楊云禮，徐 明，鄒 曉，陳 進(jìn)，張 姣，張 健

(貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院真菌資源研究所，貴州 貴陽 550025)

土壤微生物作為陸地生態(tài)系統(tǒng)的重要組分，與植物及土壤養(yǎng)分形成植物—土壤微生物—土壤養(yǎng)分模式驅(qū)動生態(tài)系統(tǒng)能量流動與物質(zhì)循環(huán)[1]，維持生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定性。細(xì)菌是土壤微生物中含量最多、豐富度最高、分布最廣的類群[2-3]，在促進(jìn)植物生長、影響群落演替等方面發(fā)揮著重要作用，如假單胞菌 (Pseudomonas)、芽孢桿菌(Bacillus)和農(nóng)桿菌(Agrobacterium)可產(chǎn)生植物激素或分子信號、競爭生長位點(diǎn)、載體蛋白等促生長機(jī)制促進(jìn)植物生長，增強(qiáng)對病原菌的抗性[4-5]。由于土壤細(xì)菌生命活動所需碳源主要依賴于地上植被的凋落物及根系分泌物[6-7]，因此植被可直接影響土壤微生物活性和多樣性特征[8]，與土壤細(xì)菌群落形成相互作用的反饋體系[9]。大量研究表明，植被類型是影響土壤微生物群落代謝活性、碳源利用率、微生物生物量的驅(qū)動因子，隨著群落演替的進(jìn)程土壤微生物種群數(shù)量逐漸增加，碳源利用率也不斷增加[10]；與荒地對比，不同植被類型土壤微生物代謝速率可增加6.45%～93.33%[11]。同時，土壤細(xì)菌群落作為土地利用變化的敏感性指標(biāo)，地上植被的變化必然影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性分布格局[12]。

貴州省森林資源豐富，植被類型多樣[13]。但由于貴州高原地處我國西南云貴高原東部，受季風(fēng)影響顯著，旱澇災(zāi)害頻發(fā)，森林植被常受到不同程度的干擾[14]。同時，隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及自然資源開發(fā)的大力推進(jìn)，植被類型轉(zhuǎn)變顯著。地上植被類型改變對土壤養(yǎng)分以及細(xì)菌群落產(chǎn)生深刻影響[15]。研究表明，黔中地區(qū)植被類型的改變對氣候、生態(tài)環(huán)境及社會經(jīng)濟(jì)等方面具有顯著影響。在不同植被類型下植被對空氣顆粒物具有不同程度的消減作用[16]；馬尾松林可降低光照強(qiáng)度、光通量密度、氣溫等小氣候特征指標(biāo)[17]；此外，在我國南方的經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)，大量不科學(xué)不合理的農(nóng)耕活動導(dǎo)致森林資源嚴(yán)重破壞，進(jìn)一步影響社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展[18]。在地下土壤微環(huán)境中，不同植被演替階段土壤真核微生物群落結(jié)構(gòu)也存在差異[19-20]，而植被對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性特征等方面的影響尚不清楚。

貴州省是我國典型喀斯特山地高原區(qū)，廣泛分布的石灰?guī)r及熔巖土壤影響植被發(fā)育，使得植被分布錯綜復(fù)雜，通常呈垂直地帶性分布，主要包括常綠闊葉林、針葉林、針闊混交林及灌草叢等。該研究選取黔中山地丘陵區(qū)森林群落演替中3種典型植被類型為研究對象，通過高通量測序平臺分析不同植被類型土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性特征，探究土壤細(xì)菌群落對森林演替過程的影響，同時探索影響土壤細(xì)菌群落多樣性的環(huán)境因子，以期進(jìn)一步闡明不同植被類型土壤細(xì)菌的分布特征，為黔中地區(qū)森林的提質(zhì)增效、科學(xué)管理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于貴州省黔南布依族苗族自治州長順縣廣順農(nóng)場，地勢呈北高南低，屬黔中腹地典型山地丘陵地貌區(qū)，地理坐標(biāo)為25°38′～26°17′ N，106°12′～106°38′ E，屬中亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候區(qū)，雨熱同期，年平均氣溫為13.5～18.5 ℃，年平均降水量為670 mm，相對濕度為81%，年無霜期200 d以上，土壤類型以黃壤為主。

1.2 樣地設(shè)置及樣品采集

通過野外實(shí)地踏查及調(diào)研，選取處于早期草本與灌木的過度階段的灌草叢、演替中期階段的馬尾松針葉林及演替頂級階段的闊葉林3種植被類型樣地(表1)。設(shè)置20 m×20 m調(diào)查樣方，記錄調(diào)查樣方內(nèi)的植物群落的物種名、株數(shù)、高度和蓋度及海拔、坡度、坡向、坡位等信息。利用土鉆按6點(diǎn)取樣法隨機(jī)采集0～20 cm土層的混合土壤樣品，去除石塊和植物根系等雜物后，充分混合均勻后過2 mm孔徑土篩，重新分成2份，一份裝入無菌密封袋中，保存于-80 ℃冰箱，用于高通量測序；另一份通風(fēng)處陰干后，分別過1和0.25 mm孔徑篩，常溫環(huán)境保存，用于土壤化學(xué)性質(zhì)測定。

表1 不同植被類型樣地基本信息Table 1 Basic information of different vegetation types

1.3 土壤細(xì)菌總DNA提取及PCR擴(kuò)增

土壤細(xì)菌測序過程主要由總DNA提取、16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增、純化、文庫構(gòu)建和上機(jī)測序組成。土壤總DNA提取采用omega M5635-02 DNA抽劑盒，從0.5 g土壤樣本中提取得到總DNA，用核酸純化儀進(jìn)行純化并檢測其濃度；采用PCR通用引物338F(5′-A￣C￣T￣C￣C￣T￣A￣C￣G￣G￣G￣A￣G￣G￣C￣A￣G￣C￣A￣C-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對細(xì)菌16S rDNA V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：5×FastPfu buffer 4.0 μL，dNTPs (2.5 mmol·L-1)2.0 μL，正、反向引物(5 μmol·L-1)各0.8 μL，F(xiàn)astPfu polymerase (2.5 U·μL-1) 0.4 μL，BSA 0.2 μL，模板DNA 10 ng，補(bǔ)充ddH2O至20 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，25個循環(huán)；72 ℃ 10 min；10 ℃ 保存。隨后進(jìn)行MiSeq文庫構(gòu)建及Illumina上機(jī)測序。測序由武漢菲沙基因信息有限公司完成。

1.4 土壤理化指標(biāo)的測定

依據(jù)LY/T 1228—2015《中華人民共和國林業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》，土壤容重(BD)采用環(huán)刀法測定，土壤有機(jī)質(zhì)(SOM)含量測定采用重鉻酸鉀氧化-分光光度法；土壤全氮(TN)含量測定采用半微量凱氏定氮法；土壤全磷(TP)含量測定采用鉬銻抗比色法；土壤有效磷(AP)含量測定采用雙酸浸提-鉬銻抗比色法；土壤pH值采用浸提電位法(土水質(zhì)量比1∶2.5)測定。

1.5 數(shù)據(jù)分析及方法描述

基于QIIME分析平臺對于測序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾，以97%的一致性(identity)進(jìn)行OTUs(operational taxonomic units)聚類，使用RDP數(shù)據(jù)庫對OTUs的有效序列(clean reads)進(jìn)行物種注釋。利用Mothur軟件計算樣品的α多樣性指數(shù)，通過UniFrac算法利用系統(tǒng)進(jìn)化的信息來比較樣品間的物種群落差異，進(jìn)行β多樣性分析。采用Excel 2019及SPSS 22.0軟件進(jìn)行土壤理化性質(zhì)及細(xì)菌群落多樣性分析，采用Duncan法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。利用美吉生物云平臺進(jìn)行土壤細(xì)菌群落主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis，PCoA)及細(xì)菌群落與土壤環(huán)境因子的冗余分析(redundancy analysis，RDA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

對不同植被類型土壤理化性質(zhì)(圖1)進(jìn)行分析，結(jié)果表明3種植被類型土壤容重，pH值，有機(jī)質(zhì)、全磷、有效磷、全氮含量均存在差異。其中，土壤容重介于1.01～1.60 g·cm-3之間，闊葉林較灌草叢及針葉林更低，但無顯著差異(P>0.05)。3種植被類型土壤pH值差異顯著(P<0.05)，其中針葉林最低，屬強(qiáng)酸性土壤，其次是灌草叢，屬極強(qiáng)酸性土壤，闊葉林屬酸性土壤。說明不同的植被根系向土壤分泌的有機(jī)物化合物含量不同，從而影響土壤的酸堿度。闊葉林全氮含量最高，為0.61 mg·kg-1，顯著高于灌草叢和針葉林(P<0.05)。不同植被類型土壤有機(jī)質(zhì)含量變化范圍為14.73～18.25 g·kg-1，灌草叢最高，針葉林次之，闊葉林最低；針葉林土壤全磷和有效磷含量均低于灌草叢及闊葉林。但不同植被類型之間土壤有機(jī)質(zhì)及全磷含量差異均不顯著(P>0.05)。

2.2 土壤細(xì)菌群落的α多樣性

由表2可知，文庫平均覆蓋度均在0.98以上，表明該試驗(yàn)測序深度能較全面地反映測序樣品中的微生物信息。經(jīng)數(shù)據(jù)優(yōu)化后，此次測序共得到土壤細(xì)菌群落42門125綱297目509科1 021屬2 092 種，包含13 971個OTUs。不同植被類型土壤細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)如表2所示。土壤細(xì)菌群落的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分別為5.380～6.185和0.013～0.051。假定研究中灌草叢—針葉林—闊葉林代表著該地區(qū)植被正向演替序列[19]，可見隨著演替的進(jìn)行土壤細(xì)菌群落多樣性不斷發(fā)生變化，但不顯著(P>0.05)。ACE指數(shù)和Chao指數(shù)分別為2 020.116～2 811.629和2 065.801～2 869.422，不同植被類型下土壤細(xì)菌豐富度差異未達(dá)顯著水平(P>0.05)。

在OTU水平上繪制韋恩圖，結(jié)果如圖2所示。

灌草叢、針葉林、闊葉林共有1 768個OTUs(31.70%)，特有OTUs分別有739、490和857個，占比分別為13.25%、8.78%和15.36%。共有OTUs所表示的這些細(xì)菌類群的作用在植被恢復(fù)過程中貫穿始終，是該區(qū)域自然植被土壤的重要細(xì)菌類群，而特有OTUs可能與特定植被類型生境下的植被組成和物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程緊密相關(guān)[20]。

2.3 土壤細(xì)菌群落組成分析

不同植被類型土壤細(xì)菌在門、屬水平上的相對豐度如圖3所示。在門水平上，變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、黏菌門(Myxococcota)、綠彎菌門(Chloroflexi)、疣微菌門(Verrucomicrobiota)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadota)為土壤中的主要群落。其中變形菌門相對豐度占比最高(31.79%～52.96%)，其次為酸桿菌門(10.95%～23.85%)和放線菌門(70%～17.68%)，是土壤細(xì)菌群落中的優(yōu)勢菌群。整體上，變形菌門隨植被演替進(jìn)程呈現(xiàn)出豐度增加趨勢，而酸桿菌門反之。組間差異檢驗(yàn)結(jié)果(圖5)顯示，綠彎菌門及芽單胞菌門的相對豐度在3種植被土壤中差異顯著(P<0.05)。

屬水平上統(tǒng)計結(jié)果表明，不同植被類型土壤細(xì)菌群落以鞘脂桿菌屬(Sphingomonas)、鏈霉菌科(Streptomycetaceae)未定義屬、黃色桿菌科(Xanthobacteraceae)未定義屬、大豆根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、酸桿菌目(Acidobacteriales)未定義屬、苔蘚桿菌屬(Bryobacter)、Elsterales未定義屬、Chloroplast未定義屬為主。其中灌木叢、針葉林及闊葉林土壤鞘脂桿菌屬的相對豐度分別為1.99%、10.97%及22.27%?？傮w上，不同植被類型土壤中細(xì)菌群落相對豐度存在明顯差異，鞘脂桿菌屬豐度隨著演替的進(jìn)程呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。群落間物種組成同樣具有顯著差異(圖4)，綠灣菌門及芽單胞菌門在不同植被類型土壤細(xì)菌群落中的比例具有顯著差異。酸桿菌目未定義屬及Elsterales未定義屬在3種植被土壤中具有顯著差異(P<0.05)。

2.4 土壤細(xì)菌群落的相似性分析

采用主坐標(biāo)分析法對不同植被類型土壤細(xì)菌群落組成進(jìn)行排序(圖5)。結(jié)果顯示，軸1的貢獻(xiàn)率為30.59%，軸2的貢獻(xiàn)率為24.98%，累計貢獻(xiàn)率為55.57%。3種植被類型樣點(diǎn)間存在明顯分離。ANOSIM相似性分析結(jié)果顯示，3種植被類型土壤細(xì)菌群落組成存在顯著差異(P=0.016)。不同植被類型土壤細(xì)菌群落組間具有明顯的分離效應(yīng)。

2.5 土壤細(xì)菌群落的影響因子分析

土壤是細(xì)菌群落生長及繁殖的微環(huán)境，微環(huán)境的改變能在很大程度上影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性。為了分析環(huán)境因子對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的潛在影響，選取土壤環(huán)境因子如容重(BD)、pH值、有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、有效磷及多樣性指數(shù)，與細(xì)菌屬水平下的優(yōu)勢群落進(jìn)行冗余分析(圖6)。

圖6顯示，第1序軸和第2序軸的解釋變量分別為64.66%和13.66%，累積解釋變量達(dá)78.32%，表明前2個軸的貢獻(xiàn)值能很好地解釋各因子對細(xì)菌群落的影響。灌草叢土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤容重，有機(jī)質(zhì)、全磷、有效磷含量呈正相關(guān)，與土壤pH值、全氮含量呈負(fù)相關(guān)。針葉林土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤容重呈正相關(guān)，與土壤pH值，有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、有效磷含量呈負(fù)相關(guān)。闊葉林土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤容重呈負(fù)相關(guān)，與土壤pH值，有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、有效磷含量呈正相關(guān)。環(huán)境因子中土壤有效磷(R2=0.582 5，P=0.003)、全磷(R2=0.971 0，P=0.001)含量對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有極顯著影響，土壤容重(R2=0.727 3，P=0.027)對不同植被類型的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響；且經(jīng)Mantel Test檢驗(yàn)達(dá)顯著水平(R2=0.857 0，P=0.002)。說明土壤全磷、有效磷含量及容重是影響不同植被類型土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子。

3 討論

3.1 不同植被類型對土壤細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)的影響

筆者研究發(fā)現(xiàn)，黔中地區(qū)3種植被類型土壤理化性質(zhì)、細(xì)菌群落多樣性、群落組成及結(jié)構(gòu)均存在差異，這可能是由于不同植被類型下植物物種組成、凋落物分解速率及根系分泌物存在差異所致[21-22]。不同植被類型土壤細(xì)菌群落多樣性具有顯著差異，其中灌草叢顯著高于針葉林和闊葉林，這可能是由于灌草階段尚處于植被演替的過渡階段，該生境下土壤酶活性高、土壤物質(zhì)轉(zhuǎn)化快以及微生物量周轉(zhuǎn)率高，有利于維持較高的土壤微生物多樣性[23]。該區(qū)土壤細(xì)菌優(yōu)勢菌群為變形桿菌門、酸桿菌門、放線菌門，與前人研究結(jié)果一致[24]。研究發(fā)現(xiàn)這3種細(xì)菌類群在分解有機(jī)質(zhì)，促進(jìn)土壤碳、氮和硫循環(huán)中起著重要作用[25]，這決定了其在土壤微生物群落中的優(yōu)勢地位。整體上，變形菌門隨植被演替進(jìn)程呈現(xiàn)出豐度增加趨勢，酸桿菌門也逐漸增加。張曉等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在遼東櫟林自然恢復(fù)過程中，隨演替階段進(jìn)行，變形菌門和綠彎菌門的相對豐度逐漸增加，而放線菌門和酸桿菌門的相對豐度逐漸降低，筆者研究結(jié)果與其相似。已有研究認(rèn)為，這種變化趨勢還可能會導(dǎo)致其調(diào)控的生態(tài)學(xué)功能發(fā)生改變[27]。PCoA分析結(jié)果表明，灌木叢、針葉林、闊葉林土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有顯著差異(P<0.05)，進(jìn)一步說明植被類型在一定程度上可影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性。

3.2 土壤細(xì)菌群落的影響因子分析

植被通過影響土壤理化性質(zhì)間接影響微生物的組成和結(jié)構(gòu)。探討不同植被類型下環(huán)境因子如何影響土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)組成和分布格局，是探究土壤細(xì)菌群落多樣性變化機(jī)制的關(guān)鍵[28]。研究結(jié)果表明，隨著植被類型的改變，不同土壤理化指標(biāo)間差異明顯，土壤理化性質(zhì)是影響土壤微生物群落組成結(jié)構(gòu)的重要環(huán)境因子。冗余分析結(jié)果表明，土壤容重，pH值，有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、有效磷含量均對黔中地區(qū)土壤微生物群落有影響，其中土壤全磷、有效磷含量及容重是不同植被類型土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要影響因子，這些因子對驅(qū)動細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)變化起著重要的作用。研究表明，磷是植物生長必需的營養(yǎng)元素，能參與物質(zhì)、能量合成及細(xì)胞分裂，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[29]，不同植被類型下土壤磷的轉(zhuǎn)化速率與遷移程度具有明顯差異，由此土壤磷含量常成為土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能多樣性的決定性條件[30]。研究區(qū)地處典型喀斯特區(qū)，地勢復(fù)雜、水熱條件差、物質(zhì)循環(huán)速率慢是該區(qū)域的特點(diǎn)，由此磷元素含量成為限制土壤微生物的主要因素之一。蔡進(jìn)軍等[31]研究表明，土壤速效磷、速效氮、全氮、有機(jī)質(zhì)含量對黃土丘陵區(qū)土壤微生物功能多樣性有顯著影響。丁新景等[32]在研究人工林根際土壤微生物時，同樣發(fā)現(xiàn)土壤有效磷、速效鉀、堿解氮含量及電導(dǎo)率是細(xì)菌結(jié)構(gòu)和多樣性的主要影響因素，筆者研究也得到類似結(jié)果。劉紅巖[33]研究發(fā)現(xiàn)，植被群落多樣性與土壤容重呈負(fù)相關(guān)。筆者研究中闊葉林土壤容重低于灌草叢及針葉林，其原因可能是闊葉林土壤表層積累了更多的凋落物，使土壤容重降低，可見表層土壤容重作為土壤生境的重要物理指標(biāo)，能對土壤細(xì)菌群落的多樣性產(chǎn)生重要影響。

4 結(jié)論

黔中山地丘陵區(qū)不同植被類型間土壤養(yǎng)分含量存在顯著差異(P<0.05)；不同植被類型土壤細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)差異明顯(P<0.05)，土壤全磷、有效磷含量及容重是影響土壤細(xì)菌群落的重要環(huán)境因子；黔中山地丘陵區(qū)不同植被類型對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性分異作用顯著。