(duì)諾氟沙星、慶大霉素等4 種抗生素均為耐藥或介于中間，這可能與養(yǎng)殖場(chǎng)大量不合理地使用抗生素有關(guān)，還可能與肺炎克雷伯氏菌攜帶毒力基因有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

本研究對(duì)所分離到菌株的菌體形態(tài)、血清型、生化特性、藥物敏感性等生物學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定，為進(jìn)一步客觀評(píng)估水貂出血性肺炎的危害及其綜合防控提供參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：略