黃魯眾 蔣中秀 趙志光

小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）約占肺癌的13%～15%，確診時只有不足1/5屬于局限期，大部分已錯過手術(shù)時機(jī)[1-2]。SCLC患者雖然對放化療較敏感，但總體生存期仍較短。近年來，隨著靶向治療和免疫治療的出現(xiàn)，SCLC患者的生存期得到明顯延長[3-4]。但SCLC的治療水平并未取得突破性進(jìn)展，對其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制等尚不明確，有關(guān)其復(fù)發(fā)、預(yù)后評估的有效指標(biāo)也較少。本研究應(yīng)用免疫組化SP法檢測128例局限期SCLC患者的癌組織和其中50例患者的癌旁肺組織中p65、p16的表達(dá)情況，并進(jìn)行相關(guān)性分析和預(yù)后分析，以探討p65和p16在局限期SCLC中的臨床意義。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2010年1月至2018年12月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院經(jīng)病理確診的128例局限期SCLC患者的癌組織標(biāo)本，患者中男87例，女41例；年齡 33～74（56.60±11.08）歲，其中≤40歲 16例，＞40歲～≤60歲87例，＞60歲25例；腫瘤部位：左側(cè)64例，右側(cè)64例；腫瘤最大徑：≤3 cm 27例，＞3.0 cm～≤7.0 cm 90例，＞7.0 cm 11例；淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移72例，無轉(zhuǎn)移56例；術(shù)前血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuronspecific enolase，NSE）水平升高77例，正常51例。并將其中50例患者的癌旁肺組織作為對照。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）有明確的病理診斷；（2）局限期指病變局限于一側(cè)胸腔且能被納入一個放射治療野，經(jīng)胸部CT、腹部CT、腦MRI等確定；（3）患者行根治性手術(shù)，術(shù)前未行抗腫瘤治療，術(shù)后予化放療等輔助治療；（4）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）除外混合腺癌、鱗癌等其他惡性成分的患者；（2）排除隨訪時間不足6個月失訪的患者。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過，所有患者均知情同意。

1.2 SCLC癌組織與癌旁肺組織中p65、p16表達(dá)檢測 采用免疫組化SP法。標(biāo)本經(jīng)固定、脫水、透明、包埋等制成石蠟切片，切片厚度為4 μm。脫蠟水化，滴加3% H2O2，室溫孵育1 h，滴加檸檬酸液加熱修復(fù)8 min后冷卻至室溫，滴加非免疫血清封閉3.5 h；滴加p65、p16抗體（分別按 1∶500、1∶200稀釋）后 4 °C 冰箱過夜；滴加二抗室溫孵育1 h，滴加辣根酶標(biāo)記鏈卵白素液室溫孵育1 h，滴加DAB試劑顯色，放入蘇木素復(fù)染，脫水透明封片。

1.3 免疫組化結(jié)果判定 p65陽性定位于細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)染色視為陰性；p16陽性定位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)。由2位病理科醫(yī)生雙盲閱片，隨機(jī)選取5個包含癌組織的高倍視野，得出：（1）陽性細(xì)胞百分比：0%～10%為0分，11%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分；（2）染色強(qiáng)度：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分?？偡?陽性細(xì)胞百分比評分×染色強(qiáng)度評分，總分＜3分為陰性，總分≥3分為陽性。

1.4 臨床資料收集 主要包括患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和術(shù)前血清NSE水平等。采用住院（門診）觀察、電話聯(lián)系等形式隨訪，隨訪截止時間為2020年12月。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料組間比較采用x2檢驗(yàn)；SCLC癌組織中p65與p16表達(dá)的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)；預(yù)后分析應(yīng)用Kaplan-Meier曲線，生存率比較應(yīng)用log-rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SCLC癌組織與癌旁肺組織中p65、p16表達(dá)的比較 SCLC癌組織中p65陽性表達(dá)率為56.3%（72/128），明顯高于癌旁肺組織的8.0%（4/50），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（x2=34.212，P＜0.01）；SCLC癌組織中p16陽性表達(dá)率為35.2%（45/128），明顯低于癌旁肺組織的70.0%（35/50），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（x2=17.641，P＜0.01）。免疫組化結(jié)果見圖1。

圖1 小細(xì)胞肺癌（SCLC）癌組織與癌旁肺組織中p65、p16的表達(dá)（a：SCLC癌組織中p65表達(dá)呈陽性；b：癌旁肺組織中p65表達(dá)呈陰性；c：SCLC癌組織中p16表達(dá)呈陰性；d：癌旁肺組織中p16表達(dá)呈陽性；免疫組化SP法，×200）

2.2 SCLC癌組織中p65與p16表達(dá)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示SCLC癌組織中p65與p16表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.406，P＜0.01），見表 1。

表1 SCLC癌組織中p65與p16表達(dá)的相關(guān)性（例）

2.3 SCLC癌組織中p65、p16陽性表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 SCLC癌組織中p65陽性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和術(shù)前血清NSE水平均有關(guān)（均P＜0.05），而與患者性別、年齡、腫瘤部位和腫瘤最大徑均無關(guān)（均P＞0.05）。SCLC癌組織中p16陽性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），而與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤最大徑和術(shù)前血清NSE水平均無關(guān)（均P＞0.05），見表2。

表2 SCLC癌組織中p65、p16陽性表達(dá)與臨床特征的關(guān)系（例）

2.4 SCLC癌組織中p65、p16陽性表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 128例SCLC患者中有9例失訪，最終納入119例患者進(jìn)行預(yù)后分析。隨訪截止時，死亡107例，存活12例。患者總體中位生存期為20.3個月，1年和2年生存率分別為85.6%和37.6%，見圖2a。p65陽性表達(dá)患者的總體中位生存期為18.9個月，明顯短于p65陰性表達(dá)患者的 21.8個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（x2=7.695，P=0.006），見圖2b。p16陽性和陰性表達(dá)患者的總體中位生存期分別為21.3和19.8個月，兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（x2=3.228，P=0.072），見圖 2c。

圖2 小細(xì)胞肺癌（SCLC）癌組織中p65、p16陽性表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系（a：SCLC患者總體生存期；b：p65的表達(dá)水平與SCLC患者預(yù)后的關(guān)系；c：p16的表達(dá)水平與SCLC患者預(yù)后的關(guān)系）

3 討論

SCLC惡性程度高，較早發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，中位生存期短。近30多年來，其治療水平基本處于平臺期，初診時的分期、規(guī)范的治療是治療的關(guān)鍵[5-6]。對于可行手術(shù)的局限期SCLC患者，術(shù)后化療或同步化放療可以控制腫瘤的生長，但其無進(jìn)展生存期和總體生存期仍較短[1]。

本研究顯示，SCLC患者p65表達(dá)上調(diào)，p16表達(dá)下調(diào)，可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮一定的作用。同時，SCLC癌組織中p65與p16表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示兩者相關(guān)的通路可能存在一定的關(guān)聯(lián)。p65是NF-κB家族中含量最豐富、功能最重要的成員。其作用于腫瘤的機(jī)制主要包括：（1）激活細(xì)胞周期蛋白 D1（CycinD1），促進(jìn)細(xì)胞無限生長[7-8]；（2）參與血管生成以及腫瘤微環(huán)境的形成，為腫瘤生長提供能量；（3）產(chǎn)生氧自由基造成DNA損傷[8]等。p16基因是最早發(fā)現(xiàn)的直接參與調(diào)控細(xì)胞周期的腫瘤抑制基因[9-10]，其表達(dá)產(chǎn)物p16INK4A與CDK4/6特異性結(jié)合，阻礙其與CycinD1形成復(fù)合物，以致細(xì)胞停留在G1期，無法進(jìn)入S期[10-11]。當(dāng)p16基因突變或失活時，細(xì)胞周期失去調(diào)控，導(dǎo)致細(xì)胞無限生長。

SCLC分期大多應(yīng)用美國退伍軍人醫(yī)院研究小組制定的標(biāo)準(zhǔn)，TNM分期一般用于術(shù)前疾病評估[12]。局限期SCLC的術(shù)前TNM分期主要與腫瘤最大徑和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。腫瘤最大徑與腫瘤的增殖水平有關(guān)。隨著醫(yī)療水平的進(jìn)步以及患者對肺癌的認(rèn)知水平和重視水平的提高，大多數(shù)患者會定期體檢，所以就診時，腫瘤體積不會過大。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與腫瘤的遷移水平有關(guān)。本研究得出在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的SCLC患者中，p65上調(diào)，p16下調(diào)。p65基因可直接作用于瘤細(xì)胞惡性表型相關(guān)基因，以及激活Snail轉(zhuǎn)錄因子，從而誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，以獲得更強(qiáng)的遷移能力[13]；而p16基因失活，可上調(diào)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（SDF-1）和基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）的表達(dá)[14]，同樣可以促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。血清NSE是臨床檢測SCLC的首選腫瘤標(biāo)志物，可用于疾病的進(jìn)展與預(yù)后評估[15-16]。本研究中，p65的表達(dá)水平與術(shù)前血清NSE水平有關(guān)，提示p65基因的激活，可能促進(jìn)神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞分泌NSE。

國內(nèi)外關(guān)于p65與SCLC患者的預(yù)后研究不多，更多的預(yù)后研究是關(guān)于非小細(xì)胞肺癌。Lin等[17]研究顯示，p65和p-p105共同陽性表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后不良有關(guān)，而p65的單獨(dú)陽性表達(dá)與其無明顯相關(guān)性。郭子君等[18]的一項(xiàng)關(guān)于SCLC的研究，得出p65陰性表達(dá)患者預(yù)后更好，與本研究結(jié)果一致。國內(nèi)外關(guān)于p16與SCLC的研究主要是表達(dá)水平的變化，而有關(guān)預(yù)后生存的研究暫無報道。p16缺失突變包括純合缺失和雜合缺失，在雜合缺失突變中是可以正常表達(dá)p16蛋白[14]，因此在蛋白水平研究p16基因突變與預(yù)后關(guān)系不如基因水平研究更嚴(yán)謹(jǐn)。

綜上所述，p65、p16可能在SCLC患者的發(fā)生和發(fā)展中起一定作用；同時，p65也可能對SCLC患者的預(yù)后有一定的指導(dǎo)意義。