榮明軒，徐保娟，南文龍，范根成，李國(guó)攀，王 席，陳清清，胡基雄，李 歡，謝 明，張志翔，榮 俊，

（1.長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434000；2.青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266114；3.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；4.長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434000）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是一種對(duì)家豬和歐亞野豬具有極高致死性和傳染性的病毒性疫病，給世界生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列入須通報(bào)動(dòng)物疫病名錄[1]。1909 年，ASF 在肯尼亞定居者飼養(yǎng)的豬中被首次發(fā)現(xiàn)，1921 年Montgomery 將其作為一種有別于傳統(tǒng)豬瘟的疫病進(jìn)行了報(bào)道[2-3]；1957—1960 年，ASF 先后兩次從西非傳播到葡萄牙，繼而傳播到加勒比地區(qū)以及巴西和歐洲的其他國(guó)家[4]。2018 年8 月，我國(guó)報(bào)告了首起ASF 疫情，隨后疫情迅速在全國(guó)傳播，給我國(guó)生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[5]。

非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）是引起ASF 的病原體[6]。ASFV 是一種二十面體的大型包膜病毒，雙鏈DNA 基因組長(zhǎng)度為170～190 kb，基因組含有160～175 個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF），編碼150～200 種蛋白質(zhì)[7-8]。這些編碼蛋白中的主要結(jié)構(gòu)蛋白包括：A238L 蛋白、CD2v 蛋白、多基因家族蛋白、P54 蛋白、P72 蛋白和P32 蛋白。其中，P32 蛋白由CP204L基因編碼，相對(duì)分子質(zhì)量約為30 ku，也被稱為P30 蛋白。該蛋白在病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞過(guò)程中起重要作用，有良好的抗原性，可在感染早期表達(dá)和分泌，常被用于感染后免疫反應(yīng)的早期檢測(cè)，是一種理想的血清學(xué)診斷和免疫學(xué)檢測(cè)抗原[9-10]。

近年來(lái)，各種基因工程亞單位疫苗在我國(guó)動(dòng)物疫苗生產(chǎn)企業(yè)中被廣泛研制。這些疫苗蛋白中許多含有多聚組氨酸標(biāo)簽。豬群使用帶組氨酸標(biāo)簽的疫苗后，會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的抗多聚組氨酸抗體。在獸醫(yī)臨床檢驗(yàn)過(guò)程中，如果包被抗原中也含有多聚組氨酸標(biāo)簽，就會(huì)出現(xiàn)抗體假陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果。為了消除抗多聚組氨酸抗體的影響，本研究利用大腸桿菌表達(dá)并純化了不含多聚組氨酸標(biāo)簽的重組ASFV P30 蛋白，并以它作為間接ELISA（iELISA）的包被抗原，建立了一種ASFV 抗體iELISA 檢測(cè)試劑盒，同時(shí)與帶組氨酸標(biāo)簽的ASFV P30-2His6 蛋白iELISA 檢測(cè)方法比較，發(fā)現(xiàn)使用不含多聚組氨酸標(biāo)簽的重組ASFV P30 抗原作為包被抗原，能消除多聚組氨酸抗體造成的假陽(yáng)性反應(yīng)。本方法的建立為ASFV 早期感染檢測(cè)及其疫苗免疫效果評(píng)價(jià)提供了一種可靠的方法。

1 材料與方法

1.1 血清樣品

豬 圓 環(huán) 病 毒2 型（porcine circovirus 2，PCV2）陽(yáng)性血清，由長(zhǎng)江大學(xué)生物醫(yī)藥研究所保存并提供；豬塞內(nèi)卡病毒（senecavirus A，SVA）陽(yáng)性血清，由哈爾濱獸醫(yī)研究所翁長(zhǎng)江研究員惠贈(zèng)；豬細(xì)小病毒（porcine parvovirus，PPV）陽(yáng)性血清、豬口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV）陽(yáng)性血清、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）陽(yáng)性血清、豬圓環(huán)病毒3 型（porcine circovirus 3，PCV3）陽(yáng)性血清，由青島易邦生物工程有限公司提供；ASFV 陽(yáng)性血清（15 份，由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心國(guó)家非洲豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室提供），ASFV 臨床陰性血清（40 份，由青島易邦生物工程有限公司提供），均通過(guò)法國(guó)愛(ài)迪威ASFV iELISA 抗體檢測(cè)試劑盒（ID.vet 試劑盒）和Western blot 方法檢測(cè)確認(rèn)。

1.2 主要試劑

PageRuler 預(yù)染蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（10～180 ku），購(gòu)自Thermo 公司；非預(yù)染蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（14.4～116.0 ku），購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；JY98-III 超聲波破碎儀，購(gòu)自寧波新芝生物科技股份有限公司；Ni-NTA His Bind Resin，購(gòu)自上海七海復(fù)泰生物科技有限公司；HRP 標(biāo)記的羊抗豬IgG（H+L），購(gòu)自KPL 公司；TMB 單組分顯色劑，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；NC 膜，購(gòu) 自Pall Gelman Laboratory 公 司；ECL 化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒，購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；Sepharose 300 分子篩及DEAE（Sepharose Fast Flow）陰離子交換柱，購(gòu)自GE公司。其他試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 重組蛋白構(gòu)建和誘導(dǎo)表達(dá)

根 據(jù)Miao 等 于2018 年10 月 在GenBank上發(fā)布的ASFV 全基因序列（ACCESSION：MH766894），設(shè)計(jì)ASFV P30 蛋白全基因編碼序列，并在序列的5'末端加上BamH I 限制性核酸內(nèi)切位點(diǎn)序列，同時(shí)去掉原序列3'末端的終止密碼子并加上XhoI 酶切位點(diǎn)。設(shè)計(jì)序列送交北京美吉桑格生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行全基因合成，并插入在表達(dá)質(zhì)粒載體pET28a 相應(yīng)的酶切位點(diǎn)上。用帶有ASFV P30 蛋白編碼序列的pET-28a 質(zhì)粒（pET-28a-ASFV P30-2His6）轉(zhuǎn)化至E.coli.BL21 的感受態(tài)細(xì)胞，即得到E.coli.BL21/pET-28a-ASFV P30-2His6。用該工程菌誘導(dǎo)表達(dá)的ASFV P30 蛋白上、下游各有1 組His6 標(biāo)簽。該菌種由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保藏。

根據(jù)ASFV P30 蛋白編碼序列合成1 對(duì)PCR引物。上游引物起始密碼前加上NcoI 酶切位點(diǎn)，下游引物添上終止密碼子并在3'末端加上XhoI 酶切位點(diǎn)。用pET-28a-ASFV P30-2His6 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用NcoI/XhoI 進(jìn)行雙酶切，與同樣酶切線性化的pET28a 質(zhì)粒連接，獲得表達(dá)工程菌E.coli.BL21/pET-28a-ASFV P30。

將重組E.coli.BL21/pET-28a-ASFV P30-2His6和E.coli.BL21/pET-28a-ASFV P30 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)劑為α-乳糖，工作濃度為0.03 mol/L。離心收集表達(dá)菌。

1.4 重組蛋白純化

將收集的經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后的E.coli.BL21/pET-28a-ASFV P30-2His6 濕菌體，按照質(zhì)量體積比1:10，用PBS（0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.4）充分重懸，超聲破碎處理后離心收集上清，用0.45 μm 濾器過(guò)濾上清，獲得預(yù)處理蛋白液。采用Ni-NTA 樹(shù)脂親和層析純化ASFV P30-2His6 重組蛋白。

將收集的經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后的E.coli.BL21/pET-28a-ASFV P30 濕菌體，按照質(zhì)量體積比1:10，用0.1 mol/L pH10.53 的碳酸緩沖液充分重懸，超聲破碎處理后離心收集上清，用0.45 μm 濾器過(guò)濾上清，獲得預(yù)處理蛋白液。用Sepharose 300 凝膠過(guò)濾層析柱和DEAE Sepharose Fast Flow 陰離子交換柱進(jìn)行分離純化。

1.5 重組蛋白檢測(cè)

對(duì)純化后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳以及蛋白濃度測(cè)定。使用Western-blot 對(duì)純化后的兩種重組蛋白進(jìn)行分析。用12%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)印至NC 膜上；使用AS FV 陽(yáng)性豬血清作為一抗（稀釋倍數(shù)為1:5 000），37 ℃孵育1 h，用1×PBST（含有0.05% Tween-20 的PBS 緩沖液）洗3 次，10 min/次；加入HRP 標(biāo)記的山羊抗豬IgG 抗體（1:20 000 稀釋?zhuān)┳鳛槎梗?7 ℃孵育1 h，用1×PBST 洗3 次，10 min/次；使用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒，按照操作方法曝光顯色并拍照分析結(jié)果。

1.6 iELISA 檢測(cè)方法建立

采用棋盤(pán)滴定法，將純化后的重組ASFV P30 蛋白用包被液（0.05 mol/L 碳酸緩沖液，pH9.5），按照標(biāo)準(zhǔn)稀釋法稀釋至質(zhì)量濃度分別為2.5、5.0、10.0、20.0 μg/mL，包 被ELISA 板，每孔加樣100 μL，25 ℃孵育4 h 后空干包被蛋白液；用包被液（0.01 mol/L 磷酸鉀緩沖液，pH7.2）每孔200 μL 清洗3 遍后空干；再加封閉液（5%脫脂奶粉溶液）200 μL，25 ℃封閉2 h，封閉完成后倒盡封閉液，空干待用。用封閉液對(duì)ASFV 陽(yáng)性和陰性血清分別進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)ㄏ♂尡壤謩e為1:500、1:1 000、1:2 000、1:4 000），同時(shí)將HRP標(biāo)記的羊抗豬酶標(biāo)記抗體用1×PBST緩沖液稀釋?zhuān)♂尡壤謩e為1:10 000、1:20 000、1:40 000；按照常規(guī)iELISA 方法操作，保證洗滌完全，用終止液（2 mol/L 硫酸溶液）終止反應(yīng)后讀數(shù)OD450。選擇標(biāo)準(zhǔn)：OD450≈1.0，陰性血清OD450≤0.1，陽(yáng)性血清和陰性血清的OD450比值（P/N）最高。

分別選擇1%明膠溶液、2%牛血清白蛋白溶液、5%脫脂奶粉溶液、10%胎牛血清作為封閉液，封閉2 h，分別用ASFV 陰、陽(yáng)性血清進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，選擇最佳封閉液。

1.7 ASFV 抗體陽(yáng)性臨界值確定

取70 份ASFV 臨床陰性豬血清，采用優(yōu)化的ELISA 方法進(jìn)行檢測(cè)。計(jì)算OD450平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，按照陽(yáng)性臨界值=平均值+5×標(biāo)準(zhǔn)差，確定該ELISA 方法的OD450臨界值；設(shè)臨床樣品OD值/陰性樣品OD 值（S/N）大于2.5 為陽(yáng)性臨界值，大于該數(shù)值判定為ASFV 抗體陽(yáng)性，反之則為抗體陰性。

1.8 特異性試驗(yàn)

以上述建立的iELISA 檢測(cè)方法，對(duì)PPV、PRRSV、FMDV、SVA、PCV2 和PCV3 的陽(yáng)性血清以及ASFV 陽(yáng)性、陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)幾種血清檢測(cè)的OD450值，判定該ELISA 檢測(cè)方法的特異性。

1.9 靈敏性試驗(yàn)

將ASFV 陽(yáng)性豬血清分別按1:800、1:1 600、1:3 200、1:6 400比例稀釋?zhuān)捎脙?yōu)化的iELISA方法，檢測(cè)不同稀釋比例的陽(yáng)性血清，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判定陽(yáng)性血清的最大稀釋倍數(shù)，評(píng)價(jià)該方法的靈敏性。

1.10 重復(fù)性試驗(yàn)

用同一批次純化的重組ASFV P30 蛋白包被酶標(biāo)板，對(duì)4 份豬血清樣品進(jìn)行ELISA 檢測(cè)，每份樣品重復(fù)4 孔，考察該方法的批內(nèi)重復(fù)性；另以5個(gè)批次純化的重組ASFV P30 蛋白包被酶標(biāo)板，分別對(duì)ASFV 強(qiáng)陽(yáng)性、陽(yáng)性、陰性血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，考察該方法的批間重復(fù)性。

1.11 已知樣本檢測(cè)比較

分別用重組ASFV P30 蛋白iELISA 與重組ASFV P30-2His6 蛋白iELISA 兩種檢測(cè)方法，對(duì)已經(jīng)檢測(cè)確認(rèn)的陽(yáng)性和陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估這兩種方法與臨床樣本的吻合度。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 自帶程序統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 ASFV P30 蛋白編碼基因擴(kuò)增

以pET-28a-ASFV P30-2His6 為模板，用前述引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果如圖1 所示。平行的2個(gè)陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物（a、b）大小均為500～750 bp，與設(shè)計(jì)的擴(kuò)增基因大小吻合。

圖1 ASFV P30 蛋白編碼基因擴(kuò)增結(jié)果

2.2 重組ASFV P30 蛋白表達(dá)

將誘導(dǎo)表達(dá)后的重組ASFV P30 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 檢測(cè)。由電泳結(jié)果（圖2）可見(jiàn)，去掉組氨酸標(biāo)簽的重組ASFV P30 蛋白相對(duì)分子質(zhì)量略小于35 ku，而表達(dá)蛋白的全菌液和全菌液離心后的上清液蛋白量相當(dāng)，表明該蛋白的原核表達(dá)為可溶性表達(dá)。

圖2 E.coli BL21（DE3）/pET-28a-ASFV P30 表達(dá)結(jié)果

2.3 重組蛋白純化

將純化后的重組ASFV P30 蛋白和重組ASFV P30-2His6 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。伯樂(lè)凝膠成像儀灰度掃描結(jié)果（圖3）顯示，純化后的重組ASFV P30 蛋白純度約為95%，純化后的重組ASFV P30-2His6 蛋白純度約為98%?？梢?jiàn)，經(jīng)過(guò)Sepharose 300 凝膠過(guò)濾層析和DEAE Sepharose Fast Flow 陰離子交換層析后的重組ASFV P30 蛋白純度仍稍低于采用Ni-NTA 親和層析純化的重組ASFV P30-2His6 蛋白，重組ASFV P30-2His6 蛋白相對(duì)分子質(zhì)量稍大于35 ku。

2.4 重組蛋白Western-blot 分析

Western-blot 分析結(jié)果（圖4）顯示，重組ASFV P30 蛋白的雜交帶小于35 ku，而重組ASFV P30-2His6 蛋白的雜交帶大于35 ku，與預(yù)期相符，且雜交條帶均清晰，表明兩種重組蛋白都具有較好的免疫反應(yīng)性。

圖3 純化重組蛋白SDS-PAGE 分析結(jié)果

圖4 重組蛋白Western-blot 分析結(jié)果

2.5 最佳反應(yīng)條件設(shè)定

按照1.6 棋盤(pán)滴定法的檢測(cè)結(jié)果（表1），結(jié)合設(shè)定的優(yōu)選原則，即陽(yáng)性血清OD450≈1.0，陰性血清OD450≤0.1，陽(yáng)性血清和陰性血清的ELISA檢測(cè)OD450比值（P/N）最高；選定抗原包被濃度20 μg/mL，血清稀釋比例1:1 000，酶標(biāo)第二抗體工作濃度1:40 000。此時(shí)臨床陽(yáng)性血清的P/N值最大（19.58），陽(yáng)性血清的OD450值在1.0 附近。

iELISA 的封閉液優(yōu)選結(jié)果（圖5）顯示，當(dāng)封閉液選擇5%脫脂奶粉時(shí)，P/N值（13.06）最大且陽(yáng)性血清OD450在1.0 附近。

表1 4 組抗原不同血清稀釋度的光密度值（OD450）

圖5 最佳封閉液確定結(jié)果

2.6 陽(yáng)性臨界值確定

陽(yáng)性臨界值確定結(jié)果（圖6）顯示，70 份ASFV 臨床陰性樣品的平均OD450值為0.104，標(biāo)準(zhǔn)差為0.024，陽(yáng)性臨界值=平均值+5×標(biāo)準(zhǔn)差，為0.22。因此，當(dāng)待檢血清樣品的OD450＞0.22 時(shí)，判定為ASFV 抗體陽(yáng)性，OD450≤0.22 時(shí)，判定為抗體陰性。

2.7 特異性試驗(yàn)

圖6 iELISA 臨界值確定結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果（圖7）顯示，僅ASFV 陽(yáng)性血清的檢測(cè)結(jié)果OD450值高于0.22，為陽(yáng)性，而PPV、PRRSV、FMDV、SVA、PCV2 和PCV3 的陽(yáng)性血清檢測(cè)的OD450值均低于0.22，即為陰性，表明該檢測(cè)方法具有良好的特異性。

2.8 靈敏性試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果（圖8）顯示，對(duì)ASFV 臨床陽(yáng)性血清作1:800、1:1 600、1:3 200、1:6 400 稀釋?zhuān)?dāng)稀釋至1:3 200 時(shí)，OD450=0.352（＞0.22），表明該方法對(duì)1:3 200 稀釋的ASFV 陽(yáng)性血清仍可檢測(cè)出陽(yáng)性。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果（表2）顯示，4 份豬血清樣品批內(nèi)4 次重復(fù)檢測(cè)和3 份血清5 批次間重復(fù)檢測(cè)的OD450值變異系數(shù)均低于10%，表明該ELISA 方法具有良好的重復(fù)性。

圖7 特異性試驗(yàn)結(jié)果

圖8 靈敏性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

表2 重復(fù)性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

2.10 臨床樣品檢測(cè)比較

用ASFV P30 和ASFV P30-2His6 分別作為抗原構(gòu)建的iELISA 檢測(cè)方法，檢測(cè)已確認(rèn)的15 份ASFV 臨床陽(yáng)性血清（表3）和40 份ASFV 陰性血清（表4）。結(jié)果顯示，這2 種檢測(cè)方法對(duì)陽(yáng)性血清的判斷完全相同。而在對(duì)陰性血清，用ASFV P30-2His6 為包被抗原的iELISA 檢測(cè)，有27 份出現(xiàn)了弱陽(yáng)性或可疑的檢測(cè)結(jié)果，只有13 份為陰性，符合率為32.5%（13/40）；ASFV P30 為包被抗原的iELISA 檢測(cè)，結(jié)果全為陰性，符合率為100%（40/40）。

表3 兩種重組蛋白構(gòu)建的iELISA 檢測(cè)方法臨床陽(yáng)性樣本檢測(cè)結(jié)果比較

3 討論

在ELISA 檢測(cè)中，使用重組蛋白作為抗原與從感染細(xì)胞提取物中提取抗原相比具有許多優(yōu)點(diǎn)。這些重組抗原的來(lái)源簡(jiǎn)單，消除了細(xì)胞化合物污染抗原所產(chǎn)生的假陽(yáng)性反應(yīng)，避免了在抗原生產(chǎn)中使用活病毒，并允許在抗原生產(chǎn)中實(shí)現(xiàn)更好的標(biāo)準(zhǔn)化[11]?；蚬こ躺a(chǎn)重組蛋白，根據(jù)表達(dá)載體不同主要分為原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)，其中原核表達(dá)系統(tǒng)因其具有背景清楚、操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛運(yùn)用于實(shí)際生產(chǎn)中[12]。

表4 兩種重組蛋白構(gòu)建的iELISA 檢測(cè)方法臨床陰性樣本檢測(cè)結(jié)果比較

ASFV 能夠持續(xù)存在于自然宿主和感染后康復(fù)的家豬體內(nèi)，呈現(xiàn)較低毒力，表明該病毒具有有效機(jī)制來(lái)逃避宿主防御系統(tǒng)[13-14]。因此，在缺少有效疫苗的條件下，只能通過(guò)撲殺的方式來(lái)控制ASF的蔓延[15]，因此早發(fā)現(xiàn)早處理顯得尤為重要。能用于ASFV 抗體檢測(cè)的抗原蛋白可有多種，其中P30、P72 和P54 結(jié)構(gòu)蛋白具有較好的診斷意義。ASFV P72 結(jié)構(gòu)蛋白是病毒衣殼的主要成分，也是目前研究最多的診斷靶標(biāo)。Tabares 等[16]就以P72蛋白作為包被抗原成功建立了抗體檢測(cè)試劑盒。該蛋白在病毒感染晚期表達(dá)，免疫原性好、保守性強(qiáng)[17]。ASFV P54 蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性，是Western-blot 診斷疫病時(shí)最令人關(guān)注的病毒蛋白之一[18-19]。ASFV P54 主要含有線性表位，而P30 主要含有構(gòu)象表位。因此，這些蛋白表位結(jié)構(gòu)的差異可以解釋ELISA 和Western-blot 中發(fā)現(xiàn)的P30 和P54 反應(yīng)性的不同[20]。相比于P72 和P54 蛋白，建立ASFV P30 iELISA 檢測(cè)方法可以早期檢測(cè)和處理感染[21]。

本研究在ASFV P30-2His6 的基礎(chǔ)上，利用基因工程原理設(shè)計(jì)引物去除His 標(biāo)簽，構(gòu)建了以pET-28a（+）為表達(dá)載體的ASFV P30 蛋白表達(dá)工程菌。相比較于用酶切蛋白去除His 標(biāo)簽[22]，本研究建立的方法在去除His 標(biāo)簽的同時(shí)不影響蛋白的其他性狀，使ASFV P30 蛋白的表達(dá)量高，水溶性好，因而有利于規(guī)?；a(chǎn)。與吳競(jìng)等[23]利用pET-32a（+）載體成功表達(dá)帶有His 標(biāo)簽的包涵體ASFV P30 蛋白建立的iELISA 檢測(cè)方法相比，本研究表達(dá)的P30 蛋白是水溶性的無(wú)標(biāo)簽蛋白，在臨床應(yīng)用上更有優(yōu)勢(shì)，可以消除帶組氨酸標(biāo)簽的基因工程疫苗免疫豬造成的假陽(yáng)性。去掉His 標(biāo)簽后不能用親和層析的方法來(lái)純化，只能選擇凝膠過(guò)濾層析和陰離子交換柱等方法進(jìn)行純化，因此純化難度相對(duì)較高[24]。本研究將純化后的蛋白經(jīng)過(guò)SDSPAGE 分析和灰度掃描，發(fā)現(xiàn)純化后的重組ASFV P30 蛋白純度為95%，而用鎳柱純化的重組ASFV P30-2His6 純度為98%，可見(jiàn)鎳柱的純化效率更高。但是iELISA 檢測(cè)結(jié)果明確表明，盡管ASFV P30純度稍低，然而不僅沒(méi)有影響檢測(cè)的準(zhǔn)確率，而且由于去除了His 標(biāo)簽，消除了假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果，極大提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性。在對(duì)40 份背景清晰的陰性血清檢測(cè)過(guò)程中，用ASFV P30-2His6為包被抗原的iELISA 檢測(cè)時(shí)，有27 份血清檢測(cè)結(jié)果為弱陽(yáng)性或可疑，只有13 份為陰性，而用ASFV P30 為包被抗原的iELISA 檢測(cè)時(shí)，40 份血清均為陰性。進(jìn)一步比對(duì)分析這40 份陰性血清來(lái)源，發(fā)現(xiàn)這27 份檢測(cè)結(jié)果為弱陽(yáng)性或可疑的血清，均來(lái)自至少免疫過(guò)帶His 標(biāo)簽亞單位疫苗2 次的豬場(chǎng)，13 份檢測(cè)結(jié)果為陰性的血清，均來(lái)自沒(méi)有免疫過(guò)帶His 標(biāo)簽亞單位疫苗的豬場(chǎng)。

對(duì)于該檢測(cè)方法的陽(yáng)性臨界值確定，單純以O(shè)D450值作為判斷依據(jù)無(wú)法完全避免批次間或批次內(nèi)不同時(shí)間段檢測(cè)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。陰性血清用不同批次的試劑盒或用同一批次試劑盒在不同時(shí)間段檢測(cè)的數(shù)據(jù)都有小幅波動(dòng)，其變異系數(shù)（CV）為5%～10%。引入一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性（S/P，樣本OD450/標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性O(shè)D450）或標(biāo)準(zhǔn)陰性（S/N，樣品OD450/陰性O(shè)D450），可以最大限度消除這種差異對(duì)結(jié)果判斷的影響。而S/N值的可靠性和穩(wěn)定性更好。

國(guó)際上公認(rèn)ELISAS/N≥2.1 為抗體陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。而P30 蛋白檢測(cè)ASFV 抗體的靈敏性非常高，為了降低假陽(yáng)性出現(xiàn)的概率而將S/N的閾值定為2.5，當(dāng)待檢血清樣品的S/N≥2.5 時(shí)判定為ASFV抗體陽(yáng)性（+），2.5 ＞S/N≥2.0 判斷為可疑（±），S/N＜2.0 判斷為陰性（－）。因此，本研究?jī)H在特異性、靈敏性、重復(fù)性試驗(yàn)中單獨(dú)使用OD450值作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，而臨床樣品檢測(cè)均同時(shí)列出OD450值和S/N值。

綜上所述，本研究建立了一種針對(duì)ASFV P30 蛋白的iELISA 檢測(cè)方法。該方法可用于檢測(cè)ASFV 的早期感染，具有較好的特異性、靈敏性和可重復(fù)性，同時(shí)還可以消除帶有His 標(biāo)簽的基因工程疫苗免疫后所造成的假陽(yáng)性反應(yīng)，是一種有效的ASFV 檢測(cè)方法。